本發(fā)明涉及一種水稻抗齒葉矮化病鑒定方法，屬于農(nóng)業(yè)科學技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水稻是禾本科稻屬—年生的植物，是中國最主要的糧食作物，年種植面積約占糧食作物種植面積的1/3，稻谷總產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的45%。稻谷年均總產(chǎn)量為全世界第一，由于受水稻病害的影響，每年造成全世界水稻產(chǎn)量損失達到10%～15%，并且嚴重損害稻米的品質(zhì)。

水稻齒葉矮化病是由褐飛虱傳播的病毒病，其病原為水稻齒葉矮化病毒（Rice ragged stunt dwarf virus，RRSV），也稱水稻齒葉矮縮病。水稻齒葉矮化病于1976年在印度尼西亞和1977年在菲律賓被發(fā)現(xiàn)，隨后在日本、印度等幾個國家也被出現(xiàn)，最后演變成了世界各個稻區(qū)常見的水稻病毒病。在我國水稻齒葉矮化病是由福建農(nóng)學院謝聯(lián)輝等人于1978年在福建沙縣首次發(fā)現(xiàn)的，此后在福建、廣東、臺灣、江西、湖南和浙江多個省份先后發(fā)生，但發(fā)病面積小，多屬個別稻區(qū)發(fā)病。水稻齒葉矮化病發(fā)病田塊一般減產(chǎn)10%～20%，嚴重的減產(chǎn)可達80%以上，甚至田塊絕收，給農(nóng)民經(jīng)濟造成重大損失，給國家糧食生產(chǎn)帶來巨大影響。水稻齒葉矮化病已經(jīng)成為水稻主要病害之一，引起了國家糧食生產(chǎn)部門的高度關(guān)注。

水稻齒葉矮化病毒病的癥狀主要表現(xiàn)為病株濃綠矮縮，分孽增多，葉尖旋卷，葉緣有鋸齒狀缺刻，葉鞘和葉片基部常有長短不一的線狀脈腫，長度達到0.1～0.85cm以上，多發(fā)生在葉片基部的葉鞘上，但亦有發(fā)生在葉片的基部。水稻齒葉矮化病的病害癥狀在不同生育期、不同水稻品種中表現(xiàn)不同。水稻在分蘗期前發(fā)病的，不能抽穗；后期發(fā)病的，抽穗不完全，谷粒不充實等癥狀，發(fā)病植株生長延遲，導致產(chǎn)量下降。在自然環(huán)境下，RRSV只侵染亞洲栽培稻、寬葉野生稻及泥瓦拉野生稻，但人工接種后，還可侵染大麥、小麥、看麥娘、燕麥、棒頭草、稗草、甘蔗、李氏禾、蟋蟀草、水蜈蚣和玉米等多種植物。

褐飛虱是水稻齒葉矮化病的唯一傳播介體，其傳毒方式是持久性增殖型，不經(jīng)卵傳播，也不能通過機械摩擦、土壤、花粉和種子傳播。褐飛風傳毒具有間歇性，蛻皮時介體仍可以傳毒。褐飛虱的若蟲蛻皮但不失毒，對稻苗的傳毒率為2.6%～42.1%，病毒在蟲體中的分布以唾液腺中含量最高。褐飛虱最短的獲毒時間為0.5h，獲毒率為2%；飼毒48h，獲毒率最高，可達42%；24.1℃條件下接種，循回期為5～23d，平均10.7d，通過循回期后能終生傳毒。褐飛虱若蟲比成蟲傳毒效率更高，長翅型和短翅型、雌蟲和雄蟲傳毒效率相同。水稻感染病毒后，需9～32d潛育期才顯癥狀，不同月份病毒潛育期不同，其長短與溫度高低有關(guān)，溫度高潛伏期會短。

防治水稻齒葉矮化病最傳統(tǒng)的方法是利用常用的化學農(nóng)藥殺蟲劑對傳毒介體進行防治。但是隨著這些殺蟲劑的使用年限增加，昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生了高抗藥性。此外，農(nóng)藥殺蟲劑一般都是高毒，高殘留的化學藥劑，會造成很嚴重的污染。因此控制水稻齒葉矮化病的發(fā)生應以作物為中心，以控害減損保產(chǎn)為目標，大力推廣應用綠色防控技術(shù)，降低化學農(nóng)藥用量，最大限度控制病蟲危害損失，杜絕使用高毒農(nóng)藥，保護稻米質(zhì)量安全和稻田生態(tài)環(huán)境。

