一種多花黑麥草組培快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種多花黑麥草組培快繁方法。包括無菌實生苗的制備、無根系無菌分蘗叢生芽的制備、有根系無菌實生苗的制備和移栽，本發(fā)明所需儀器簡單，成本低廉，提高了經(jīng)濟效益。本發(fā)明所構(gòu)建的種子發(fā)芽培養(yǎng)、分蘗叢生芽培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和成苗移栽黑麥草組培苗快繁體系，能在2個月到3個月之間成苗，且提高了成活率，適用于規(guī)模化的生產(chǎn)。本發(fā)明通過采用莖基進行培養(yǎng)，大大提高了組培苗的成活率，縮短了培養(yǎng)周期。且本發(fā)明通過采用莖基進行培養(yǎng)大大擴展了多花黑麥草的組織培養(yǎng)取材范圍，促進了多花黑麥草組織培養(yǎng)的發(fā)展，使其更廣泛的用于規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】一種多花黑麥草組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種多花黑麥草組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多花黑麥草是重要的禾本科牧草，近年來，成為我國大力推廣的牧草以及草坪草種類，在我國畜牧業(yè)發(fā)展和城鄉(xiāng)美化中的作用越來越大。黑麥草分蘗多，產(chǎn)量高，質(zhì)地柔軟，綠期長，是良好的綠色飼料。另外，其根系發(fā)達，適生性強，耐踐踏，有耐鹽堿潛力，能增加土壤有機質(zhì)，改善土壤結(jié)構(gòu)，防止水土流失，是很好的草坪草。為適應(yīng)黑麥草育種工作的需要，保存和快速繁殖優(yōu)質(zhì)原始材料，以及為有關(guān)黑麥草基因表達的生理生態(tài)研究適時提供可靠的研究材料，黑麥草的離體培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)受到越來越多的重視。目前有關(guān)黑麥草的組織培養(yǎng)僅限于種子誘導(dǎo)愈傷和植株再生，以及用原生質(zhì)體、幼穗、莖尖等作外植體誘導(dǎo)愈傷組織或叢生芽的形成，但誘導(dǎo)時間長、增殖速度慢、成苗周期長，組培快繁技術(shù)還不成熟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對上述問題的不足，提供一種多花黑麥草組培快繁方法，其培養(yǎng)方法簡便易行，培養(yǎng)周期短。
[0004]本發(fā)明為解決上述問題 所采用的技術(shù)方案是:一種多花黑麥草組培快繁方法，包括無菌實生苗的制備、無根系無菌分蘗叢生芽的制備、有根系無菌實生苗的制備和移栽；
所述無根系無菌分蘗叢生芽的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，選取健壯的無菌實生苗，并將其置于無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下先剪去無菌實生苗的根系，然后在根莖結(jié)合處向上Icm的位置切割，得到莖基，將得到的莖基放于組培瓶內(nèi)的生芽培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使根部沒入生芽培養(yǎng)基中，然后蓋緊組培瓶蓋子；再將組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光強為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~35天后，單個莖基萌發(fā)出高6^10cm,數(shù)量為8~20個的分蘗叢生芽，得分蘗叢生芽，然后從中選取數(shù)量為18~48個的分蘗叢生芽作為無根系無菌分蘗叢生芽；
所述有根系無菌實生苗的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，取出制得的無根系無菌分蘗叢生芽，并置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過的醫(yī)用手術(shù)刀切除叢生芽上部的多余葉片，留下長2~3cm的叢生芽，然后在分蘗節(jié)處縱向切割，將其分割成完整的單芽，然后將單芽根部向下輕放于組培瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基表面，輕壓使其根部沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊瓶蓋，將接種后的組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15~25天后，幼苗基部長出6~10根須根，得無菌實生苗。
[0005]所述無菌實生苗的制備方法為選取完整成熟的黑麥草種子，放入自來水中浸泡
0.5^1h,然后在超凈工作臺內(nèi)，將黑麥草種子轉(zhuǎn)移至無菌瓶內(nèi)，先用體積百分比分數(shù)為75%的酒精將黑麥草種子消毒3(T60s，再用無菌水沖洗2~3遍，之后放入質(zhì)量百分比濃度為
0.1%的升汞中浸泡消毒6~8min，用無菌水沖洗4飛遍后，得到無菌種子，在超凈工作臺內(nèi)，將得到的無菌種子放入無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下輕放于無菌基本培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使種子沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊組培瓶蓋子，將組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為100(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20-35天后，得到高度為5、cm的無菌實生苗。
[0006]所述移栽的方法為將蛭石和草炭土按3:1的重量比混合，得混合基質(zhì)，攪拌均勻后，備用;
從培養(yǎng)基中取出制備的的有根系的無菌實生苗，用清水洗掉根部殘余的培養(yǎng)基，并置于混合基質(zhì)中，使根系完全沒入混合基質(zhì)中，在溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，再置于溫度為23~27°C的玻璃溫室中，在自然光照下培養(yǎng)6~7天后，即可成苗。
[0007]所述無菌基本培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2, 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2.EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4 , 7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4? 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4? 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 _ 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4 a 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 ? 2H20 0.25 mg/L、CuSO4 a 5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，之后加入15g蔗糖和3.2g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，得到未消毒的基本培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的基本培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到透明狀的無菌固體基本培養(yǎng)基。
