葡聚糖酶Cel16A及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了葡聚糖酶Cel16A及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從特異腐質(zhì)霉中分離到葡聚糖酶Cel16A編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.3所示，其所編碼的氨基酸序列為SEQ ID No.4所示；本發(fā)明公開了成熟的葡聚糖酶Cel16A，其氨基酸序列為SEQ ID No.2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQ ID No.1所示。本發(fā)明還公開了含有所述基因的重組表達載體和重組宿主細胞。本發(fā)明葡聚糖酶最適pH為5.5，在pH 4.0-10.0之間均很穩(wěn)定，最適溫度為55℃；本發(fā)明葡聚糖酶Cel16A穩(wěn)定性好，酶活高，能夠高效降解葡聚糖、地衣多糖或昆布多糖，可應(yīng)用于釀酒、紡織、飼料或能源工業(yè)等領(lǐng)域。
【專利說明】葡聚糖酶Cel16A及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及葡聚糖酶，尤其涉及從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分離的葡 聚糖酶Cell6A，本發(fā)明還涉及該酶的編碼基因及其應(yīng)用，屬于葡聚糖酶的分離及應(yīng)用技術(shù) 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素類物質(zhì)包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是自然界中最豐富的可再生資源。 纖維素是由D-吡喃式葡萄糖以0-1，4糖苷鍵連接而成的線性大分子聚合物，是植物細胞 壁的主要成分。木質(zhì)素是由苯基丙烷結(jié)構(gòu)單元通過碳-碳鍵和醚鍵連接而成的具有三度空 間結(jié)構(gòu)的芳香性高聚物，形成纖維支架，具有強化木質(zhì)纖維的作用。半纖維素由雜聚多糖 組成，根據(jù)主鏈組成占多數(shù)的糖的種類各有不同，可分為葡聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖等 (SchulzeE1891.BerDtschChemGes24, 2277-2287.)。其中 葡聚糖是植物細胞壁中 的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，富含于單子葉禾本科植物的糊粉層和胚乳細胞中，如大麥和燕麥胚 乳細胞壁含有約70?75%的葡聚糖（PhilippeSetal. 2006.Planta224(2),449-461.)。
[0003] e-葡聚糖酶是內(nèi)切e-1，3、e-1，4-葡聚糖酶和外切e-1，3、e-1，4葡聚糖酶 的總稱。它作用于葡聚糖的0-1，3和0-1，4糖苷鍵，使葡聚糖分解成還原糖和 寡糖。在飼料加工業(yè)中，葡聚糖酶通過降解葡聚糖，使其降解為低分子量片段，失 去親水性和粘性。改變單胃動物腸道內(nèi)容物的特性，提高內(nèi)源性消化酶活性，改變腸道微生 物環(huán)境，利于動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高生長性能和飼料的轉(zhuǎn)化率（MathlouthiN etal. 2002.AminRes51,395-406.)在食品和飼料工業(yè)等方面有廣闊的應(yīng)用前景。在啤酒 加工業(yè)中，3 -葡聚糖酶能高效地將麥芽中的3 -葡聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細胞 壁，使細胞內(nèi)容物大量地釋放出來，提高麥芽汁得率，降低醪液粘度從而縮短糖化醪過濾時 間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤淺，泡沫均勻持久。因此，將葡聚糖酶用于啤酒糖 化和發(fā)酵過程，可節(jié)約用糧，降低成本，提高糖化過濾設(shè)備的效能，有利于啤酒的質(zhì)量提高 及穩(wěn)定（宮春波等，2002,廣州食品工業(yè)科技）。
[0004] 由于不同工業(yè)對葡聚糖酶需求的不同，因此，獲得新型具有優(yōu)良特性的葡 聚糖酶仍具有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分 離的葡聚糖酶Cel16A，該酶在pH4?10范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，并且具有較高的葡聚糖 酶活性。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明首先公開了從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分離的葡聚糖酶 Cell6A的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、⑷或（e)所示：
[0008] (a)、SEQIDNo.1所示的多核苷酸；或
[0009](b)、編碼SEQIDNo. 2所示氨基酸的多核苷酸；或
[0010] (C)、與SEQIDNo.1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；或
[0011] (d)、與SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 1所示的 多核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚 糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源 性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與 SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼 蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 1所示的多核苷酸至少 有98%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的 功能；或
