天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法及其專用誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，是分別于6月下旬、7月下旬和9月分別采集天山云杉球果或種子，消毒并清洗后，分別取出帶胚乳的未成熟合子胚、不帶胚乳的未成熟合子胚和成熟合子胚接種于培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；同時(shí)還提供了專用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果為：此誘導(dǎo)方法的建立和培養(yǎng)基的制備，為進(jìn)入后期天山云杉體細(xì)胞胚遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入實(shí)用性目的基因，及克隆奠定了基礎(chǔ)，為天山云杉種質(zhì)保存、人工種子、原生質(zhì)體培養(yǎng)、樹(shù)種改良和生態(tài)環(huán)境建設(shè)提供有利條件。
【專利說(shuō)明】天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法及其專用誘導(dǎo) 培養(yǎng)基
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及植物組培領(lǐng)域，具體涉及天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法 及其專用誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0003] 天山云杉picea /7Z 1ScA at #6%」屬松科云杉屬，為中亞和亞洲中 部山地特有種，在中國(guó)僅分布于天山，是新疆山區(qū)最重要的森林樹(shù)種之一，面積約52. 84萬(wàn) hm2,占全疆天然有林地總面積44. 9%，是新疆山地森林中分布最廣、蓄積量最大、經(jīng)營(yíng)活動(dòng) 最多、用途最廣、材質(zhì)優(yōu)良的主要用材樹(shù)種，對(duì)天山的水源涵養(yǎng)、水土保護(hù)、林區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的 形成和維護(hù)發(fā)揮著不可替代的作用。
[0004] 由于天山云杉分布區(qū)人類活動(dòng)頻繁及不合理的經(jīng)營(yíng)管理和林牧矛盾等因素造成 天山云杉林生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致了天山云杉林的衰退。天然更新不良或天然更新 困難等問(wèn)題的出現(xiàn)已成為長(zhǎng)期困惑林業(yè)工作者的一大難題。云杉樹(shù)種生長(zhǎng)較慢，種子成熟 率很低，繁殖和品種選育有很大困難。從種子萌發(fā)到長(zhǎng)成可以移栽的小苗，又需經(jīng)過(guò)4-5 年，所以通過(guò)自然繁殖進(jìn)行育種和選擇優(yōu)良基因型效率太低。采用嫁接、扦插等營(yíng)養(yǎng)繁殖的 方法既消耗大量的時(shí)間和勞動(dòng)力，又受季節(jié)的限制。
[0005] 目前天山云杉主要通過(guò)有性繁殖產(chǎn)生后代，無(wú)性繁殖一直受到各國(guó)林業(yè)決策部門(mén) 的重視與林木育種工作者以及森林經(jīng)營(yíng)者的特別關(guān)注，尤其是現(xiàn)代生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展， 如植物組織培養(yǎng)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)，具有繁殖效率高、周期短、不受自然條件制約、穩(wěn) 定、選育優(yōu)良品種，對(duì)造林工程具有重大意義等特點(diǎn)。通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)育途徑實(shí)現(xiàn)植株再 生不僅可以解決無(wú)性繁殖的問(wèn)題，對(duì)于生物技術(shù)在云杉屬中的具體應(yīng)用及其樹(shù)種的品質(zhì)改 良也具有十分重要的意義。在天山云杉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，經(jīng)由組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)愈 傷組織，并由愈傷組織獲得體細(xì)胞胚胎，是目前人工種子研究和生物技術(shù)中廣泛應(yīng)用的手 段之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組 織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法及其專用誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘 導(dǎo)培養(yǎng)方法，包括以下步驟： 1)于6月下旬采集天山云杉球果，即帶胚乳的未成熟合子胚，作為材料，將球果用質(zhì)量 百分濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒10分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次；用攝子從球果中取出未 成熟種子，從側(cè)部劃開(kāi)種殼，取出種仁，劃破內(nèi)種皮，挑開(kāi)胚乳，將嫩胚同胚乳一起接種于 天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；每皿培養(yǎng)基中接種4個(gè)，重復(fù)20次，在溫度為 23±2°C下暗培養(yǎng)15-25天，得到白色半透明的胚性愈傷組織； 2) 于7月下旬采集天山云杉球果，即不帶胚乳的未成熟合子胚，作為材料，將球果用質(zhì) 量百分濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒10分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次；用攝子從球果中取出 基本成熟種子，從縱向裂開(kāi)種子，取出種胚，接種于天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上；每皿培養(yǎng)基中接種4個(gè)，重復(fù)20次，在溫度為23±2°C下暗培養(yǎng)15-25天，得到白色 半透明的胚性愈傷組織； 3) 于9月采集天山云杉成熟種子，即成熟合子胚，作為材料，將種子用質(zhì)量百分濃度為 0. 2%的HgCl2溶液消毒5分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次；用攝子從種子中取出成熟合子胚，接 種于天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；每皿培養(yǎng)基中接種4個(gè)，重復(fù)20次，在培 養(yǎng)溫度為23±2°C下暗培養(yǎng)15-25天，得到白色半透明的胚性愈傷組織。