[0008]所述生芽培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:母液A由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H20和CaCl2? 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4 - 7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4 β 7Η20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4.4H20 22.3 mg/L、ZnSO4 邏 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加 熱煮沸，直至呈半透明狀，然后加入0.9mg的6-BA和0.09mg的NAA，并攪勻，得到未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液，備用。
[0009]步驟四:將步驟三制得的未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生芽培養(yǎng)基。
[0010]所述生根培養(yǎng)基的配置方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4 - 7H20和CaCl2, 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4 - 7H20 370 mg/L、CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4 , 7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4 通 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4, 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4 β 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 # 2H20 0.25 mg/L、CuSO4 ? 5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L,并放入燒杯中加熱煮沸，再加入15g蔗糖和3.1~3.25g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，然后加入0.7mg的IBA和0.09mg的NAA，并攪拌均勻，得到未消毒的生根培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的生根培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生根培養(yǎng)基。
[0011]有益效果
1、本發(fā)明所需儀器簡單，成本低廉，提高了經(jīng)濟效益。
[0012]2、本發(fā)明所構(gòu)建的種子發(fā)芽培養(yǎng)、分蘗叢生芽培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和成苗移栽黑麥草組培苗快繁體系，能在2個月到3個月之間成苗，且提高了成活率，適用于規(guī)?；纳a(chǎn)。
[0013]3、本發(fā)明通過采用莖基進行培養(yǎng)，大大提高了組培苗的成活率，縮短了培養(yǎng)周期。且本發(fā)明通過采用莖基進行培養(yǎng)大大擴展了多花黑麥草的組織培養(yǎng)取材范圍，促進了多花黑麥草組織培養(yǎng)的 發(fā)展，使其更廣泛的用于規(guī)?；a(chǎn)。
【具體實施方式】
[0014]一種多花黑麥草組培快繁方法，包括無菌實生苗的制備、無根系無菌分蘗叢生芽的制備、有根系無菌實生苗的制備和移栽；
所述無根系無菌分蘗叢生芽的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，選取健壯的無菌實生苗，并將其置于無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下先剪去無菌實生苗的根系，然后在根莖結(jié)合處向上Icm的位置切割，得到莖基，將得到的莖基放于組培瓶內(nèi)的生芽培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使根部沒入生芽培養(yǎng)基中，然后蓋緊組培瓶蓋子；再將組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光強為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~35天后，單個莖基萌發(fā)出高6^10cm,數(shù)量為8~20個的分蘗叢生芽，得分蘗叢生芽，然后從中選取數(shù)量為18~48個的分蘗叢生芽作為無根系無菌分蘗叢生芽；
所述有根系無菌實生苗的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，取出制得的無根系無菌分蘗叢生芽，并置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過的醫(yī)用手術(shù)刀切除叢生芽上部的多余葉片，留下長2~3cm的叢生芽，然后在分蘗節(jié)處縱向切割，將其分割成完整的單芽，然后將單芽根部向下輕放于組培瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基表面，輕壓使其根部沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊瓶蓋，將接種后的組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15~25天后，幼苗基部長出6~10根須根，得無菌實生苗。。
[0015]所述無菌實生苗的制備方法為選取完整成熟的黑麥草種子，放入自來水中浸泡
0.5^1h,然后在超凈工作臺內(nèi)，將黑麥草種子轉(zhuǎn)移至無菌瓶內(nèi)，先用體積百分比分數(shù)為75%的酒精將黑麥草種子消毒3(T60s，再用無菌水沖洗2~3遍，之后放入質(zhì)量百分比濃度為0.1%的升汞中浸泡消毒6~8min，用無菌水沖洗4飛遍后，得到無菌種子，在超凈工作臺內(nèi)，將得到的無菌種子放入無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下輕放于無菌基本培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使種子沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊組培瓶蓋子，將組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為100(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20-35天后，得到高度為5、cm的無菌實生苗。
[0016]所述移栽的方法為將蛭石和草炭土按3:1的重量比混合，得混合基質(zhì)，攪拌均勻后，備用;
從培養(yǎng)基中取出制備的的有根系的無菌實生苗，用清水洗掉根部殘余的培養(yǎng)基，并置于混合基質(zhì)中，使根系完全沒入混合基質(zhì)中，在溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，再置于溫度為23~27°C的玻璃溫室中，在自然光照下培養(yǎng)6~7天后，即可成苗。