[0012] (e)、在SEQIDNo. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進行一個或多個堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
[0013] 所述編碼基因編碼的成熟的葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0014](a)、SEQIDNo. 2 所示的氨基酸；
[0015] (b)、將SEQIDNo. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
[0016] 本發(fā)明還公開了從特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)中分離的葡聚糖酶Cell6A 的編碼基因，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示：
[0017](a)、SEQIDNo. 3所示的多核苷酸；或
[0018] (b)、編碼SEQIDNo. 4所示氨基酸的多核苷酸；或
[0019](c)、與SEQIDNo. 3的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；或
[0020] (d)、與SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該 多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 3所示的 多核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡 聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源 性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與 SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼 蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQIDNo. 3所示的多核苷酸至少 有98%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的 功能；或
[0021] (e)、在SEQIDNo. 3所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進行一個或多個堿基的缺失、取代 或插入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
[0022] 所述編碼基因編碼的葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序列為（a)或（b)所示：
[0023](a)、SEQIDNo. 4 所示的氨基酸；
[0024] (b)、將SEQIDNo. 4所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
[0025] 本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本 領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備葡聚糖酶Cell6A的氨基酸序列變體或片段，其 中用于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘 基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的葡聚糖酶Cell6A及其編碼基因包 括天然存在的序列和變體兩種形式。"變體"意指基本相似的序列，對于多核苷酸，變體包含 天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和替換。對于多核 苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸 如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來 源的多核苷酸，例如采用定點誘變所得到的仍編碼SEQIDNo. 2或SEQIDNo. 4所示的氨 基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法（例如DNA改組）。
[0026] 本發(fā)明通過PCR方法分離克隆了葡聚糖酶Cell6A的編碼基因，DNA全序列分析結(jié) 果表明，含有信號肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列全長861bp，編碼286個氨基酸和一 個終止密碼子，其核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNo. 4所 示；其N端20個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列，其氨基酸序列為SEQIDNo. 6所示，信號 肽的編碼序列為SEQIDNo. 5所示。不含有信號肽的成熟的葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序 列為SEQIDNo. 2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQIDNo. 1所示。因此，成熟的葡聚糖酶 Cell6A的理論分子量為30. 9kDa。
[0027] 將葡聚糖酶基因的cDNA序列（SEQIDNo. 1所示）及推導(dǎo)出的氨基酸序列（SEQ IDNo.2所不）在GenBank中進行BLAST比對，結(jié)果，該基因與來源于Chaetomiumglobosum CBS148. 51 的hypotheticalproteinCHGG_04043 氨基酸序列一致性為 68%。說明本發(fā) 明分離的葡聚糖酶Cell6A是一種新的葡聚糖酶。
[0028] 本發(fā)明還公開了含有所述葡聚糖酶Cell6A的編碼基因的重組表達載體，所述重 組表達載體優(yōu)選為pPIC_cell6A。