選育和推廣水稻齒葉矮化病抗病品種是最經(jīng)濟也是最有效的防治方法。因地制宜選用水稻抗齒葉矮化病的水稻品種，淘汰抗性差、易感病品種，并加強抗病品種的鑒定和篩選，是預防水稻病害最有效、最經(jīng)濟、最簡便的措施。

篩選抗病資源應用于水稻齒葉矮化病抗病育種是首要環(huán)節(jié)，目前篩選水稻齒葉矮化病抗病品種、抗病基因定位均采用田間自然發(fā)病鑒定，待鑒定水稻以小區(qū)形式種植于大田，常規(guī)栽培管理，傳毒介體自然傳毒，顯病癥后調(diào)查待鑒定水稻的穴發(fā)病率，以此為標準鑒別水稻材料的齒葉矮化病抗感能力的差異。然而，不同水稻對褐飛虱排趨性的差異使其表現(xiàn)出對褐飛虱取食偏向的差異，通過自然鑒定方法鑒定得到的抗病水稻，可能實際上是抗蟲（排趨性強）水稻而并非抗病水稻。然而，假若以該抗蟲不抗病水稻育成品種進行病害區(qū)規(guī)模種植后，規(guī)模種植導致傳毒介體被迫選擇而使得假抗病表現(xiàn)消失，將可能給水稻生產(chǎn)帶來較大的損失。

為排除排趨性對抗病鑒定的影響，對水稻進行人工定量接種帶毒介體成為一種必然。然而，進行水稻品種資源的抗性鑒定需要大量的傳毒介體褐飛虱，褐飛虱人工飼養(yǎng)規(guī)模量小，飼養(yǎng)成本很高，難以滿足品種抗性鑒定的規(guī)模量的需求，限制了人工定量接種鑒定的推廣應用。

褐飛虱重災區(qū)大田生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)每年的褐飛虱數(shù)量均非常巨大，人工獲取也比較容易，而實驗室飼養(yǎng)褐飛虱用于品種資源抗性鑒定難以滿足規(guī)模量的要求，若能夠設(shè)計一種方法利用大田生態(tài)系統(tǒng)規(guī)模量的褐飛虱進行定量強化水稻接種鑒定從而實現(xiàn)對水稻品種資源的齒葉矮化病抗性評價將是一種可行的選擇。為實現(xiàn)對水稻品種資源的準確評價，需要實驗室提供作物昆蟲互作研究的穩(wěn)定而適宜的生態(tài)環(huán)境，模擬大田生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)褐飛虱與水稻的互作關(guān)系、利用大田生態(tài)系統(tǒng)解決規(guī)模褐飛虱的獲取難題、定量并強化水稻齒葉矮化病接種鑒定從而實現(xiàn)對水稻品種資源的準確評價正是本發(fā)明的根本思路。

利用本方法評價水稻品種對水稻齒葉矮化病的抗性水平，既可以去除排趨性對鑒定結(jié)果的干擾，又可以克服品種抗性鑒定所需褐飛虱規(guī)模量的難題，實現(xiàn)了定量而強化的水稻齒葉矮化病接種鑒定。這一鑒定方法除了可以應用于水稻品種資源的發(fā)掘鑒定、品種抗性評價、抗病品種選育外，亦可以應用于抗病基因定位的表型鑒定和抗性遺傳規(guī)律研究等眾多領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對水稻齒葉矮化病田間自然鑒定中存在的排趨性干擾難題和室內(nèi)人工接種鑒定的褐飛虱規(guī)模量獲取難題，提供一種水稻齒葉矮化病抗性的規(guī)?；臃N鑒定方法，該鑒定方法既可以去除排趨性對鑒定結(jié)果的干擾，又解決了品種抗性鑒定所需褐飛虱規(guī)模量的難題，實現(xiàn)了定量而強化的水稻齒葉矮化病接種鑒定，最終實現(xiàn)了對水稻齒葉矮化病抗性的準確評價。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：

