玉米組織特異性啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了玉米組織特異性啟動子及其應用，屬于植物組織特異性啟動子的分離和應用領(lǐng)域。本發(fā)明首先公開了從玉米中分離的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示的組織特異性啟動子，本發(fā)明將該組織特異性啟動子序列進一步截短后獲得仍具有啟動子功能的SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的截短的啟動子片段。本發(fā)明進一步公開了所述組織特異性啟動子或截短后的啟動子片段在提高作物種子品質(zhì)、改良作物性狀以及培育轉(zhuǎn)基因植物新品種等方面的應用。
【專利說明】玉米組織特異性啟動子及其應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從植物中分離的啟動子，尤其涉及從玉米（Zea mays)中分離的組 織特異性啟動子，本發(fā)明進一步涉及含有該組織特異性啟動子的重組植物表達載體以及重 組宿主細胞，本發(fā)明進一步涉及它們在提高作物種子品質(zhì)、改良作物性狀、培育植物新品種 等方面的應用，屬于植物組織特異性啟動子的分離及其應用領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，是重要的順式作用元件，一般 位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)。高等植物基因調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進行，啟動子控制著基因表 達的起始時間和表達程度，同時對所使用的RNA聚合酶類型也起著決定性作用，所以啟動 子是理解基因表達模式和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的關(guān)鍵，是植物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。
[0003] 根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式及功能，可將其分為三類：組成型啟動子、組織特異性啟動 子和誘導型啟動子。目前，在植物基因工程中使用的大多數(shù)為組成型啟動子，使外源目的 基因在植物各組織部位高水平表達，但是組成型啟動子也有諸多缺點，例如，不能從時間和 空間上有效地調(diào)控目的基因的表達，過度消耗細胞內(nèi)的物質(zhì)和能量（Gittins JR，Pellny TKj Hiles ER, Rosa C，Biricolti S，et al. (2000)Transgene expression driven by heterologous ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small-subunit gene promoters in the vegetative tissues of apple(Malus pumila mill.).Planta 210:232-240.);大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物的代謝平衡，不 利于植物生長(Robinson DJ(1996)Environmental risk assessment of releases of transgenic plants containing virus-derived inserts. Transgenic research 5:359-362.);容易引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象（Kumpatla SP，Chandrasekharan MB，Iyer LMj Guofu Lj Hall TC(1998)Genome intruder scanning and modulation systems and transgene silencing. Trends in Plant Science 3:97-104 ；Mette MFj Aufsatz Wj van der Winden Jj Matzke MAj Matzke AJ(2000)Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J 19:5194-5201·)。因此，科學 家們不斷尋找更為有效的組織特異性啟動子來代替組成型啟動子，以期更精確的調(diào)控外源 基因的表達D
[0004] 組織特異性啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄過程一般只發(fā)生在某些特定的組織或者器 官中。組織特異性表達啟動子可以更加經(jīng)濟有效的調(diào)控外源基因的表達，特異地在特定需 要的部位發(fā)揮作用，這樣不僅可以提高外源基因的表達豐度，而且將生物能耗降到最低，從 而不影響植株的正常生長。
[0005] 玉米（Zea mays)是中國最大的糧食作物，也是重要的轉(zhuǎn)基因作物。玉米組織特異 性啟動子可分為根、莖、葉、花、胚、胚乳、果實、木質(zhì)部、綠色組織等組織特異性啟動子，每一 類型的組織特異性啟動子都具有一些特殊的功能元件。從玉米中分離獲得組織特異性啟動 子，可以利用特異性啟動子將目的基因在植物中進行特異性的高效表達，這對玉米進行分 子改良或生產(chǎn)具有特殊用途的新玉米品種等方面有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的之一是提供從玉米（Zea mays)中分離的組織特異性啟動子或?qū)⑵浣?短后獲得的仍具有啟動子功能的啟動子片段。
[0007] 本發(fā)明目的之二是提供含有上述組織特異性啟動子或啟動子片段的重組表達載 體。
