一種馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增值、懸浮細胞的培養(yǎng)等步驟，本發(fā)明方法所制備的馬錢懸浮細胞品質優(yōu)良，增值率高，短期內可以獲得大量的懸浮細胞，為馬錢藥用成分的開發(fā)和利用提供技術支持。
【專利說明】 一種馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下馬錢懸浮細胞的培養(yǎng)，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]馬致，Strychnos nux~vomica L.,別名:番木鳘、苦實把豆兒等,馬錢科,喬木,枝條幼時被微毛，老枝被毛脫落。葉片紙質，近圓形、寬橢圓形至卵形，性味苦，寒。有毒。分布于東南亞我國的福建、臺灣、廣東、廣西、云南地區(qū)。興奮健胃，消腫毒，涼血。主治四肢麻木，癱瘓，食欲不振，痞塊，癰瘡腫毒，咽喉腫痛。生于海拔600m以下的較炎熱的半山坡凹地、山谷濕處或雜木林、樹叢中。生深山老林中，喜熱帶濕潤性氣候，怕霜凍，而以石灰質壤土或微酸性粘壤土生長較好。種子極毒，含有生物堿，主要為番木鱉堿(士的寧)及馬錢子堿，并含有微量的番木鱉次堿，偽番木鱉堿，偽馬錢子堿，奴伐新堿，士屈新堿以及脂肪油，蛋白質，綠原酸等，性寒，味苦，有通絡散結，消腫止痛之效。西醫(yī)學上用種子提取物，作中樞神經興奮劑，目前尚無馬錢繁殖技術的研究報道。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，本發(fā)明方法所制備的馬錢懸浮細胞品質優(yōu)良，增值率高，短期內可以獲得大量的懸浮細胞，為馬錢藥用成分的開發(fā)和利用提供技術支持。
[0004]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下列技術方案:
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水沖洗為35min，超凈工作臺上過氧化氫處理Ilmin,無菌水沖洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養(yǎng)基配方為BL+KT 2mg/L+ZT2mg/l的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養(yǎng)基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，PH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構松散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+NAA0.1-0.2mg/L+ZTl-l.5mg/L+200-350mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，采用水平震蕩培養(yǎng)，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養(yǎng)液。
[0005]采用本發(fā)明制備的馬錢懸浮細胞生長速度快，操作簡單，能耗小，污染小。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

【具體實施方式】
[0007]實施例1
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水沖洗為35min，超凈工作臺上過氧化氫處理Ilmin,無菌水沖洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養(yǎng)基配方為BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養(yǎng)基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構松散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+NAA0.lmg/L+ZTlmg/L+200mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，采用水平震蕩培養(yǎng)，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養(yǎng)液，細胞增長率為67%。
[0008]實施例2
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水沖洗為35min，超凈工作臺上過氧化氫處理Ilmin,無菌水沖洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養(yǎng)基配方為BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養(yǎng)基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構松散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+NAA0.2mg/L+ZTl.5mg/L+350mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，采用水平震蕩培養(yǎng)，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養(yǎng)液，細胞增長率78%。
[0009]實施例3
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水沖洗為35min，超凈工作臺上過氧化氫處理Ilmin,無菌水沖洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養(yǎng)基配方為BL+KT 2mg/L+ZT2mg/l的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養(yǎng)基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構松散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+NAA0.2mg/L+ZTlmg/L+300mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖45g/L，PH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，采用水平震蕩培養(yǎng)，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養(yǎng)液，細胞增長率80%。
【權利要求】
1.本發(fā)明研究了一種馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增值、懸浮細胞的培養(yǎng)等，主要步驟如下: (1)取馬錢幼嫩的葉片，按照常規(guī)的消毒方法對其進行消毒處理； (2)將步驟(I)消毒處理過的馬錢葉片用強度為100-300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養(yǎng)基配方為BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L, ρΗ5.8，光照強度4001χ，光照時間6h/d，溫度24°C ； (3 )取步驟(2 )誘導出來的愈傷組織放入培養(yǎng)基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養(yǎng)，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間 I Oh/d，溫度 24 0C ； (4)取步驟(3)增值出來結構松散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養(yǎng)基MS+NAA0.1-0.2mg/L+ZTl-l.5mg/L+200-350mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養(yǎng)，附加蔗糖 45g/L，ρΗ5.8，光照 25001χ，光照時間 12h/d，溫度 24。。。
2.按照權利要求1所述的一種馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(I)中所述馬錢無菌葉片的獲得為，取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水沖洗為35min,超凈工作臺上過氧化氫處理Ilmin,無菌水沖洗5遍。
3.按照權利要求1所述的一種馬錢懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)中馬錢懸浮細胞的培養(yǎng)采用水平震蕩培養(yǎng)，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養(yǎng)液。
【文檔編號】A01H4/00GK104221880SQ201410540655
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月14日 優(yōu)先權日:2014年10月14日
【發(fā)明者】劉東鋒, 楊成東 申請人:南京帝道農業(yè)科技有限公司