一種水稻抗齒葉矮化病鑒定方法，其特征在于：所述的鑒定方法步驟如下：

（a）、采用盤托法從田間采集褐飛虱后通過純化篩選裝置獲取大量4-5齡褐飛虱若蟲；

（b）、將篩選獲得的4-5齡褐飛虱若蟲接種到作物昆蟲共育箱內(nèi)培育的水稻上共育并繁育下一代褐飛虱若蟲，并進一步利用調(diào)整的純化篩選裝置分離獲取大量整齊一致的2齡褐飛虱若蟲；

（c）、將篩選獲得的2齡褐飛虱若蟲移入栽有水稻齒葉矮化病重災區(qū)取材的水稻病株上進行飼毒；

（d）、通過精密電子天平稱重獲得單頭2齡褐飛虱若蟲的重量，根據(jù)確定的蟲/苗比例計算所需褐飛虱總重，進而稱重定量；

（e）、根據(jù)確定的蟲/苗比例將飼毒后的定量2齡褐飛虱若蟲接種到作物昆蟲共育箱內(nèi)栽培的待測水稻幼苗上共育傳毒；

（f）、待褐飛虱半數(shù)死亡后將待測水稻移栽至大田隔蟲網(wǎng)室，常規(guī)栽培管理，40天后調(diào)查統(tǒng)計齒葉矮化病穴發(fā)病率，并根據(jù)齒葉矮化病穴發(fā)病率準確鑒定出待測水稻品種的抗病能力。

所述步驟（a）中的褐飛虱收集時間為每年九月中下旬水稻田由青轉(zhuǎn)黃期。

所述步驟（a）中的純化篩選裝置使用時，采用孔徑為16目和18目的分樣篩組合以有效分離出4-5齡褐飛虱若蟲。

所述步驟（b）中的4-5齡褐飛虱若蟲接種到作物昆蟲共育箱內(nèi)培育的水稻上時，與褐飛虱若蟲共育的水稻為4-6葉期。

所述步驟（b）中的作物昆蟲共育箱的培養(yǎng)溫度控制在29℃、光12h/暗12h。

所述步驟（b）中的作物昆蟲共育箱內(nèi)繁育下一代褐飛虱若蟲后，此時篩選裝置翻轉(zhuǎn)90°將垂直的趨光方向改變?yōu)樗椒较颍捎每讖綖?2目和26目的分樣篩組合以有效分離獲得大量整齊一致的2齡褐飛虱若蟲。

所述步驟（c）中的水稻病株為當年春季自水稻齒葉矮化病重災區(qū)取材后于-20℃的冰箱冷藏的，待病株自然解凍后將根用浸水脫脂棉包裹并用塑料布包扎結(jié)實模擬大田移栽方式垂直固定于作物昆蟲共育箱內(nèi)，然后移入2齡褐飛虱若蟲飼毒不低于48h。

所述步驟（d）中的2齡褐飛虱若蟲飼毒后采用趨光分離毛刷刷離褐飛虱若蟲時夾雜的雜質(zhì)和死蟲，然后轉(zhuǎn)移20-30頭褐飛虱若蟲進稱量瓶，通過精密電子天平稱重，去皮計算瓶內(nèi)褐飛虱若蟲的總重后根據(jù)瓶內(nèi)褐飛虱若蟲的數(shù)量，計算得到單頭褐飛虱若蟲的重量，根據(jù)待測水稻株數(shù)和接種強度確定飼毒所需褐飛虱若蟲數(shù)目，進而計算接種所需飼毒褐飛虱若蟲的總重并稱重定量。

所述步驟（e）中的待測水稻生長處于2-3葉期，且按照20cm²/株的比例留取長勢健康均勻的稻苗。

所述步驟（e）中的待測水稻按照5-12蟲/苗的比例接種飼毒后的2齡褐飛虱若蟲，作物昆蟲共育箱內(nèi)29℃、光12h/暗12h共育傳毒至接種的褐飛虱自然衰老死亡。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點：