[0017]所述無菌基本培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2, 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4 * 7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4 # 7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4 , 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L、CuSO4 e 5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，之后加入15g蔗糖和3.2g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，得到未消毒的基本培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的基本培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到透明狀的無菌固體基本培養(yǎng)基。
[0018]所述生芽培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L,MgSO4,7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA.2H20和FeSO4.7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA.2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3^MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2.6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4.4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 , 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試 劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，直至呈半透明狀，然后加入0.9mg的6-BA和0.09mg的NAA，并攪勻，得到未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液，備用。
[0019]步驟四:將步驟三制得的未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生芽培養(yǎng)基。
[0020]所述生根培養(yǎng)基的配置方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA ? 2H20和FeSO4? 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3^MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 β 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 , 2H20 0.25 mg/L、CuSO4 e 5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L,并放入燒杯中加熱煮沸，再加入15g蔗糖和3.1~3.25g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，然后加入0.7mg的IBA和0.09mg的NAA，并攪拌均勻，得到未消毒的生根培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的生根培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生根培養(yǎng)基。
[0021]實施例1
一種多花黑麥草組培快繁方法，包括無菌實生苗的制備、無根系無菌分蘗叢生芽的制備、有根系無菌實生苗的制備和移栽；
所述無根系無菌分蘗叢生芽的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，選取健壯的無菌實生苗，并將其置于無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下先剪去無菌實生苗的根系，然后在根莖結(jié)合處向上Icm的位置切割，得到莖基，將得到的莖基放于組培瓶內(nèi)的生芽培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使根部沒入生芽培 養(yǎng)基中，然后蓋緊組培瓶蓋子；再將組培瓶置于溫度為23°C，光照時間為16h/d，光強為1500Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天后，單個莖基萌發(fā)出高6cm，數(shù)量為8個的分蘗叢生芽，得分蘗叢生芽，然后從中選取數(shù)量為18、8個的分蘗叢生芽作為無根系無菌分蘗叢生芽；
所述有根系無菌實生苗的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，取出制得的無根系無菌分蘗叢生芽，并置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過的醫(yī)用手術(shù)刀切除叢生芽上部的多余葉片，留下長2cm的叢生芽，然后在分蘗節(jié)處縱向切割，將其分割成完整的單芽，然后將單芽根部向下輕放于組培瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基表面，輕壓使其根部沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊瓶蓋，將接種后的組培瓶置于溫度為23°C，光照時間為16h/d，光照強度為1500LX的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天后，幼苗基部長出6~10根須根，得無菌實生苗。
[0022]所述無菌實生苗的制備方法為選取完整成熟的黑麥草種子，放入自來水中浸泡
0.5h，然后在超凈工作臺內(nèi)，將黑麥草種子轉(zhuǎn)移至無菌瓶內(nèi)，先用體積百分比分數(shù)為75%的酒精將黑麥草種子消毒30s，再用無菌水沖洗2遍，之后放入質(zhì)量百分比濃度為0.1%的升汞中浸泡消毒6min，用無菌水沖洗4遍后，得到無菌種子，在超凈工作臺內(nèi)，將得到的無菌種子放入無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下輕放于無菌基本培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使種子沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊組培瓶蓋子，將組培瓶置于溫度為23°C，光照時間為16h/d，光照強度為1000Lx的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20天后，得到高度為5cm的無菌實生苗。
[0023]所述移栽的方法為將蛭石和草炭土按3:1的重量比混合，得混合基質(zhì)，攪拌均勻后，備用;
從培養(yǎng)基中取出制備的的有根系的無菌實生苗，用清水洗掉根部殘余的培養(yǎng)基，并置于混合基質(zhì)中，使根系完全沒入混合基質(zhì)中，在溫度為23°C，光照時間為16h/d，光照強度為1500Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，再置于溫度為23°C的玻璃溫室中，在自然光照下培養(yǎng)6天后，即可成苗。