[0029] 將本發(fā)明的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點 之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施 方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因插入到質(zhì)粒pPIC9上的EcoRI和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于A0X1啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵 母表達質(zhì)粒pPIC_cell6A。
[0030] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 3所示的多核苷酸進行 優(yōu)化以增強在重組宿主細胞或重組菌株中的表達效率。例如，可采用目標(biāo)宿主細胞的偏愛 密碼子進行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強在目標(biāo)宿主細胞中的表達效率。
[0031] 本發(fā)明還公開了含有所述的重組表達載體的重組宿主細胞或重組菌株。
[0032] 其中，所述重組宿主細胞可為原核細胞或真核細胞；優(yōu)選的，所述重組宿主細胞為 畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞中的任意一種，優(yōu)選為畢赤酵母細胞；[0033] 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營養(yǎng)型酵母 菌株中的任意一種；其中，所述甲基營養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
[0034] 將所述多核苷酸或多肽引入重組宿主細胞的合適方法包括：電轉(zhuǎn)化法、原生質(zhì)體 法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法等，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。
[0035] 本發(fā)明還公開了一種制備所述葡聚糖酶Cell6A的方法，包括以下步驟：
[0036] (1)用含有所述葡聚糖酶Cel 16A編碼基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得重 組菌株；
[0037] (2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)葡聚糖酶Cell6A表達；
[0038] (3)回收并純化所表達的葡聚糖酶Cell6A。
[0039] 本發(fā)明將不含信號肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列插入到畢赤酵母表達載體 PPIC9上，使之位于a-因子信號肽下游，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC-cell6A，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115,獲得重組畢赤酵母菌株GS115/cell6A。測得葡聚糖酶Cell6A的表達量為150. 6U/ mL。SDS-PAGE結(jié)果表明，葡聚糖酶Cell6A在畢赤酵母中得到了分泌表達；重組葡聚糖酶 Cell6A的比活為 693. 3U/mg。
[0040] 葡聚糖酶Cell6A的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定結(jié)果表明，本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A 的最適pH為5. 5,在pH4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性 在50%左右。葡聚糖酶Cell6A的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，葡聚糖酶Cell6A最 適溫度為551：。葡聚糖酶(^1164在501：下溫育111，酶活力仍保留80%左右。葡聚糖酶 Cell6A的&值的測定結(jié)果表明，以大麥葡聚糖為底物時的Km值為0.91mg/mL，最大反應(yīng)速 度為1530. 2limol/min?mg。不同金屬離子化學(xué)試劑對葡聚糖酶Cell6A酶活的影響測 定結(jié)果表明，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為ImM或者10mM時葡聚糖酶Cel16A的活力沒 有明顯變化。但是Ag+完全阻斷其活力；Cu2+在ImM時對葡聚糖酶Cell6A的酶活力影響不 明顯，而在濃度為10mM時可強烈抑制其活力。
[0041] 葡聚糖酶Cell6A除可作用于葡聚糖外，對于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解 作用。其對地衣多糖的降解能力相對于大麥葡聚糖的為42. 6%，其對昆布多糖的降解能力 相對于大麥葡聚糖的為16. 5%。
[0042] 本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A能有效地降解0 -葡聚糖，對于地衣多糖，昆布多糖也有 一定的降解作用，易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A或其編碼基因可廣泛應(yīng)用 于釀酒、紡織或能源工業(yè)等。例如在啤酒加工業(yè)中，本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A能高效地將麥 芽中的3 -葡聚糖水解為葡萄糖和低聚糖，摧毀細胞壁，使細胞內(nèi)容物大量地釋放出來，提 高麥芽汁得率，降低醪液粘度從而縮短糖化醪過濾時間，所獲麥汁清亮，使制得的啤酒色澤 淺，泡沫均勻持久。
[0043] 在飼料加工業(yè)中，本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A通過降解葡聚糖，使其降解為低分 子量片段，失去親水性和粘性，改變單胃動物腸道內(nèi)容物的特性，提高內(nèi)源性消化酶活性， 改變腸道微生物環(huán)境，利于動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，提高生長性能和飼料的轉(zhuǎn)化率。