本發(fā)明通過純化篩選裝置獲得大量的大田來源的4-5齡褐飛虱若蟲，進而通過作物昆蟲共育箱共育出大量的2齡褐飛虱若蟲，并再次通過純化篩選裝置獲得大量整齊一致的2齡褐飛虱若蟲，然后通過2齡褐飛虱若蟲共育飼毒、待測水稻定量共育接種傳毒的方式使得待測水稻發(fā)病，最后通過調(diào)查水稻齒葉矮化病發(fā)病率即可準確鑒定出待測水稻品種的抗齒葉矮化病能力。

本發(fā)明的強化接種鑒定方法既可以去除排趨性對鑒定結(jié)果的干擾，又可以克服品種抗性鑒定所需褐飛虱規(guī)模量的難題，并且實現(xiàn)了定量而強化的水稻齒葉矮化病接種鑒定，能夠準確地評價水稻品種對水稻齒葉矮化病的抗性水平；該鑒定方法除了可以應用于水稻抗齒葉矮化病品種資源發(fā)掘、品種抗性評價、抗病品種選育外，亦可以應用于抗病基因定位的表型鑒定和抗性遺傳規(guī)律研究等眾多領(lǐng)域，故適宜推廣使用。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

一種水稻抗齒葉矮化病鑒定方法，其特征在于：所述的鑒定方法步驟如下：（a）、每年九月中下旬水稻田由青轉(zhuǎn)黃期采用盤托法從田間采集褐飛虱后將純化篩選裝置選用孔徑為16目和18目的分樣篩組合以有效分離出大量4-5齡褐飛虱若蟲；（b）、將篩選獲得的4-5齡褐飛虱若蟲接種到作物昆蟲共育箱內(nèi)培育的4-6葉期水稻上，控制作物昆蟲共育箱溫度29℃、光12h/暗12h，共育并繁育下一代褐飛虱若蟲后，篩選裝置翻轉(zhuǎn)90°將垂直的趨光方向改變?yōu)樗椒较?，采用孔徑?2目和26目的分樣篩組合以有效分離獲得大量整齊一致的2齡褐飛虱若蟲；（c）、將當年春季自水稻齒葉矮化病重災區(qū)取材后于-20℃的冰箱冷藏的水稻病株自然解凍，后將根用浸水脫脂棉包裹并用塑料布包扎結(jié)實模擬大田移栽方式垂直固定于作物昆蟲共育箱內(nèi)，然后將篩選獲得的2齡褐飛虱若蟲移入飼毒不低于48h；（d）、2齡褐飛虱若蟲飼毒后采用趨光分離毛刷刷離褐飛虱若蟲時夾雜的雜質(zhì)和死蟲，然后轉(zhuǎn)移20-30頭褐飛虱若蟲進稱量瓶，通過精密電子天平稱重，去皮計算瓶內(nèi)褐飛虱若蟲的總重后根據(jù)瓶內(nèi)褐飛虱若蟲的數(shù)量，計算得到單頭褐飛虱若蟲的重量，根據(jù)待測水稻株數(shù)和接種強度確定飼毒所需褐飛虱若蟲數(shù)目，進而根據(jù)確定的蟲/苗比例計算接種所需飼毒褐飛虱若蟲的總重并稱重定量；（e）、作物昆蟲共育箱內(nèi)栽培的待測水稻生長處于2-3葉期時，按照20cm²/株的比例留取長勢健康均勻的稻苗，按照5-12蟲/苗的比例將飼毒后的定量2齡褐飛虱若蟲接種于待測水稻上，控制作物昆蟲共育箱內(nèi)溫度29℃、光12h/暗12h共育傳毒；（f）、待測水稻大田顯癥統(tǒng)計：待褐飛虱半數(shù)死亡后將待測水稻移栽至大田隔蟲網(wǎng)室，常規(guī)栽培管理，40天后調(diào)查統(tǒng)計齒葉矮化病發(fā)病率，并根據(jù)齒葉矮化病發(fā)病率準確鑒定出待測水稻品種的抗病能力。水稻齒葉矮化病毒病的癥狀主要表現(xiàn)為病株濃綠矮縮，分孽增多，葉尖旋卷，葉緣有鋸齒狀缺刻，葉鞘和葉片基部常有長短不一的線狀脈腫，長度達到0.1～0.85cm以上，多發(fā)生在葉片基部的葉鞘上，但亦有發(fā)生在葉片的基部。