[0024]所述無菌基本培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2, 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4 β 7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2.EDTA.2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3^MnSO4 , 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4.7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4.2H20 0.25 mg/L、CuSO4 e 5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，之后加入15g蔗糖和3.2g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，得到未消毒的基本培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的基本培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到透明狀的無菌固體基本培養(yǎng)基。
[0025]所述生芽培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4 , 7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeS04--7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4, 4H20、ZnSO4? 7H20、Na2MoO4? 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4, 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 , 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ； 母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，直至呈半透明狀，然后加入0.9mg的6-BA和0.09mg的NAA，并攪勻，得到未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液，備用。
[0026]步驟四:將步驟三制得的未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生芽培養(yǎng)基。
[0027]所述生根培養(yǎng)基的配置方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2.EDTA.2H20和FeSO4.7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 , 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L,并放入燒杯中加熱煮沸，再加入15g蔗糖和3.1-3.25g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，然后加入0.7mg的IBA和0.09mg的NAA，并攪拌均勻，得到未消毒的生根培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的生根培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生根培養(yǎng)基。
[0028]結(jié)果表明，采用本方法用70天即可成苗，且成活率為94%。
[0029]實施例2
一種多花黑麥草組培快繁方法，包括無菌實生苗的制備、無根系無菌分蘗叢生芽的制備、有根系無菌實生苗的制備和移栽；
所述無根系無菌分蘗叢生芽的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，選取健壯的無菌實生苗，并將其置于無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下先剪去無菌實生苗的根系，然后在根莖結(jié)合處向上Icm的位置切割，得到莖基，將得到的莖基放于組培瓶內(nèi)的生芽培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使根部沒入生芽培養(yǎng)基中，然后蓋緊組培瓶蓋子；再將組培瓶置于溫度為27°C，光照時間為16h/d，光強為2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天后，單個莖基萌發(fā)出高10cm，數(shù)量為20個的分蘗叢生芽，得分蘗叢生芽，然后從中選取數(shù)量為48個的分蘗叢生芽作為無根系無菌分蘗叢生芽；
所述有根系無菌實生苗的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，取出制得的無根系無菌分蘗叢生芽，并置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過的醫(yī)用手術(shù)刀切除叢生芽上部的多余葉片，留下長3cm的叢生芽，然后在分蘗節(jié)處縱向切割，將其分割成完整的單芽，然后將單芽根部向下輕放于組培瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基表面，輕壓使其根部沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊瓶蓋，將接種后的組培瓶置于溫度為27°C，光照時間為16h/d，光照強度為2000LX的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天后，幼苗基部長出6~10根須根，得無菌實生苗。
[0030]所述無菌實生苗的制備方法為選取完整成熟的黑麥草種子，放入自來水中浸泡lh，然后在超凈工作臺內(nèi)，將黑麥草種子轉(zhuǎn)移至無菌瓶內(nèi)，先用體積百分比分數(shù)為75%的酒精將黑麥草種子消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3遍，之后放入質(zhì)量百分比濃度為0.1%的升汞中浸泡消毒6~8min，用無菌水沖洗6遍后，得到無菌種子，在超凈工作臺內(nèi)，將得到的無菌種子放入無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下輕放于無菌基本培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使種子沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊組培瓶蓋子，將組培瓶置于溫度為27°C，光照時間為16h/d，光照強度為2000LX的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)35天后，得到高度為8cm的無菌實生苗。
[0031]所述移栽的方法為將蛭石和草炭土按3:1的重量比混合，得混合基質(zhì)，攪拌均勻后，備用;
從培養(yǎng)基中取出制備的的有根系的無菌實生苗，用清水洗掉根部殘余的培養(yǎng)基，并置于混合基質(zhì)中，使根系完全沒入混合基質(zhì)中，在溫度為27°C，光照時間為16h/d，光照強度為2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，再置于溫度為27°C的玻璃溫室中，在自然光照下培養(yǎng)7天后，即可成苗。
[0032]所述無菌基本培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4 - 7H20和CaCl2? 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA.2H20和FeSO4.7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2.EDTA ?2H20 37.3 mg/L、FeSO4 , 7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4.4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 ? 2H20 0.25 mg/L、CuSO4 e 5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放 入燒杯中加熱煮沸，之后加入15g蔗糖和3.2g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，得到未消毒的基本培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的基本培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到透明狀的無菌固體基本培養(yǎng)基。