[0044] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0045] 本發(fā)明葡聚糖酶Cell6A的最適pH為5. 5,在pH4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定，并且還 具有較高的葡聚糖酶活性，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在50%左右。葡聚糖酶 Cell6A最適溫度為55°C，在50°C下溫育lh，酶活力仍保留80%左右。葡聚糖酶Cell6A除 可作用于葡聚糖外，對于地衣多糖，昆布多糖也有一定的降解作用。因此，本發(fā)明葡聚糖酶 Ce116A可廣泛應(yīng)用于釀酒、紡織、飼料或能源工業(yè)等。
[0046] 本發(fā)明所渉及到的術(shù)語定義
[0047] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0048] 術(shù)語"多核苷酸"或"核苷酸"意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷 酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生 的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其 包括PNA(肽核酸）、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等）。除 非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體（包括（但不限于）簡 并密碼子取代）和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個 以上所選（或所有）密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡 并密碼子取代（Batzer等人，NucleicAcidRes. 19:5081 (1991) ;0htsuka等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和Cassol等人，（1992);Rossolini等人，MolCell.Probes 8:91-98(1994))。
[0049] 術(shù)語"嚴謹雜交條件"意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常， 在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高 (例如超過本底至少2倍）。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會不同， 較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針 100%互補的祀序列。對于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻（Tijssen,Techniquesin BiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes,"Overview ofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays. 1993)〇 更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強度pH下的熱熔點（Tm) 約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標(biāo)互補的探針雜交到目標(biāo)序列時所處的溫度（在指 定離子強度、pH和核酸濃度下）（因為目標(biāo)序列過量存在，所以在Tm下在平衡狀態(tài)下50% 的探針被占據(jù)）。嚴謹條件可為以下條件：其中在pH7. 0到8. 3下鹽濃度低于約1. 0M鈉離 子濃度，通常為約〇? 01到1. 0M鈉離子濃度（或其它鹽），并且溫度對于短探針（包括（但 不限于）10到50個核苷酸）而言為至少約30°C，而對于長探針（包括（但不限于）大于50 個核苷酸）而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。對 于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。 例示性嚴謹雜交條件可如下：50%甲酰胺，5XSSC和1%SDS，在42°C下培養(yǎng)；或5XSSC， 1%SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2XSSC中洗滌和在65°C下于0. 1%SDS中洗滌。所述洗滌可 進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。
[0050] 術(shù)語"重組宿主細胞株"或"宿主細胞"意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管 使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對或所屬領(lǐng)域中已 知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組 中。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。
[0051] 術(shù)語"啟動子"意指存在于目的基因編碼序列的上游，提供RNA聚合酶和正確轉(zhuǎn)錄 起始所必需的其它因子的識別位點，啟動或指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄為mRNA。
[0052] 術(shù)語"可操作的連接"意指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的 元件可為鄰接或非鄰接的。
[0053] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"意指將異源性DNA序列引入到宿主細胞或有機體的方法。
