一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法及保存方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法：對新鮮娩出胎盤立即進行預處理，然后分離出臍動脈和臍靜脈；用清洗液灌注胎盤絨毛血管，收集灌注后的清洗液；用酶消化液灌注胎盤絨毛血管，置37℃溫度下消化5～20min；用收集液灌注胎盤，收集灌注后的液體；將得到的液體離心，棄上清后重懸細胞；重懸的細胞懸液經(jīng)羥乙基淀粉和淋巴細胞分離液兩步法分離，得到本發(fā)明臨床應用級胎盤造血干細胞。該方法不僅能夠提高所制備的胎盤造血干細胞的數(shù)量、活力以及CD34陽性細胞的含量，而且是臨床應用級的，無潛在病原體污染，另外，該方法制備成本低。
【專利說明】一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法及保存方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，以及該制得的胎盤造血干細胞的保存方法。
【背景技術】
[0002]最新研究表明，胎盤中含有大量造血干細胞，同臍帶血中的造血干細胞一樣， 胎盤造血干細胞是高度未分化細胞，也可以說它是一切血細胞(其中大多數(shù)是免疫細
胞)的原始細胞，可以用來治療多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合癥、淋巴瘤等)、血紅蛋白病、骨髓造血功能衰竭(如再生障礙性貧血)、先天性代謝性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患等多種疾病。
[0003]胎盤中造血干細胞的含量是臍帶血中造血干細胞含量的10倍，足可供小孩自用幾次或I~2個成人患者使用I 一次，有效解決了移植時骨髓或動員后外周血來源不足，臍帶血數(shù)量不夠等技術難題，將有望取代骨髓、動員后外周血和臍帶血用于造血干細胞移植。
[0004]目前，從胎盤中提取造血干細胞的流程為:(I)先將整個胎盤或胎盤絨毛膜組織用機械法分解成小塊；(2)然后采用一種或幾種酶進行消化，消化后過濾；(3)最后采用羥乙基淀粉(HES)法或淋巴分離液法回收含有造血干細胞的單個核細胞，有些還會在離心分離后采取免疫磁珠、流式細胞等方法，富集造血干細胞?，F(xiàn)有技術存在以下缺陷:(1)分離得到的胎盤造血干細胞含量較低，如專利“從胎盤組織中提取造血干細胞用于建立造血干細胞庫的新方法”中提取的單核細胞數(shù)為2~4X 109，其中⑶34陽性的造血干細胞含量僅為0.3~0.7%，則⑶34陽性的造血干細胞數(shù)最多為2.8X IO7 ；(2)整個胎盤或胎盤絨毛膜組織體積都比較大，因此處理量大，不僅要用很大量的消化酶，增加了成本，而且還耗費時間，不利于細胞活性的保持。
[0005]另外，目前胎盤造血干細胞凍存液中大都添加血清或白蛋白等生物源性成份來保證凍存復蘇后干細胞的生長需要/保持干細胞的高存活率。但目前還沒有適合臨床應用的血清，血清含有大量未知成分，質量不易控制，用于異體輸注存在安全隱患，比如血清含有不能治愈的病毒或病原體，接受干細胞治療的病人便會因而染病，后果十分嚴重。而合適濃度的白蛋白雖然在一定時間內(nèi)也能保持細胞的高存活率，但目前所使用的白蛋白都是人源性或動物源性，存在安全隱患，不適合臨床應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對以上現(xiàn)有技術的不足，提供一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，該方法不僅能夠提高所制備的胎盤造血干細胞的數(shù)量、活力以及CD34陽性細胞的含量，而且是臨床應用級的，無潛在病原體污染，另外，該方法制備成本低。
[0007]本發(fā)明所采用的技術方案為:一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，包括以下步驟:
(1)對新鮮娩出胎盤立即進行預處理，然后分離出臍動脈和臍靜脈；
(2)用清洗液灌注胎盤絨毛血管，收集灌注后的清洗液；