[0008] 本發(fā)明目的之三是將所述的組織特異性啟動子或啟動子片段以及含有該組織特 異性啟動子或啟動子片段的重組表達載體應用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物、改良農(nóng)作物種子性狀或 培育具有優(yōu)良性狀的植物新品種等方面。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種從玉米（Zea mays)中分離的組織特異性 啟動子，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0010] (a)、SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸序列；或
[0011] (b)、與SEQ ID NO. 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動子的功能或活性；或
[0012] (c)、與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有60%或以上同源性的多核苷酸序列， 且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序 列至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能 或活性；更優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有90%或以上同源性的多核苷酸 序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；特別優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的 多核苷酸序列至少有95%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟 動子的功能或活性；或
[0013] (d)、在SEQ ID NO. 1的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入并包含SEQ ID NO. 2序列的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體仍具有組織特異性啟動子的功能或活性。
[0014] 本發(fā)明進一步將SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸序列從5'端逐漸刪除部分序列得 到多個截短的序列，將截短后的各個序列分別連接到帶有報告基因的表達載體上驗證截短 后的序列是否具有組織特異啟動子的功能；本發(fā)明通過功能驗證實驗確定，將SEQ ID NO. 1 的5'端核苷酸序列截短后的SEQ ID NO. 3所示的411bp的序列能夠驅(qū)動報告基因在玉米 種子胚中進行高效表達，說明SEQ ID NO. 3所示截短后的啟動子序列仍具有組織特異性啟 動子的功能。
[0015] 本發(fā)明還進一步將SEQ ID NO. 1的核苷酸序列截短后的SEQ ID NO. 2所示的276bp 的序列，該序列仍具有在胚組織中啟動報告基因表達的功能，但其活性較全長啟動子（SEQ ID NO. 1)的活性明顯下降幾乎喪失。
[0016] 因此，本發(fā)明提供了一種將SEQ ID NO. 1所示的組織特異啟動子截短后的啟動子 片段，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0017] (a)、SEQ ID NO. 2所示的多核苷酸序列；或
[0018] (b)、與SEQ ID NO. 2的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動子的功能或活性；或
[0019] (c)、與SEQ ID NO. 2的多核苷酸序列至少有60%或以上同源性的多核苷酸序列， 且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 2的多核苷酸序 列至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能 或活性；更優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 2的多核苷酸序列至少有90%或以上同源性的多核苷酸 序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；特別優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 2的 多核苷酸序列至少有95%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟 動子的功能或活性或
[0020] ⑷、在SEQ ID NO. 2的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入獲得的多 核苷酸變體，且該多核苷酸變體仍具有啟動子的功能或活性。
[0021] 本發(fā)明進一步提供了一種將SEQ ID NO. 1所示的組織特異啟動子截短后獲得的啟 動子片段，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示：
[0022] (a)、SEQ ID NO. 3所示的多核苷酸序列；或
[0023] (b)、與SEQ ID NO. 3的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動子的功能或活性；或