[0054] 術(shù)語"表達"意指內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在細胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0055] 術(shù)語"比活力（性）"是酶純度的量度，意指單位重量的蛋白質(zhì)中所具有酶的活力 單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示；一般來說，酶的比活力越高，酶越純。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0056] 圖1為重組畢赤酵母菌株GS115/cell6A發(fā)酵濕重及酶活測定；
[0057] 圖2為SDS-PAGE檢測純化的葡聚糖酶Cell6A，其中，M為蛋白Marker;Cell6A為 葡聚糖酶Cell6A;
[0058] 圖3為葡聚糖酶Cel16A的最適pH測定結(jié)果；
[0059] 圖4為葡聚糖酶Cel16A的pH穩(wěn)定性測定結(jié)果；
[0060] 圖5為葡聚糖酶Cel16A的最適溫度測定結(jié)果；
[0061] 圖6為葡聚糖酶Cel16A的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果。

【具體實施方式】
[0062] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié) 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0063] 1、實驗材料和試劑
[0064] 1. 1菌株及載體
[0065] 特異腐質(zhì)霉（HumicolainsolensY1CGMCC 4573)從中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心分發(fā)，其保藏編號為：CGMCCNo. 4573。畢赤酵母表達載體pPIC9及菌 株GS115購自于Invitrogen公司。
[0066] 1. 2酶類及其它生化試劑
[0067] 內(nèi)切酶購自Fermentas公司，連接酶購自NEB公司。大麥葡聚糖購自Sigma公司， 其它都為國產(chǎn)試劑（均可從普通生化試劑公司購買得到）。1.3培養(yǎng)基
[0068] (l)Humicolainsolens產(chǎn)抱培養(yǎng)基為馬鈴暮培養(yǎng)基：
[0069] 1000mL 200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH5. 0。
[0070] (2)Humicolainsolens纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：
[0071] 3(^/1麥麩、3(^/1玉米芯粉、58/1(順4)504、18/1腿2?04、0.58/1]\%504.71120、 0? 01g/LFeS04 ? 7H20、0. 2g/LCaCl2。
[0072] (3)大腸桿菌培養(yǎng)基LB:
[0073] 1%蛋白胨、0? 5%酵母提取物、1%NaCl，pH7. 0。
[0074] (4)畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：
[0075]PTM微量鹽：0? 6 %CuS04,0? 008 %Nal2,0? 3 %MnS04,0? 02 %Na2Mo04,0? 002 % H3B03,0. 05%CoC12,2%ZnCl2,6. 5%FeS04,0. 5%硫酸（v/v)。
[0076] 酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（FBSM):
[0077] 0. 5%KH2P04,5%NH4H2P04,1. 48 5%MgS04,1. 82%K2S04,0 . 09 3%CaS04,0. 15% K0H，0. 00011%Biotin，0. 44%PTM微量鹽，2%葡萄糖。
[0078] 酵母發(fā)酵基礎(chǔ)鹽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（FBM):
[0079] 0. 5%KH2P04,5%NH4H2P04,1.485%MgS04,1.82 %K2S04,0 . 093 %CaS04,0. 15% K0H，0. 00011%Biotin，0.44%PTM微量鹽，0? 5%甲醇。
[0080]Na2HP04-檸檬酸緩沖液（0?lmol/LpH5. 2):
[0081] 0? 2mol/L憐酸氫二鈉 536ml，0?lmol/L朽1 樣酸 464ml，混勻后調(diào)pH至 5. 2。
[0082]說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0083] 實施例1特異腐質(zhì)霉（Humicolainsolens)葡聚糖酶編碼基因cell6AcDNA的克 隆
[0084] 提取特異腐質(zhì)霉在纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長2d時的菌體的總RNA，將其反轉(zhuǎn) 錄得到cDNA后，以此為模板，利用特異性引物Ce116AF(5 '-GGGGAATTCTGGGACGCCCCCTAT TACCATGGCTG-3' ）和Cell6AR(5'-GCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAATAACTGTAGTA TTGGGCAACATAG-3'），經(jīng)PCR擴增得到去除天然信號肽的葡聚糖酶基因cell6A的cDNA片 段，并克隆至pEASY-Blunt載體，測序驗證。
[0085]DNA全序列分析結(jié)果表明，含有信號肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列全長 861bp，編碼286個氨基酸和一個終止密碼子，其核苷酸序列為SEQIDNo. 3所示，其編碼的 氨基酸序列為SEQIDNo. 4所示；其N端20個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列，其氨基酸序 列為SEQIDNo. 6所示，信號肽的編碼序列為SEQIDNo. 5所示。不含有信號肽的成熟的 葡聚糖酶Cell6A，其氨基酸序列為SEQIDNo. 2所示，其編碼的核苷酸序列為SEQIDNo. 1 所示。因此，成熟的葡聚糖酶Cell6A的理論分子量為30. 9kDa。