(3)用酶消化液灌注胎盤絨毛血管，置37°C溫度下消化5~20min；
(4)用收集液灌注胎盤，收集灌注后的液體，該液體中包含了步驟(3)中消化后的酶消化液、灌注后的收集液；
(5)將步驟(2)、(4)得到的液體離心，棄上清后重懸細胞；
(6)重懸的細胞懸液經(jīng)羥乙基淀粉和淋巴細胞分離液兩步法分離，得到本發(fā)明臨床應用級胎盤造血干細胞。
[0008]本發(fā)明所述制備方法的起始階段，需要對胎盤進行預處理，這一措施屬于本領域公知常識，即對胎盤進行消毒、除去胎盤包膜以及洗滌的步驟，在這里便不再詳述。但是為爭取時間，以盡量保持造血干細胞的活力，本發(fā)明對新鮮娩出的胎盤需立即進行這些預處理過程。 [0009]所述步驟(2)中清洗液為抗生素含量100~1000mg/L的溶液，其中所述抗生素為青霉素、鏈霉素、頭孢氨芐、卡那霉素、慶大霉素、兩性霉素B、萬古霉素中的一種單獨使用或幾種聯(lián)合使用，配制抗生素的溶劑為生理鹽水或PBS或DEME培養(yǎng)液或本領域其它常規(guī)培養(yǎng)液；優(yōu)選為含青霉素、鏈霉素雙抗的DEME培養(yǎng)液，其中抗生素的濃度為100~300mg/L，青霉素、鏈霉素的加入比例為1:1。
[0010]上述清洗液的使用量為150~400ml。
[0011]對于酶消化技術，消化酶種類選擇、消化酶工作濃度、消化時間、消化酶的先后使用順序都會影響到最終得到的細胞數(shù)量。本發(fā)明所述步驟(3)中酶消化液為含有
0.03%~0.3%消化酶的溶液，其中所述消化酶為I型膠原酶、II型膠原酶、III型膠原酶、IV型膠原酶、V型膠原酶、胰蛋白酶中的一種單獨使用或幾種聯(lián)合使用，配制消化酶的溶劑為生理鹽水或PBS或DEME培養(yǎng)液或本領域其它常規(guī)培養(yǎng)液。如果采用多種消化酶，可以是多種消化酶同時作用，也可以選擇分開作用。
[0012]上述酶消化液優(yōu)選為0.08%~0.22% I型膠原酶和0.08%~0.22% II型膠原酶等比例混合、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液(使用該酶消化液時消化時間優(yōu)選為8~15min);進一步優(yōu)選為0.1% I型膠原酶和0.1% II型膠原酶等比例混合、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液(使用該酶消化液時消化時間優(yōu)選為12min )。
[0013]上述酶消化液的使用量為150~200ml。
[0014]上述酶消化液在使用前必須完全解凍，且預熱至37°C。
[0015]所述步驟(4)中收集液為生理鹽水或PBS或DEME培養(yǎng)液或本領域其它常規(guī)培養(yǎng)液；優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)液。
[0016]上述收集液的使用量為150~400ml。
[0017]本發(fā)明進一步提供上述制備所得的臨床應用級胎盤造血干細胞的保存方法:在臨床應用級胎盤造血干細胞中加入凍存液，所述凍存液為含10%DMS0、5%人重組白蛋白的DEME溶液，所述凍存液的加入量為20~40% (體積比)，然后直接凍存于_196°C。
[0018]本發(fā)明所用胎盤經(jīng)無菌采集，無菌運送，干細胞分離前檢測肝炎病毒及相應抗體、艾滋病抗體、梅毒，檢測合格后，從胎盤組織中無菌分離出造血干細胞，為了爭取時間、提高細胞活力，在分離的同時進行細菌和真菌檢測，分離得到的細胞立即進行造血干細胞定量檢測(⑶34)、造血干細胞活性檢測(臺盼蘭染色)，然后凍存，用上述方法獲得的胎盤造血干細胞含量高，細胞活性高，非常適用于臨床應用，安全有效。
[0019]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點和有益效果:
1、本發(fā)明采用灌注法從胎盤絨毛血管中提取造血干細胞，分離得到的CD34陽性的造血干細胞經(jīng)檢測數(shù)量多達1.2~1.6 X 109，效果明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術；