[0024] (c)、與SEQ ID NO. 3的多核苷酸序列至少有60%或以上同源性的多核苷酸序列， 且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 3的多核苷酸序 列至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能 或活性；更優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 3的多核苷酸序列至少有90%或以上同源性的多核苷酸 序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能或活性；特別優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 3的 多核苷酸序列至少有95%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟 動子的功能或活性或
[0025] ⑷、在SEQ ID NO. 3的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入獲得的多 核苷酸變體，且該多核苷酸變體仍具有組織特異性啟動子的功能或活性。
[0026] 本發(fā)明中所述的"替換"是指分別用不同的堿基取代另外的堿基；所述的"缺失" 是指缺少一個或多個堿基；所述的"插入"是指核苷酸的改變，相對天然分子而言，所述改變 是因添加一個或多個堿基所致。
[0027] 為研宄本發(fā)明從玉米中分離的組織特異啟動子的功能，本發(fā)明將SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的啟動子或截短后的啟動子序列與⑶S報告基因可操作的 連接，構(gòu)建得到重組植物表達載體；以玉米為受體材料，采用基因槍轉(zhuǎn)化的瞬時表達體系， 將重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到玉米中對啟動子進行功能驗證；功能驗證試驗結(jié)果表明，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的啟動子驅(qū)動的⑶S基因僅在玉米種子的胚中 進行特異性表達，在玉米種子胚乳、根、莖、葉等其它組織部位里沒有GUS表達活性；試驗結(jié) 果證實，本發(fā)明從玉米中所分離的SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的核苷 酸序列為組織特異性啟動子或具有啟動子活性的啟動子序列。
[0028] 本發(fā)明進一步提供了含有所述組織特異性啟動子的重組植物表達載體以及含有 該重組植物表達載體的宿主細胞。
[0029] 將本發(fā)明所述組織特異性啟動子與待轉(zhuǎn)錄的異源性基因進行可操作的連接，得到 在農(nóng)作物種子胚中特異性表達異源性基因的重組植物表達載體。
[0030] 所述的重組植物表達載體中還可含有選擇標記基因。
[0031] 另外，可以將本發(fā)明的組織特異性啟動子與標記序列可操作的連接以確定標記序 列的活性，所述的標記序列通常包括提供抗生素抗性或除草劑抗性的基因，諸如：四環(huán)素抗 性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。
[0032] 可以采用任何一種的植物轉(zhuǎn)化方法將本發(fā)明所構(gòu)建的重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到 受體植物的細胞、組織中，得到轉(zhuǎn)化體；再由轉(zhuǎn)化體通過植物組織培養(yǎng)方法再生得到完整的 植株及其無性系或其后代；所述的轉(zhuǎn)化方法包括：農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、Ti質(zhì) 粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、顯微注射、電穿孔法、微粒轟擊等；所述的受體植物包括單子葉 植物、雙子葉植物；優(yōu)選的，所述的受體植物為禾本科植物，例如玉米、水稻、大麥、小麥或高 粱等農(nóng)作物。
[0033] 本發(fā)明所分離的組織特異性啟動子在提高作物種子的品質(zhì)、改良植物性狀、培育 植物新品種等方面有廣泛的應用。
[0034] 將本發(fā)明的組織特異性啟動子可操作的與待轉(zhuǎn)錄的異源性基因相連接，指導或調(diào) 控待轉(zhuǎn)錄的異源基因在植物種子中的胚進行特異性的表達，得到具有預期性狀的轉(zhuǎn)基因植 物或植物新品種；例如，將本發(fā)明的組織特異性啟動子可操作的與待轉(zhuǎn)錄的異源基因相連 接（其中，該待轉(zhuǎn)錄的異源基因還與3'非編碼區(qū)可操作的連接，所述的3'非編碼區(qū)可以 包含終止子序列、mRNA切割序列等。）得到可以在植物種子胚中表達該待轉(zhuǎn)錄的異源基因 的重組植物表達載體。待轉(zhuǎn)錄的異源基因不受限制，可以是調(diào)節(jié)基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因 或者能干擾內(nèi)源基因表達的小RNA等；所述的待轉(zhuǎn)錄的異源基因可以是來自非靶基因物種 的核酸分子或基因，或者是起源于或存在于相同的物種中經(jīng)過人工改造或修飾的核酸分子 或基因。
[0035] 通常來說，待轉(zhuǎn)錄的異源基因多為改良作物種子品質(zhì)、提高作物脅迫抗性、改善作 物性狀或代謝的相關(guān)基因，例如，可以是：改善植物生理、生長和發(fā)育的相關(guān)基因，提高產(chǎn)量 的相關(guān)基因，強化營養(yǎng)、提高脅迫抗性（例如，抗病蟲害、抗干旱、耐鹽堿、耐低溫）等相關(guān)基 因，這些基因或者為植物體提供有益的性狀，或者提高或改善作物種子品質(zhì)、或者促進種子 胚發(fā)育或提高作物種子對逆境脅迫抗性等。例如，可以將促進作物種子中鐵、鋅、鉀等微量 元素的積累的有關(guān)基因可操作的與本發(fā)明的組織特異性啟動子相連接之后構(gòu)建得到重組 植物表達載體，將該重組植物表達載體轉(zhuǎn)化到受體植物組織或細胞中后，本發(fā)明組織特異 性啟動子能夠驅(qū)動促進作物種子中鐵、鋅、鉀等微量元素的積累的有關(guān)基因在作物種子胚 中進行特異的高效表達，有效提高作物種子中鐵、鋅、鉀等微量元素的積累，達到提高作物 種子品質(zhì)的目的。