[0086] 將葡聚糖酶基因的cDNA序列（SEQIDNo. 1所示）及推導(dǎo)出的氨基酸序列（SEQ IDNo.2所不）在GenBank中進行BLAST比對，結(jié)果，該基因與來源于Chaetomiumglobosum CBS148. 51 的hypotheticalproteinCHGG_04043 氨基酸序列一致性為 68%。說明本發(fā) 明分離的葡聚糖酶Cell6A是一種新的葡聚糖酶。
[0087] 實施例2葡聚糖酶Cel16A的制備
[0088] 將不含有信號肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列（SEQIDNo. 1所示）插入到畢 赤酵母表達載體PPIC9上，使之位于a-因子信號肽下游，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC-cell6A。
[0089]將表達載體pPIC9進行雙酶切（EcoRI+NotI)，同時將實施例1構(gòu)建的連接有不 含有信號肽序列的葡聚糖酶基因的cDNA序列的克隆載體雙酶切（EcoRI+NotI)，切出目的 片段與表達載體PPIC9連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC-cell6A并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組 畢赤酵母菌株GS115/cell6A。
[0090] 取含有重組質(zhì)粒的GS115菌株，先經(jīng)FBSM培養(yǎng)基培養(yǎng)使其快速生長48h后，再經(jīng) FBIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)84h后，取上清，測定葡聚糖酶的活力。發(fā)酵過程中取樣測定菌體濕 重及葡聚糖酶的活力，結(jié)果見圖1。葡聚糖酶Cell6A的表達量為150.6U/mL。發(fā)酵上清用 0. 1Um濾膜過濾雜質(zhì)，然后用賽托利斯10kD濾膜濃縮，濃縮液直接過Akta的His-Trap柱， 收集酶活峰。SDS-PAGE結(jié)果表明，葡聚糖酶Cell6A在畢赤酵母中得到了分泌表達（圖2)。
[0091] 采用DNS法進行葡聚糖酶Cell6A的活性分析：在pH6. 0,60°C條件下，lmL的反應(yīng) 體系包括100yL適當(dāng)?shù)南♂屆敢海▽嵤├?制備的葡聚糖酶Cel16A)，900i!L大麥葡聚糖 底物（1 % )，反應(yīng)l〇min，加入1. 5mLDNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測定0D值。 1個酶活單位（U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出lymol還原糖的酶量。實驗結(jié)果表 明，葡聚糖酶Cel16A的比活為693. 3U/mg。
[0092] 實施例3葡聚糖酶Cel16A的性質(zhì)測定
[0093] 以實施例2純化的葡聚糖酶Cell6A為研究對象，對該酶的相關(guān)性質(zhì)進行測定。
[0094] 1、葡聚糖酶Cell6A的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定
[0095] 將實施例2純化的葡聚糖酶Cell6A在不同pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。 底物大麥葡聚糖，在不同pH的0. 2mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中55°C下進行葡聚糖 酶活力測定。
[0096] 測定結(jié)果（圖3)表明，葡聚糖酶Cell6A的最適pH為5. 5。葡聚糖酶Cell6A于上 述各種不同pH的緩沖液中37°C處理60min，再在pH5. 5緩沖液體系中55°C下測定酶活性， 以研究酶的pH耐性。結(jié)果（圖4)表明，葡聚糖酶Cell6A在pH 4. 0-10. 0之間均很穩(wěn)定， 在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在50%左右。
[0097] 2、葡聚糖酶Cell6A的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定
[0098] 葡聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH5. 5)緩沖液體系 及不同溫度下進行酶促反應(yīng)。耐溫性測定為葡聚糖酶在不同溫度（50°C、55°C和60°C)下處 理不同時間，再在55°C下進行酶活性測定。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果（圖5)表明，葡聚糖 酶Cell6A最適溫度為55°C。酶的熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明（圖6)，葡聚糖酶Cell6A在50°C 下溫育lh，酶活力仍保留80%左右。
[0099] 3、葡聚糖酶Cell6A的I值的測定
[0100]用不同濃度的葡聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH5. 5)緩沖液體系 中，55 °C下測定酶活性，計算出其Km值。
[0101] 經(jīng)測定，以大麥葡聚糖為底物時的L值為0. 91mg/mL，最大反應(yīng)速度V_為 1530.2ymol/min?mg〇
[0102] 4、不同金屬離子化學(xué)試劑對葡聚糖酶Cell6A酶活的影響測定
[0103] 在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為ImM或者10mM。在55°C、pH5. 5條件下測定酶活性。
[0104] 結(jié)果表明（表1)，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為ImM或者10mM時葡聚糖酶 Cell6A的活力沒有明顯變化。但是Ag+完全阻斷其活力；Cu2+在ImM時對葡聚糖酶Cell6A 的酶活力影響不明顯，而在濃度為10mM時可強烈抑制其活力。
[0105] 表1不同金屬離子化學(xué)試劑對葡聚糖酶Cell6A酶活的影響
[0106]

【權(quán)利要求】