2、現(xiàn)有技術處理的是整個胎盤或胎盤絨毛膜組織，處理體積大，因此出于成本考慮，不會選用培養(yǎng)液作為組織清洗液和消化酶的配制溶液，而且體積大，消化酶的用量也大，而本發(fā)明處理的僅僅是胎盤絨毛血管，文獻報道胎盤動靜脈系統(tǒng)容積為152.5±45.3ml,因此所需用到的組織清洗液和消化酶非常少，就可以采用有利于保持細胞活性的培養(yǎng)液作為組織清洗液和消化酶的配制溶液，而且消化酶用量的減少，使最終成本降低；
3、本發(fā)明省去了現(xiàn)有技術中機械分解組織、消化后過濾等步驟，因此節(jié)省了制備時間，有利于細胞活力的保持；
4、本發(fā)明采用羥乙基淀粉和淋巴細胞分離液兩步法回收造血干細胞，回收效率更高；
5、本發(fā)明采用重組人白蛋白作為凍存液中的保護劑，該凍存液不含有生物源性成分，安全有效，不僅能夠維持胎盤造血干細胞活性，而且更有利于臨床應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1所示的是按本實施例酶消化方法A得到的⑶34+胎盤造血干細胞的流式鑒定結果圖；
圖2所示的是按本實施例酶消化方法B得到的CD34+胎盤造血干細胞的流式鑒定結果
圖；
圖3所示的是按本實施例酶消化方法C得到的CD34+胎盤造血干細胞的流式鑒定結果圖。
【具體實施方式】
[0021]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步具體描述。應該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學和技術術語具有與本發(fā)明所屬【技術領域】人員通常理解的相同含義。
[0022]實施例1:胎盤造血干細胞的獲得
1、無菌條件下采集正常順產(chǎn)或剖腹產(chǎn)者胎盤，立即進行預處理，然后分離出兩條臍動脈和一條臍靜脈，將連接注射器或恒流泵的穿刺針或小兒頭皮針刺入臍帶靜脈，用300ml含青霉素、鏈霉素雙抗的DEME培養(yǎng)液(抗生素的濃度為200mg/L，其中青霉素、鏈霉素的加入比例為1:1)作為清洗液灌注胎盤絨毛血管，收集灌注后的清洗液；
2、酶消化，為了更好地說明本發(fā)明的可實施性，這里列舉三種不同的消化方法進行具體說明，但本發(fā)明酶消化方法不局限于此:
酶消化方法A:用150ml經(jīng)37 C預熱的0.1%膠原酶I和0.1%膠原酶II等比例混合、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液灌注胎盤絨毛血管，然后鉗住兩條臍動脈和條條臍靜脈，置 37°C 消化 12min ；酶消化方法B:用150ml經(jīng)37 C預熱的0.2%膠原酶I和0.2%膠原酶II等比例混合、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液灌注胎盤絨毛血管，然后鉗住兩條臍動脈和一條臍靜脈，置37°C消化8min ；
酶消化方法C:用150ml經(jīng)37 C預熱的0.1%膠原酶1、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液先灌注胎盤絨毛血管，然后鉗住兩條臍動脈和一條臍靜脈，置37°C消化6min，然后放開鉗制，再用經(jīng)37 C預熱的0.1%膠原酶II消化液再灌注，血管鉗制后置37°C消化6min。
[0023]3、將兩條臍動脈置于收集管中，然后放開兩條臍動脈和一條臍靜脈的鉗制，用300ml DMHM培養(yǎng)液作為收集液從臍靜脈處進行灌注，收集灌注后的液體；
4、將步驟I和步驟3中得到的液體在10C以下，1500r/min,離心15min,棄上清,加入DEME培養(yǎng)液，吹打混勻。根據(jù)需要，可以重復離心洗滌幾次，以去除多余的組織碎片和紅細胞；
5、羥乙基淀粉沉降與淋巴細胞分離液兩步分離法分離:6%羥乙基淀粉與細胞懸液按
1:4體積比混合，10 C以下靜置30min,取上清液，10 C以下，1000r/min離心IOmin,去除上清液；用PBS重懸細胞沉淀后，將其緩慢加至含有等體積Ficoll分離液上，10 C以下，2000r/min離心20min,取中間白膜層,用PBS以1000r/min離心5min洗漆2次后用PBS重懸。