[0036] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語宙義
[0037] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者 類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
[0038] 術(shù)語"同源性"是指在此用作序列之間相似性的衡量；兩個序列之間的序列同源性 越大，則雜交程度越高。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知的方法可測定雜交體形成。
[0039] 術(shù)語"互補"是指兩個核苷酸之間精確配對的能力。
[0040] 術(shù)語"嚴謹雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常， 在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高 (例如超過本底至少2倍。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會不同， 較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針 100%互補的革E序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關(guān)文獻（Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993) 〇更 具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強度pH下的熱熔點（Tm)約 5-10°C。T mS在平衡狀態(tài)下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度（在指定 離子強度、pH和核酸濃度下）（因為目標序列過量存在，所以在T m下在平衡狀態(tài)下50%的探 針被占據(jù)）。嚴謹條件可為以下條件：其中在pH 7. 0到8. 3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子濃 度，通常為約〇· 01到I. OM鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對于短探針（包括（但不限 于）10到50個核苷酸）而言為至少約30°C，而對于長探針（包括（但不限于）大于50個 核苷酸）而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。對于 選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例 示性嚴謹雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1% SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2 X SSC中洗滌和在65°C下于0. 1 % SDS中洗滌。所述洗滌可進行 5、15、30、60、120分鐘或更長時間。
[0041] 術(shù)語"宿主細胞"或"重組宿主細胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用 何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導、f配對或所屬領(lǐng)域中已知的 其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
[0042] 術(shù)語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包 括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非 另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡并 密碼子取代）和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以 上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡 并密碼子取代（Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ;0htsuka 等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Cassol 等人，（1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8:91-98(1994))〇
[0043] 術(shù)語"啟動子"指存在于目的基因編碼序列的上游，提供RNA聚合酶和正確轉(zhuǎn)錄起 始所必需的其它因子的識別位點，啟動或指導目的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA。
[0044] 術(shù)語"組織特異性啟動子"：調(diào)控或驅(qū)動目的基因在組織中特異性表達的啟動子。
[0045] 術(shù)語"異源性基因"指該基因序列對該特定的宿主細胞而言屬于外來的來源，或若 來自相同的原始來源但對該原始序列進行了修飾或改造。
[0046] 術(shù)語"內(nèi)源基因"來自宿主本身的基因，包括DNA或RNA序列。
[0047] 術(shù)語"選擇標記基因"：該基因在植物細胞中的表達給予該細胞選擇優(yōu)勢，用這些 選擇性標記基因所轉(zhuǎn)化的這些細胞所具有的選擇優(yōu)勢可以是由于它們與非轉(zhuǎn)化細胞的生 長相比具有在陰性選擇劑（如：抗菌素或除草劑）的存在下生長的能力。選擇標記基因還 指多種基因的組合，它們在植物細胞中的表達給予該細胞陰性以及陽性的選擇優(yōu)勢。