1. 從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因，其特征 在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 1所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cel 16A的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多 核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶 Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有90%或以上同源性的多 核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì) 仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 1所示的多核苷酸至少有98% 或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；或 (e) 、在SEQ ID No. 1所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
2. 權(quán)利要求1所述編碼基因編碼的葡聚糖酶Cell6A，其特征在于，其氨基酸序列為（a) 或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 2所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
3. 從特異腐質(zhì)霉（Humicola insolens)中分離的葡聚糖酶Cell6A的編碼基因，其特征 在于，其核苷酸序列為（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所示： (a) 、SEQ ID No. 3所示的多核苷酸；或 (b) 、編碼SEQ ID No. 4所示氨基酸的多核苷酸；或 (c) 、與SEQ ID No. 3的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷 酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cel 16A的功能；或 (d) 、與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有70%或以上同源性的多核苷酸，且該多 核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多 核苷酸至少有80%或以上同源性的多核苷酸序列，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚 糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有90%或以上同源 性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；優(yōu)選的，其與 SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少有95%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼 蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能；最優(yōu)選的，其與SEQ ID No. 3所示的多核苷酸至少 有98%或以上同源性的多核苷酸，且該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)仍具有葡聚糖酶Cell6A的 功能；或 (e) 、在SEQ ID No. 3所示的多核苷酸的基礎(chǔ)上進行一個或多個堿基的缺失、取代或插 入的多核苷酸變體，且該多核苷酸變體所編碼的蛋白仍具有葡聚糖酶Cell6A的功能。
4. 權(quán)利要求3所述編碼基因編碼的葡聚糖酶Cell6A，其特征在于，其氨基酸序列為（a) 或（b)所示： (a) 、SEQ ID No. 4所示的氨基酸； (b) 、將SEQ ID No. 4所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插 入而衍生得到的仍具有葡聚糖酶Cell6A功能的蛋白變體。
5. 含有權(quán)利要求1或3所述編碼基因的重組表達載體。
6. 按照權(quán)利要求5所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體優(yōu)選為 pPIC-cell6A。
7. 含有權(quán)利要求5或6所述的重組表達載體的重組宿主細胞或重組菌株。
8. 按照權(quán)利要求7所述的重組宿主細胞或重組菌株，其特征在于：所述重組宿主細胞 為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞中的任意一種，優(yōu)選為畢赤酵母細胞； 所述重組菌株選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬或甲基營養(yǎng)型酵母菌株 中的任意一種；其中，所述甲基營養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
9. 一種制備權(quán)利要求2或4所述葡聚糖酶Cel 16A的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 用權(quán)利要求5或6所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，獲得重組菌株； (2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)葡聚糖酶Cell6A表達； (3) 回收并純化所表達的葡聚糖酶Cell6A。
10. 權(quán)利要求1或3所述編碼基因或者權(quán)利要求2或4所述葡聚糖酶Cel 16A在降解葡 聚糖、地衣多糖或昆布多糖中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23K1/165GK104328133SQ201410528717
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】張偉, 徐欣欣, 李金陽, 張宇宏, 劉波 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所