實施例1

2014年，采用重災區(qū)取材的冷凍水稻齒葉矮化病病株作為毒源，采用本方法進行接種鑒定，采用人工飼養(yǎng)的2齡無毒灰飛虱若蟲做對照，其他處理相同。飼毒時間定為48h，接種強度均為10頭/株，顯癥后調(diào)查水稻齒葉矮化病發(fā)病率。

由表1可以發(fā)現(xiàn)，大田采集褐飛虱繁育的下一代2齡若蟲與無毒褐飛虱2齡若蟲傳播水稻齒葉矮化病的發(fā)病率差異均不顯著，表明褐飛虱傳播水稻齒葉矮化病不受遺傳攜帶的雜毒干擾。

目前水稻齒葉矮化病的鑒定中自然鑒定法中無法克服排趨性的干擾，而人工篩選無毒褐飛虱人工飼養(yǎng)規(guī)模量小，飼養(yǎng)成本很高，難以滿足品種抗性鑒定的規(guī)模量的需求，限制了該方法的推廣應用。而本實施例發(fā)現(xiàn)利用大田來源褐飛虱成蟲繁育一代若蟲飼毒并接種傳毒的效果與無毒褐飛虱接種效果并無顯著性差異，并且突破了無毒褐飛虱人工飼養(yǎng)難以規(guī)?；募夹g(shù)難題，證明了本鑒定技術(shù)的可行性和進步性。

實施例2

2014年采用本方法鑒定了四個水稻品種，同期在水稻齒葉矮化病重災區(qū)采用自然發(fā)病鑒定法鑒定這四個品種，水稻齒葉矮化病發(fā)病率和其它品種相對于廣陸矮的相對抗感比表現(xiàn)如表2。

四個水稻品種通過采用本方法鑒定與重災區(qū)自然發(fā)病鑒定水稻齒葉矮化病發(fā)病率、其它品種發(fā)病率相對于廣陸矮的相對抗感比可以發(fā)現(xiàn)，不同水稻品種通過本技術(shù)鑒定和重災區(qū)自然發(fā)病鑒定的相對抗感比不相同，個別品種差異顯著，可能是不同水稻品種的排趨性差異造成的。

為研究不同鑒定技術(shù)鑒定的水稻品種抗病能力差異的原因，我們做了不同水稻品種對褐飛虱的排趨性鑒定實驗。將催芽后的水稻種子播于65cm×44cm×14cm的塑料周轉(zhuǎn)箱內(nèi)，每個品種1行，每行10株。待幼苗長至2.5～3葉，按每株10頭接入3～4齡的褐飛虱若蟲，每天上午8時、下午4時調(diào)查每個單株上的蟲數(shù)，每次調(diào)查后進行驅(qū)蟲，使其盡量均勻分布。環(huán)境溫度保持在29±2℃，自然光照。5天后計算每個品種每個單株上的平均蟲數(shù)，作為排驅(qū)性測驗值，鑒定結(jié)果如表3。

由表3可以發(fā)現(xiàn)，四個水稻品種對褐飛虱的排趨性由強到弱依次為IR36>矮腳南特>廣陸矮>連粳4號?？梢源_定，大田自然鑒定鑒定到的水稻齒葉矮化病中抗品種IR36的抗病表現(xiàn)主要來自該品種對褐飛虱的強排趨性，但種質(zhì)自身抗病能力卻極感病。通過表2和表3也可以發(fā)現(xiàn)采用大田自然發(fā)病鑒定的不同水稻品種的水稻齒葉矮化病發(fā)病表現(xiàn)受品種間褐飛虱排趨性的干擾較大。

通過本實施例可以發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)對種質(zhì)資源水稻齒葉矮化病抗病能力的鑒定結(jié)果可以排除排趨性的影響，其結(jié)果比大田自然鑒定更加準確，值得進一步推廣利用。

以上實施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動，均落入本發(fā)明保護范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實現(xiàn)。