[0048] 術(shù)語"可操作的連接"指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的元 件可為鄰接或非鄰接的。
[0049] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化":將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
[0050] 術(shù)語"表達"：內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在植物細胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0051] 術(shù)語"編碼序列":轉(zhuǎn)錄成RNA的核酸序列。
[0052] 術(shù)語"植物表達載體"：一種或多種用于實現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的DNA載體；本領(lǐng)域中這些 載體常被稱為二元載體。二元載體連同具有輔助質(zhì)粒的載體是大多常用于土壤桿菌介導轉(zhuǎn) 化的。二元載體通常包括：T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列、經(jīng)工程化處理以便能夠在植 物細胞中表達選擇標記物或待轉(zhuǎn)錄的異源性基因等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖 IRNA 質(zhì)量檢測電泳圖；R:根；S1，S2，S3 :第 4、3、2 節(jié)段莖；L1，L2，L3 :第 2、4、6 片葉；SH1，SH2, SH3 :第2、4、6片葉的葉鞘；SA :莖尖；T :雄花；EN :胚乳；E :胚；K :籽粒。
[0054] 圖2原始驗證載體pCAMBIA3301的示意圖。
[0055] 圖 3pEU66589-EZ 的示意圖。
[0056] 圖4pUM3G中間載體的示意圖。
[0057] 圖5表達載體pEU66589G3的示意圖。
[0058] 圖6胚特異性啟動子的瞬時表達結(jié)果；胚的發(fā)育時間為20天。
[0059] 圖7組織特異性啟動子SEQ ID NO. I (Peu66589)啟動⑶S基因在轉(zhuǎn)基因玉米植株中 的穩(wěn)定表達；(a)-(c):依次為授粉后15、20天的Tl代轉(zhuǎn)基因玉米籽粒以及成熟種子萌發(fā) 三天的縱切圖；（d)-(f):依次為三葉一心時期的Tl代轉(zhuǎn)基因玉米的根、莖和葉片；其中圖 (f)右半部分為對照；（g)-(i):依次為大喇叭口時期的Tl代轉(zhuǎn)基因玉米的根、莖和葉片。
[0060] 圖8不同長度啟動子驅(qū)動報告基因表達的瞬時表達結(jié)果。
[0061 ] 圖9p EU66589-1G3穩(wěn)定表達載體示意圖。
[0062] 圖IOp EU66589-7G3穩(wěn)定表達載體示意圖。
[0063] 圖11啟動子各缺失片段在Tl代轉(zhuǎn)基因玉米各組織的⑶S染色圖； (a)-(e) :pEU66589-lG3穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Tl代轉(zhuǎn)基因玉米各組織的⑶S染色圖； (f) -(k) :pEU66589-7G3穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Tl代轉(zhuǎn)基因玉米各組織的⑶S染色圖；（aV(bV(f)/ (g) :授粉后30天的種子縱切，（b) Ag)為負對照；（c) Ai):葉鞘；（d) Aj):葉；（e) Ak): 根；(h):是放大25倍的圖⑴著色部分的橫切面。

【具體實施方式】
[0064] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0065] 實施例1玉米組織特異啟動子的克隆及序列分析
[0066] 1、利用基因芯片數(shù)據(jù)篩選驅(qū)動玉米種子特異表達基因的啟動子
[0067] 基因芯片材料的準備：取玉米B73大喇叭口期的根、葉、莖和莖間，成熟期但未授 粉的幼穗和花絲，授粉后10天、15天、20天、25天的胚和胚乳等共14個樣品，每個樣品類型 設3個重復，利用基因芯片（Affymetrix公司的Maize GenomeArray)對42個樣品的基因 表達譜進行分析。
[0068] 生物信息學分析：采用生物信息學的方法對42個樣品進行數(shù)據(jù)分析，分別發(fā)現(xiàn)了 一個基因 Zm66589(該基因的啟動子序列為SEQ ID NO. 1所示）在胚發(fā)育的中后期，特異性 的大量表達。
[0069] 表1利用基因芯片分析基因（其啟動子序列為SEQ ID NO. 1)在不同組織中的表 達量
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 從玉米（Zea mays)中分離的組織特異性啟動子，其特征在于，其多核苷酸為（a)、 (b)、（c)或（d)所示： (a) 、SEQ ID NO. 1所示的多核苷酸序列；或 (b) 、與SEQ ID NO. 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸序列，該多 核苷酸仍具有組織特異性啟動子的功能或活性；或 (c) 、與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有60%或以上同源性的多核苷酸序列，且該 多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有 80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能；更優(yōu)選 的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有90%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核 苷酸具有組織特異性啟動子的功能；特別優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列至少有 95%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有組織特異性啟動子的功能；或 (d) 、在SEQ ID NO. 1的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入并包含SEQ ID NO. 2序列的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體仍具有組織特異性啟動子的功能。