[0033]所述生芽培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2，EDTA.2H20和FeSO4.7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2.EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 ? 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4 β 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 _ 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，直至呈半透明狀，然后加入0.9mg的6-BA和0.09mg的NAA，并攪勻，得到未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液，備用。
[0034]步驟四:將步驟三制得的未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生芽培養(yǎng)基。
[0035]所述生根培養(yǎng)基的配置方法，包括以下步驟:
步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2, 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L,KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L,CaCl2,2H20 440 mg/L ；
母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2.EDTA ,2H20 37.3 mg/L、FeSO4 , 7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4? 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4? 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 _ 4H20 22.3 mg/L、ZnSO4 a 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 ? 2H20 0.25 mg/L、CuSO4 a 5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H200.025 mg/L ；
母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ；
母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ；
步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；
步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L,并放入燒杯中加熱煮沸，再加入15g蔗糖和3.25g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，然后加入0.7mg的IBA和0.09mg的NAA,并攪拌均勻，得到未消毒的生根培養(yǎng)基溶液，備用；
步驟四:將步驟三制得的未消毒的生根培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生根培養(yǎng)基。
[0036]結(jié)果表明，采用本方法用75天即可成苗，且成活率為92%。
【權(quán)利要求】
1.一種多花黑麥草組培快繁方法，包括無菌實生苗的制備、無根系無菌分蘗叢生芽的制備、有根系無菌實生苗的制備和移栽，其特征在于: 所述無根系無菌分蘗叢生芽的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，選取健壯的無菌實生苗，并將其置于無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下先剪去無菌實生苗的根系，然后在根莖結(jié)合處向上Icm的位置切割，得到莖基，將得到的莖基放于組培瓶內(nèi)的生芽培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使根部沒入生芽培養(yǎng)基中，然后蓋緊組培瓶蓋子；再將組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光強為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~35天后，單個莖基萌發(fā)出高6^10cm,數(shù)量為8~20個的分蘗叢生芽，得分蘗叢生芽，然后從中選取數(shù)量為18~48個的分蘗叢生芽作為無根系無菌分蘗叢生芽； 所述有根系無菌實生苗的制備方法為:在超凈工作臺內(nèi)，取出制得的無根系無菌分蘗叢生芽，并置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌過的醫(yī)用手術(shù)刀切除叢生芽上部的多余葉片，留下長2~3cm的叢生芽，然后在分蘗節(jié)處縱向切割，將其分割成完整的單芽，然后將單芽根部向下輕放于組培瓶內(nèi)的生根培養(yǎng)基表面，輕壓使其根部沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊瓶蓋，將接種后的組培瓶置于溫度為23~27 °C，光照時間為16h/d，光照強度為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15~25天后，幼苗基部長出6~10根須根，得無菌實生苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多花黑麥草組培快繁方法，其特征在于:所述無菌實生苗的制備方法為選取完整成熟的黑麥草種子，放入自來水中浸泡0.5~lh，然后在超凈工作臺內(nèi)，將黑麥草種子轉(zhuǎn)移至無菌瓶內(nèi)，先用體積百分比分數(shù)為75%的酒精將黑麥草種子消毒3(T60s，再用無菌水沖洗2~3遍，之后放入質(zhì)量百分比濃度為0.1%的升汞中浸泡消毒6~8!^11，用無菌水沖洗4飛遍后，得到無菌種子，在超凈工作臺內(nèi)，將得到的無菌種子放入無菌培養(yǎng)皿中，在無菌條件下輕放于無菌基本培養(yǎng)基表面，然后輕壓，使種子沒入培養(yǎng)基中，接種完后蓋緊組培瓶蓋子，將組培瓶置于溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為100(T2000LX的光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20~35天后，得到高度為5~8cm的無菌實生苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多花黑麥草組培快繁方法，其特征在于:所述移栽的方法為將蛭石和草炭土按 3:1的重量比混合，得混合基質(zhì)，攪拌均勻后，備用； 從培養(yǎng)基中取出制備的的有根系的無菌實生苗，用清水洗掉根部殘余的培養(yǎng)基，并置于混合基質(zhì)中，使根系完全沒入混合基質(zhì)中，在溫度為23~27°C，光照時間為16h/d，光照強度為150(T2000Lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，再置于溫度為23~27°C的玻璃溫室中，在自然光照下培養(yǎng)6~7天后，即可成苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多花黑麥草組培快繁方法，其特征在于，所述無菌基本培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟: 