[0008] 進(jìn)一步的，上述的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，所述步驟1)_3)中 所用的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加有植物生長(zhǎng)素2, 4-D和植物細(xì)胞 分裂素BAP的DCR培養(yǎng)基。
[0009] 進(jìn)一步的，上述的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，所述天山云杉體 細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，植物生長(zhǎng)素2, 4-D的濃度為20 ii M，植物細(xì)胞分裂素BAP 的濃度為5 ii M。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的專用誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所 述培養(yǎng)基為添加有植物生長(zhǎng)素2, 4-D和植物細(xì)胞分裂素BAP的DCR培養(yǎng)基；其中，植物生長(zhǎng) 素2, 4-D的濃度為20 ii M，植物細(xì)胞分裂素BAP的濃度為5 ii M。
[0011] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法 及其專用誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是通過(guò)篩選天山云杉體細(xì)胞胚進(jìn)行誘導(dǎo)，針對(duì)其體細(xì)胞發(fā)生情況，分 析影響天山云杉體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率，從而建立的適合天山云杉體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)方法和誘導(dǎo) 培養(yǎng)基。此誘導(dǎo)方法的建立和培養(yǎng)基的制備，為進(jìn)入后期天山云杉體細(xì)胞胚遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入 實(shí)用性的目的基因，并進(jìn)行克隆奠定基礎(chǔ)，為天山云杉種質(zhì)保存、人工種子、原生質(zhì)體培養(yǎng)、 樹(shù)種改良和生態(tài)環(huán)境建設(shè)提供有利條件。首先有助于從細(xì)胞水平上了解體細(xì)胞胚誘導(dǎo)機(jī)理 和提高胚狀體的發(fā)生頻率；其次，進(jìn)一步了解天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的發(fā)生規(guī)律，為建 立天山云杉體細(xì)胞胚再生體系提供理論依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為六種激素濃度組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)天山云杉成熟合子胚愈傷組織的誘導(dǎo) 率。
[0013] 其中，所得結(jié)果為平均值。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1 : 1、試驗(yàn)材料和方法： A :6月下旬采集天山云杉球果(帶胚乳的未成熟合子胚：未完全形成合子胚是指合子 胚未進(jìn)入第一發(fā)育階段)作為材料。將球果用質(zhì)量百分濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒10分 鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次。用攝子從球果中取出未成熟種子，從側(cè)部劃開(kāi)種殼，取出種仁， 劃破內(nèi)種皮，挑開(kāi)胚乳，將嫩胚同胚乳一起接種于培養(yǎng)基上；每皿接種4個(gè)，重復(fù)20次，材料 在溫度為23±2°C下暗培養(yǎng)。15-25天根據(jù)誘導(dǎo)愈傷組織顏色、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等特征及顯微觀 察結(jié)果區(qū)分出白色半透明的胚性愈傷組織。
[0015] B :7月下旬采集天山云杉球果（不帶胚乳的未成熟合子胚：合子胚的第一至第三 發(fā)育階段）作為材料。將球果用質(zhì)量百分濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒10分鐘后，用無(wú) 菌水沖洗3次。用攝子從球果中取出基本成熟種子，從縱裂種子，取出種胚，接種于培養(yǎng)基 上；每皿接種4個(gè)，重復(fù)20次，材料在溫度為23±2°C下暗培養(yǎng)。15-25天根據(jù)誘導(dǎo)愈傷組 織顏色、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等特征及顯微觀察結(jié)果區(qū)分出白色半透明的胚性愈傷組織。
[0016] C :9月份采集天山云杉成熟種子（成熟合子胚）作為材料。將種子用質(zhì)量百分 濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒5分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次。用攝子從種子中取出成熟 合子胚，接種于培養(yǎng)基上；每皿接種4個(gè)，重復(fù)20次，體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)過(guò)程在培養(yǎng)溫度為 23±2°C下暗培養(yǎng)。15-25天根據(jù)誘導(dǎo)愈傷組織顏色、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等特征及顯微觀察結(jié)果區(qū)分 出白色半透明的胚性愈傷組織。
