專利名稱：一種煙草抗旱種質(zhì)的快速、高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草種質(zhì)篩選方法，具體是一種煙草抗旱種質(zhì)的快速、高通量篩選方法。
背景技術(shù)：
干旱是影響植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子之一。煙草在生長過程中，特別是從團(tuán)棵期進(jìn)入旺長期時常常遭遇干旱，干旱已經(jīng)成為影響其營養(yǎng)生長的重要因素。因此，通過對煙草抗旱材料的篩選、利用，可望研究植物的抗旱機(jī)制，選育抗旱的煙草品種，以解決生產(chǎn)中的干旱問題。目前，前人在抗旱研究中得出了一些行之有效的抗旱篩選方法，這些方法有田間直接鑒定、旱棚鑒定、盆栽鑒定、室內(nèi)模擬干旱發(fā)芽期鑒定等等，由于田間直接鑒定、旱棚鑒定與盆栽鑒定受自然條件、作物自身發(fā)育特性影響較大，試驗誤差較大；相比而言，由于室內(nèi)模擬干旱具有條件可控性強(qiáng)、試驗周期短、方法簡單、適用于大批量篩選、鑒定，所以，室內(nèi)模擬干旱的方法是較為常用的方法，但由于處理方法、測試時間和評價標(biāo)準(zhǔn)不同，試驗的結(jié)論也存在較大的誤 差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種煙草抗旱種質(zhì)的快速、高通量篩選方法，該方法通過在種子發(fā)芽后的小苗期，采用高濃度、高分子量的聚乙二醇(PEG)滲透溶液模擬小苗生長的干旱脅迫條件，研究在高滲透溶液下煙草種子的根生長量和萎焉植株率，以減小誤差，提高篩選方法的準(zhǔn)確性。本發(fā)明實現(xiàn)發(fā)明目的采用如下技術(shù)方案:一種煙草抗旱種質(zhì)的快速、高通量篩選方法，其特點在于按如下步驟進(jìn)行:( I)煙草種子的消毒處理精選大小一致、無破損的種子，用體積濃度8-12%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗
3-4次后，晾干，待用；(2)煙草種子發(fā)芽試驗培養(yǎng)皿中以雙層濾紙為發(fā)芽床，然后放入步驟(I)消毒處理過的種子放入培養(yǎng)皿中，用蒸餾水進(jìn)行發(fā)芽，蓋好培養(yǎng)皿后，放入晝溫度為28°C、10h，夜溫度為25°C、14h的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；(3)定苗、控水連續(xù)培養(yǎng)7-10天后，取出，進(jìn)行定苗，剔除未發(fā)芽種子、弱苗，留長勢較好的小苗，傾斜放置培養(yǎng)皿，控水至濾紙吸水至飽和，用移液器吸出多余水份；(4)PEG-6000 處理加入等同濾紙吸收飽和所需蒸餾水量的50%PEG-6000，至皿中PEG-6000終質(zhì)量濃度為25%，然后蓋好培養(yǎng)皿，用石蠟?zāi)し饪?，放入晝溫度?8°C、10h，夜溫度為25°C、14h的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；以蒸餾水處理為對照；(5)煙草萎焉比率和根長變化量的測定步驟(3)長勢較好的小苗經(jīng)步驟(4)的氣候培養(yǎng)箱培連續(xù)培養(yǎng)5天后，取出，記錄煙草小苗萎焉植株數(shù)，測定小苗的根長，計算小苗萎焉植株數(shù)和根長生長變化量。計算公式①、②①萎焉率(％)=(萎焉小苗植株數(shù)/小苗總數(shù))X 100%②根長伸長比(％)= (PEG處理后小苗根長-PEG處理前小苗根長)/ (PEG處理前小苗根長)X 100%·
其中，對不同的材料，萎焉率越小、根長變化比越大，表明材料的抗旱性越好。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在:本發(fā)明通過對種子發(fā)芽后的萎焉率和根長伸長比比較來篩選抗旱煙草材料，其操作簡單，快速，誤差小，準(zhǔn)確性好，能有效、快速的進(jìn)行煙草抗旱材料的大批量篩選。


圖1是本發(fā)明篩選方法中采用PEG-6000處理條件下的不同品種(系)小苗萎焉率比較。圖2是本發(fā)明篩選方法中采用PEG-6000處理條件下的不同煙草品種根長伸長比比較。圖3是傳統(tǒng)篩選方法中采用PEG-6000處理條件下的不同品種發(fā)芽率比較。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明:實施例1本發(fā)明具體實施方式