2. 將權(quán)利要求1的從玉米中分離的組織特異性啟動子截短后獲得的啟動子片段，其特 征在于，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示： (a) 、SEQ ID NO. 2所示的多核苷酸序列；或 (b) 、與SEQ ID NO. 2的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸仍具有啟動子的功能；或 (c) 、與SEQ ID NO. 2的多核苷酸序列至少有60%或以上同源性的多核苷酸序列，且該 多核苷酸具有啟動子的功能；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 2的多核苷酸序列至少有80%或以上 同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有啟動子的功能；更優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 2的多 核苷酸序列至少有90 %或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有啟動子的功能； 特別優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 2的多核苷酸序列至少有95%或以上同源性的多核苷酸序列，且 該多核苷酸仍具有啟動子的功能；或 (d) 、在SEQ ID NO. 2的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入獲得的多核苷 酸變體，且該多核苷酸變體仍具有啟動子的功能。
3. 將權(quán)利要求1的從玉米中分離的組織特異性啟動子截短后獲得的啟動子片段，其特 征在于，其多核苷酸序列為（a)、（b)、（c)或（d)所示： (a) 、SEQ ID NO. 3所示的多核苷酸序列；或 (b) 、與SEQ ID NO. 3的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸仍具有啟動子的功能；或 (c) 、與SEQ ID NO. 3的多核苷酸序列至少有60%或以上同源性的多核苷酸序列，且該 多核苷酸具有啟動子的功能；優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 3的多核苷酸序列至少有80%或以上 同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有啟動子的功能；更優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 3的多 核苷酸序列至少有90 %或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸具有啟動子的功能； 特別優(yōu)選的，與SEQ ID NO. 3的多核苷酸序列至少有95%或以上同源性的多核苷酸序列，且 該多核苷酸仍具有啟動子的功能；或 (d) 、在SEQ ID NO. 3的基礎上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插入獲得的多核苷 酸變體，且該多核苷酸變體仍具有啟動子的功能。
4. 含有權(quán)利要求1-3任何一項所述的組織特異性啟動子或啟動子片段的重組植物表 達載體。
5. 按照權(quán)利要求4所述的重組植物表達載體，其特征在于，包含：權(quán)利要求1-3任何一 項所述的組織特異性啟動子或啟動子片段和待轉(zhuǎn)錄的異源基因；其中，所述組織特異性啟 動子或啟動子片段和待轉(zhuǎn)錄的異源基因可操作地相連接，待轉(zhuǎn)錄的異源基因位于所述組織 特異性啟動子的下游。
6. 按照權(quán)利要求5所述的重組植物表達載體，其特征在于：所述的異源基因是提高或 改善作物種子品質(zhì)的基因、促進種子胚發(fā)育的基因或提高作物或作物種子脅迫抗性的基 因。
7. 權(quán)利要求1-3任何一項所述組織特異性啟動子或啟動子片段在調(diào)控、指導或啟動異 源基因在植物種子胚中進行特異性表達的用途。
8. 權(quán)利要求1-3任何一項所述組織特異性啟動子或啟動子片段在提高作物種子品質(zhì)、 改良植物性狀或培育轉(zhuǎn)基因植物新品種中的用途。
9. 按照權(quán)利要求7或8所述的用途，其特征在于，包括：將權(quán)利要求1-3任何一項所述 的組織特異性啟動子或啟動子片段和待轉(zhuǎn)錄的異源基因可操作地連接構(gòu)建得到植物重組 表達載體；將該植物重組表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞、組織，得到轉(zhuǎn)化體；將轉(zhuǎn)化體通過組織培 養(yǎng)再生得到完整的植株或無性系。
【文檔編號】A01H5/00GK104498499SQ201510038836
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】王磊, 柳小慶, 范云六, 陳茹梅, 趙軍, 田 健, 張春義 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所