步驟一:母液的配置: 母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L、CaCl2.2H20440 mg/L ； 母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ?2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3^MnSO4, 4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 , 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4.4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 , 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H20.0.025 mg/L ； 母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ； 母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ； 步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用； 步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，之后加入15g蔗糖和3.2g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，得到未消毒的基本培養(yǎng)基溶液，備用； 步驟四:將步驟三制得的未消毒的基本培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到透明狀的無菌固體基本培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多花黑麥草組培快繁方法，其特征在于，所述生芽培養(yǎng)基的配制方法，包括以下步驟: 步驟一:母液的配置: 母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2, 2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、MgSO4.7H20 370 mg/L、CaCl2.2H20.440 mg/L ； 母液B由Na2 , EDTA , 2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2.EDTA.2H20 37.3 mg/L、FeSO4 # 7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3' MnSO4.4H20、ZnSO4, 7H20、Na2MoO4, 2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2 ? 6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4 .4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 e 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2 , 6H20.0.025 mg/L ； 母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ； 母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ； 步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用；步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L，并放入燒杯中加熱煮沸，直至呈半透明狀，然后加入0.9mg的6-BA和0.09mg的NAA，并攪勻，得到未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液，備用； 步驟四:將步驟三制得的未消毒的生芽培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生芽培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多花黑麥草組培快繁方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基的配置方法，包括以下步驟: 步驟一:母液的配置:
母液A由KNO3、NH4NO3、KH2P04、MgSO4.7H20和CaCl2.2H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為 KNO3 1900 mg/L,NH4NO3 1650 mg/L、KH2PO4 170 mg/L、MgSO4 * 7H20 370 mg/L、CaCl2 , 2H20.440 mg/L ； 母液B由Na2 ? EDTA--2H20和FeSO4, 7H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度為Na2 , EDTA ,.2H20 37.3 mg/L、FeSO4.7H20 27.8 mg/L ；
母液 C 由 K1、H3BO3^MnSO4, 4H20、ZnSO4.7H20、Na2MoO4.2H20、CuSO4, 5H20、CoCl2.6H20組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為KI 0.83mg/L、H3BO3 6.2 mg/L、MnSO4.4H20 22.3 mg/L、ZnSO4, 7H20 8.6 mg/L、Na2MoO4 , 2H20 0.25 mg/L、CuSO4.5H20 0.025mg/L、CoCl2.6H20.0.025 mg/L ； 母液D由甘氨酸、鹽酸硫胺素VB1、鹽酸吡哆醇VB6和煙酸組成，其中各組分的質(zhì)量濃度分別為甘氨酸2 mg/L、鹽酸硫胺素VBl 0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L、煙酸0.5mg/L ； 母液E由肌醇組成，且肌醇的質(zhì)量濃度為100 mg/L ； 步驟二:將步驟一中母液A的各試劑質(zhì)量濃度擴大20倍，并定容到IL ;母液B的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并調(diào)pH值為5.5，定容至1L，保存于棕色玻璃瓶中；母液C中的各試劑質(zhì)量濃度擴大100倍，并定容至0.5L ;母液D中的各試劑質(zhì)量濃度擴大200倍，并定容至IL ;母液E中的各試劑質(zhì)量濃度擴大50倍，并定容至0.5L，備用； 步驟三:取步驟二制得的母液A中的各試劑分別25ml，步驟二制得的母液B中的各試劑分別5ml，步驟二制得的母液C中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液D中的各試劑分別2.5ml，步驟二制得的母液E中的各試劑分別5ml，將稱取的以上成分混合后用蒸餾水定容至0.5L,并放入燒杯中加熱煮沸，再加入15g蔗糖和3.3.25g瓊脂粉，繼續(xù)加熱并不斷攪拌，直至呈半透明狀，然后加入0.7mg的IBA和0.09mg的NAA，并攪拌均勻，得到未消毒的生根培養(yǎng)基溶液，備用； 步驟四:將步驟三制得的未消毒的生根培養(yǎng)基溶液趁熱裝于培養(yǎng)瓶中，蓋緊瓶蓋后置于高壓滅菌鍋中進行高壓滅菌，15min后取出靜置并冷卻，得到無菌固體生根培養(yǎng)基。
【文檔編號】A01H4/00GK103749298SQ201410005547
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】王曉凌, 施江, 李曉倩, 趙威 申請人:河南科技大學(xué)