[0017] 基本培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同植物的 組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有 滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。因此，沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類 型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)才 有可能成功。
[0018] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基： 天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DCR (GUPTA & DURZAN，1985)，首先添加 大量元素（10-40倍濃縮）和微量元素（100倍濃縮）的儲(chǔ)備液。然后添加鐵鹽，88 mM的蔗 糖，有機(jī)成分和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等的溶液，然后加蒸餾水定容。調(diào)PH值先用滴管吸取物質(zhì)的量 濃度為lmol/L的稀NaOH或稀HCI溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，一直到培 養(yǎng)基的pH調(diào)整到5. 8±0. 02為止，最后倒入含有3g/L Gelrite (卡拉膠)為固化劑的瓶中， 封口準(zhǔn)備消毒。滅菌溫度在121°C下，2xl07Pa的壓力下進(jìn)行15分鐘高壓滅菌。作為高溫， 如4. SmML-谷氨酰胺的結(jié)果可能會(huì)受到影響的物質(zhì)，所以過(guò)濾滅菌，然后高壓滅菌后，在最 高溫度為60°C的介質(zhì)。用美國(guó)Corning Costar公司生產(chǎn)的孔徑為0.22Mm過(guò)濾被用。滅菌 后培養(yǎng)器皿中培養(yǎng)基自然冷卻凝固，最好放置Id后再使用。
[0019] 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，一般在含有較高濃度的生長(zhǎng)素和較高濃度的細(xì)胞分裂素的固 體培養(yǎng)基上進(jìn)行。它的誘導(dǎo)與外植體的年齡、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的組成、激素的種類和濃 度、培養(yǎng)條件等有關(guān)。合子胚的發(fā)育時(shí)期是培養(yǎng)物誘導(dǎo)的一個(gè)重要因素。培養(yǎng)基中激素濃 度組合，設(shè)計(jì)6種分化培養(yǎng)基的對(duì)比試驗(yàn)，了解天山云杉體細(xì)胞愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，當(dāng) 2, 4-D作為生長(zhǎng)素添加，而B(niǎo)AP和TDZ作為細(xì)胞分裂素添加，6種激素濃度組合的誘導(dǎo)培養(yǎng) 基具體方案如表1所示。
[0020]表 1

【權(quán)利要求】
1. 天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 于6月下旬采集天山云杉球果，即帶胚乳的未成熟合子胚，作為材料，將球果用質(zhì)量 百分濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒10分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次；用攝子從球果中取出未 成熟種子，從側(cè)部劃開(kāi)種殼，取出種仁，劃破內(nèi)種皮，挑開(kāi)胚乳，將嫩胚同胚乳一起接種于 天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；每皿培養(yǎng)基中接種4個(gè)，重復(fù)20次，在溫度為 23±2°C下暗培養(yǎng)15-25天，得到白色半透明的胚性愈傷組織； 2) 于7月下旬采集天山云杉球果，即不帶胚乳的未成熟合子胚，作為材料，將球果用質(zhì) 量百分濃度為〇. 2%的HgCl2溶液消毒10分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次；用攝子從球果中取出 基本成熟種子，從縱向裂開(kāi)種子，取出種胚，接種于天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 基上；每皿培養(yǎng)基中接種4個(gè)，重復(fù)20次，在溫度為23±2°C下暗培養(yǎng)15-25天，得到白色 半透明的胚性愈傷組織； 3) 于9月采集天山云杉成熟種子，即成熟合子胚，作為材料，將種子用質(zhì)量百分濃度為 0.2%的HgCl2溶液消毒5分鐘后，用無(wú)菌水沖洗3次；用攝子從種子中取出成熟合子胚，接 種于天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；每皿培養(yǎng)基中接種4個(gè)，重復(fù)20次，在培 養(yǎng)溫度為23±2°C下暗培養(yǎng)15-25天，得到白色半透明的胚性愈傷組織。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟1) -3)中所用的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加有植物生長(zhǎng)素 2, 4-D和植物細(xì)胞分裂素BAP的DCR培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，植物生長(zhǎng)素2, 4-D的濃度為20 yM， 植物細(xì)胞分裂素BAP的濃度為5 ii M。
4. 天山云杉體細(xì)胞胚愈傷組織的專用誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基為添加有 植物生長(zhǎng)素2, 4-D和植物細(xì)胞分裂素BAP的DCR培養(yǎng)基；其中，植物生長(zhǎng)素2, 4-D的濃度為 20 ii M，植物細(xì)胞分裂素BAP的濃度為5 ii M。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104304034SQ201410630007
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】伊麗米努爾, 李宏, 阿力木江·牙生, 哈麗努爾·阿不力米提, 寧虎森, 劉永萍, 熱娜古麗·買(mǎi)買(mǎi)提 申請(qǐng)人:新疆林科院造林治沙研究所