[0024]對上述制得的造血干細胞進行造血干細胞定量檢測(⑶34)和造血干細胞活性檢測(臺盼蘭染色)，造血干細胞數(shù)量達1.2~1.6X109，具體結果如表1、圖1-3所示。
[0025]表1:三種酶消化方法得到的造血干細胞數(shù)量: _
【權利要求】
1.一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)對新鮮娩出胎盤立即進行預處理，然后分離出臍動脈和臍靜脈； (2)用清洗液灌注胎盤絨毛血管，收集灌注后的清洗液； (3)用酶消化液灌注胎盤絨毛血管，置37°C溫度下消化5~20min； (4)用收集液灌注胎盤，收集灌注后的液體； (5)將步驟(2)、(4)得到的液體離心，棄上清后重懸細胞； (6)重懸的細胞懸液經(jīng)羥乙基淀粉和淋巴細胞分離液兩步法分離，得到本發(fā)明臨床應用級胎盤造血干細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中清洗液為抗生素含量100~1000mg/L的溶液,所述抗生素為青霉素、鏈霉素、頭孢氨芐、卡那霉素、慶大霉素、兩性霉素B、萬古霉素中的一種單獨使用或幾種聯(lián)合使用，配制抗生素的溶劑為生理鹽水或PBS或DEME培養(yǎng)液，所述清洗液的使用量為150~400ml ο
3.根據(jù)權利要求2所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中清洗液為含青霉素、鏈霉素雙抗的DEME培養(yǎng)液,抗生素的濃度為100~300mg/L,其中青霉素、鏈霉素的加入比例為1:1。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中酶消化液為含有0.03%~0.3%消化酶的溶液，所述消化酶為I型膠原酶、II型膠原酶、III型膠原酶、IV型膠原酶、V型膠原酶、胰蛋白酶中的一種單獨使用或幾種聯(lián)合使用，配制消化酶的溶劑為生理鹽水或PBS或DEME培養(yǎng)液，所述酶消化液的使用量為150 ~200ml ο
5.根據(jù)權利要求4所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中酶消化液為0.08%~0.22% I型膠原酶和0.08%~0.22% II型膠原酶等比例混合、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液，使用該酶消化液時消化時間為8~15min。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中酶消化液為0.1% I型膠原酶和0.1% II型膠原酶等比例混合、溶劑為DEME培養(yǎng)液的消化液，使用該酶消化液時消化時間為12min。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中酶消化液在使用前先經(jīng)過解凍，且預熱至37°C。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中收集液為生理鹽水或PBS或DEME培養(yǎng)液，所述收集液的使用量為150~400ml ο
9.根據(jù)權利要求8所述的一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中收集液為DMEM培養(yǎng)液。
10.權利要求1所 述的臨床應用級胎盤造血干細胞的保存方法，其特征在于:在制備得到的臨床應用級胎盤造血干細胞中加入凍存液，所述凍存液為含10%DMS0、5%人重組白蛋白的DEME溶液，所述凍存液的加入量為20~40%，然后凍存于_196°C。
【文檔編號】A01N1/02GK103789262SQ201410052577
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權日:2014年2月17日
【發(fā)明者】陳正琳, 夏佳音, 陳平 申請人:寧波普萊森特生物科技有限公司