采用的材料及儀器:儀器:人工氣候培養(yǎng)箱、移液器、培養(yǎng)皿、直尺材料:PEG-6000、蒸餾水、濾紙、石蠟?zāi)と缦聦嵤├牧?歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14 ;均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。實施例:( I)煙草種子的消毒處理:取上述煙草材料(歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14)種子每份0.08g (約1000粒)裝入網(wǎng)袋中，先用蒸餾水水洗3次，然后用體積濃度10%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗3_4次后，晚干，待用。(2) 50%高濃度PEG-6000滲透液的配置以IOOOml為例，精確稱取PEG-6000 500g，加入蒸餾水充分溶解，而后定容至IOOOml0(3)煙草種子發(fā)芽試驗
以9cm雙層濾紙為發(fā)芽床，以IlOmm培養(yǎng)皿為載體，放入步驟(I)消毒處理過的種子，每個培養(yǎng)皿均勻放入130粒，分6個重復(fù)，用蒸餾水進(jìn)行發(fā)芽，蓋好培養(yǎng)皿后，放入晝溫度為28°C (IOh)，夜溫度為25°C (14h)的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。(4)定苗、控水連續(xù)培養(yǎng)10天后，取出，進(jìn)行定苗，剔除未發(fā)芽種子、弱苗，每皿留長勢較好的小苗100株，傾斜放置培養(yǎng)皿，控水至濾紙吸水至飽和，用移液器吸出多余水份。(5)PEG_6000 處理以9cm雙層濾紙吸水至飽和時，總含水量為3ml，加入3ml50%PEG_6000，至皿中PEG-6000終質(zhì)量濃度為25%，而后蓋好培養(yǎng)皿，用石蠟?zāi)し饪?，放入晝溫度?8°C (IOh)，夜溫度為25V (14h)的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。以蒸餾水處理為對照，處理與對照各設(shè)分3個重復(fù)。(6)煙草萎焉比率和根長變化量的測定步驟5培養(yǎng)5天后，取出，記錄煙草小苗萎焉植株數(shù)，測定小苗的根長，計算小苗萎焉植株數(shù)和根長生長變化量。計算公式①、②①萎焉率(％)=(萎焉小苗植株數(shù)/小苗總數(shù))X 100%②根長伸長比(％)= (PEG處理后小苗根長-PEG處理前小苗根長)/ (PEG處理前小苗根長)X 100% 實驗室快速鑒定結(jié)果與分析1、PEG-6000對不同煙草品種小苗萎焉率的影響利用PEG-6000處理歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14共14個烤煙品種(系)進(jìn)行品種抗旱性的萎焉率指標(biāo)研究。結(jié)果表明:三組重復(fù)中，萎焉率大小差異均表現(xiàn)為6517〈中煙14〈吉煙9號〈長脖黃〈云煙97〈安選一號〈中煙100〈NC89〈春雷三號<K326〈Coker411〈 NC82<云煙87〈歪把子，部分品種(系)間差異顯著，重復(fù)性好，圖1為其中一組重復(fù)中不同烤煙品種的萎焉率比較。2.PEG-6000對不同煙草品種根長伸長比的影響利用PEG-6000處理歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14共14個烤煙品種(系)進(jìn)行品種抗旱性的根生長伸長比的指標(biāo)研究。結(jié)果表明:三組重復(fù)中，根長伸長比差異均表現(xiàn)為為6517〉中煙14>吉煙9號〉云煙97>長脖黃 > 安選一號 > 中煙100>NC89>春雷三號>K326>Coker411> NC82>云煙87>歪把子，部分品種(系)間差異顯著，重復(fù)性好，且與小苗萎焉率表現(xiàn)基本一致，如圖2所示，為其中一組重復(fù)中不同烤煙品種的根長伸長比比較。實施例2用常規(guī)PEG-6000浸種方法篩選抗旱材料本發(fā)明具體實施方式
采用的材料及儀器:儀器:人工氣候培養(yǎng)箱、移液器、培養(yǎng)皿材料:PEG-6000、蒸餾水、濾紙、石蠟?zāi)と缦聦嵤├牧?歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。實施例:( I)煙草種子的消毒處理:取上述煙草材料(歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14)種子每份0.08g (約1000粒)裝入網(wǎng)袋中，先用蒸餾水水洗3次，然后用體積濃度10%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗3_4次后，晚干，待用。(2) 25%高濃度PEG-6000滲透液的配置以IOOOml為例，精確稱取PEG-6000 250g，加入蒸餾水充分溶解，而后定容至IOOOml0(3)煙草種子發(fā)芽試驗以9cm雙層濾紙為發(fā)芽床，以IlOmm培養(yǎng)皿為載體，放入步驟(I)消毒處理過的種子，每個培養(yǎng)皿均勻放入100粒，而后加入25%的PEG-6000滲透液進(jìn)行發(fā)芽試驗，以蒸餾水作為對照，分3個重復(fù)，蓋好培養(yǎng)皿后，用石蠟?zāi)し饪?，放入晝溫度?8°C (IOh)，夜溫度為250C (14h)的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。(4)發(fā)芽率計數(shù)連續(xù)培養(yǎng)10天后，拿出培養(yǎng)皿，清點發(fā)芽的種子數(shù)與不發(fā)芽種子數(shù)，計算發(fā)芽率。計算公式:
發(fā)芽率(％)=(發(fā)芽種子數(shù)/小苗總數(shù))X 100%實驗室快速鑒定結(jié)果與分析利用PEG-6000處理歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14共14個烤煙品種(系)種子進(jìn)行品種抗寒性的發(fā)芽率比較，結(jié)果表明，PEG-6000處理后，三組重復(fù)中，按種子發(fā)芽率由大到小排列分別為中煙14>6517>云煙97>吉煙9號〉長脖黃> NC89>Coker411>安選一號 > 中煙100>K326>春雷三號 > 歪把子 > 云煙87>NC82 ；6517>云煙97>中煙14>吉煙9號〉長脖黃> NC89>Coker411>NC82>安選一號 > 中煙100>K326>春雷三號 > 歪把子 > 云煙87 ;云煙97>6517>中煙14>吉煙9號〉長脖黃> Coker411>NC89>安選一號 > 中煙100>K326>春雷三號〉歪把子〉云煙87>NC82 (如圖3所示)；各重復(fù)結(jié)果存在一定的差異，這主要由于種子自身品質(zhì)特性存在差異造成的，試驗中發(fā)現(xiàn)，雖是同年收獲的同一品種種子，但正常條件下，種子自身發(fā)芽率也存在差異，因此，利用傳統(tǒng)的PEG-6000浸種方法依據(jù)發(fā)芽率進(jìn)行抗旱材料篩選，誤差相對較大。
權(quán)利要求
1.一種煙草抗旱種質(zhì)的快速、高通量篩選方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行: (1)煙草種子的消毒處理 精選大小一致、無破損的種子，用體積濃度8-12%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗3_4次后，晚干，待用； (2)煙草種子發(fā)芽試驗 培養(yǎng)皿中以雙層濾紙為發(fā)芽床，然后放入步驟(I)消毒處理過的種子放入培養(yǎng)皿中，用蒸懼水進(jìn)行發(fā)芽，蓋好培養(yǎng)皿后，放入晝溫度為28°C、10h,夜溫度為25°C、14h的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)； (3)定苗、控水 連續(xù)培養(yǎng)7-10天后，取出，進(jìn)行定苗，剔除未發(fā)芽種子、弱苗，留長勢較好的小苗，傾斜放置培養(yǎng)皿，控水至濾紙吸水至飽和，用移液器吸出多余水份； (4)PEG-6000 處理 加入等同濾紙吸收飽和所需蒸餾水量的50%PEG-6000，至皿中PEG-6000終濃度為25%，然后蓋好培養(yǎng)皿，用石蠟?zāi)し饪冢湃霑儨囟葹?8°C、10h，夜溫度為25°C、14h的氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；以蒸餾水處理為對照； (5)煙草萎焉比率和根長變化量的測定 步驟(3)長勢較好的小苗經(jīng)步驟(4)的氣候培養(yǎng)箱培連續(xù)培養(yǎng)5天后，取出，記錄煙草小苗萎焉植株數(shù)，測定小苗的根 長，計算小苗萎焉植株數(shù)和根長生長變化量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草抗旱種質(zhì)的快速、高通量篩選方法，其方法是煙草發(fā)芽試驗過程中，待煙草完全發(fā)芽，子葉完全展開后，利用高濃度、高分子量的聚乙二醇滲透液模擬煙草幼苗發(fā)根和生長的干旱脅迫條件，研究在高滲溶液下煙草小苗的根生長量和植株萎焉比率，從而快速篩選抗旱的煙草，本發(fā)明的意義在于規(guī)避了煙草種質(zhì)間在后期生長過程中，由種質(zhì)生長特性而造成的差異，提供了一種操作簡單，快速，準(zhǔn)確性好的煙草高通量抗旱篩選方法，為煙草抗旱機(jī)理的研究及抗旱材料的利用奠定了基礎(chǔ)，有助于煙草的抗旱分離群體篩選。
文檔編號A01C1/00GK103109687SQ20131008080
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者李廷春, 周應(yīng)兵, 楊華應(yīng) 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所