專利名稱：草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基及其生產(chǎn)組培草莓苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種防止草莓組織培養(yǎng)過程中褐變的培養(yǎng)基及利用其組培繁育草莓苗的方法。
背景技術(shù)：
草莓是薔薇科草莓屬多年生草本植物，是世界七大水果之一，營養(yǎng)豐富，有“水果皇后”的美稱。另外食用草莓對腸胃病和貧血病有一定的療效，對促進(jìn)智力發(fā)育有重要作用。深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。草莓是一種栽培周期短、結(jié)果早、見效快的經(jīng)濟(jì)作物，但是草莓的病毒害嚴(yán)重影 響草莓的生產(chǎn)。作為高級(jí)漿果的草莓，在我國目前的生產(chǎn)栽培上多沿用無性繁殖種苗主要方法是匍匐莖繁殖和分株繁殖，但這兩種方法效率低、種苗易退化、易造成病毒蔓延。王國平(1988)等調(diào)查，我國栽培草莓帶病毒植株率過80%以上，戴子林(1995)等調(diào)查，我國長江流域感染大面積植株感染率在50%以上，感染了病毒病的草莓結(jié)果會(huì)存在變小、畸形、品質(zhì)差、生長緩慢等問題，一般減產(chǎn)30%-80%，并逐年加重；嚴(yán)重影響草莓的長勢、品質(zhì)和產(chǎn)量，對病毒病目前還沒有藥劑可以防治。目前，解決草莓病毒病的主要方法是通過草莓脫毒組培技術(shù)來擴(kuò)繁草莓脫毒苗，使草莓種苗回復(fù)品種的優(yōu)良性狀以達(dá)到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的目的。目前，常見草莓外植體組織培養(yǎng)類型包括草莓莖尖組織培養(yǎng)、草莓葉片和葉柄組織培養(yǎng)、草莓莖段組織培養(yǎng)、草莓花藥培養(yǎng)。草莓組織培養(yǎng)程序一般可分為外植體準(zhǔn)備、苗誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移植馴化等幾個(gè)階段，其中在每個(gè)階段的培養(yǎng)基選用、溫室條件等對組培苗的繁育系數(shù)、脫毒效果、再生率等關(guān)鍵參數(shù)有著重要影響。其中MS培養(yǎng)基是草莓組培過程中最常用的培養(yǎng)基，即Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的具備較高無機(jī)鹽和離子濃度的穩(wěn)定培養(yǎng)基，其硝酸鹽含量高、養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能夠保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長，是目前被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)快速繁殖的基本培養(yǎng)基。但是，在草莓組織培養(yǎng)中，褐變是影響初代培養(yǎng)褐化和限制初代培養(yǎng)再生率的重要原因，即外植體或培養(yǎng)材料接種后在組織培養(yǎng)過程中，由于切割造成機(jī)械損傷，傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，切面細(xì)胞中的酚類物質(zhì)為多酚氧化酶催化，氧化為醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變，變成棕褐色或暗褐色，并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制細(xì)胞內(nèi)其它酶的活性，影響細(xì)胞的正常代謝，毒害整個(gè)組織，甚至導(dǎo)致組織死亡。中國發(fā)明專利(申請?zhí)?01010252871. 4)公開了一套草莓莖尖組培專用的初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基以及用該系列培養(yǎng)基培養(yǎng)草莓莖尖組織生產(chǎn)脫毒苗的方法。其所述的初代培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并在其中添加濃度為O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)，并在初代培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行暗培養(yǎng)預(yù)防褐化，但其防止褐變的主要手段還是在于減少光照以抑制PPO的活性，防止多酚類物質(zhì)的氧化，從而減少被培養(yǎng)的組織褐變。但這種技術(shù)手段下初代培養(yǎng)的成活率僅從普通的40%左右提升到50-65%，還有提升的空間。王棟等在《植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施》(黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)2008(1)7 10)中分析了植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐變的若干因素，并公開了利用吸附劑(有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等)和抗氧化劑(抗壞血酸、硫代硫酸鈉、檸檬酸、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇、酪氨酸、巰基乙醇、卵清蛋白、維生素B、維生素E、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、亞硫氫酸鈉、氰化鉀、多胺)等用來減少植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象。其主要原理在于通過吸附組織培養(yǎng)過程中由于切割造成機(jī)械損傷處分泌的酚類化合物，或者通過上述抗氧化劑防止擴(kuò)散到培養(yǎng)基中的酚類化合物被氧化成褐色的醌類物質(zhì)，從而達(dá)到防止褐變的作用。但是，這種方法的不足之處在于只能被動(dòng)解決擴(kuò)散到培養(yǎng)基質(zhì)中的酚類化合物，在實(shí)際生產(chǎn)過程中還是會(huì)存在較高的褐變現(xiàn)象
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種相對于現(xiàn)有防褐變技術(shù)能更有效預(yù)防草莓組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變的專用初代培養(yǎng)基。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種再生率高的組培草莓苗生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種能有效預(yù)防草莓組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變的專用初代培養(yǎng)基，以O(shè). 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并在其中添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)，其中pH值保持在5. 7-5. 8 ；
上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為8-12 mg/L,油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O. 05-0. 3 mg/L。上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基還可以包含有O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和
O.3mg/L的激動(dòng)素(KT)；
上述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基中O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的口引哚乙酸(IAA)來代替。本發(fā)明的生產(chǎn)方法的技術(shù)方案是一種再生率高的組培草莓苗生產(chǎn)方法，其步驟包括1、取材。每年的6-8月，選擇植株生長健壯，匍匐莖充實(shí)，尖端生長良好，無病蟲害的優(yōu)良植株取其莖尖或花藥，作為組織培養(yǎng)的外植體。2、消毒。材料取來修整后用紗布包好放在自來水龍頭下沖洗2-4小時(shí)(以莖尖為例)，然后進(jìn)行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分鐘，然后用O. 1%的新潔爾滅浸泡15-20分鐘，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分鐘，最后用1-2%的過氧乙酸消毒I分鐘。每次都要用無菌水沖洗3-4次后再進(jìn)行下一次消毒。整個(gè)消毒過程都應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。3、接種。接種在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，接種前要先用酒精燈對接種用具(鑷子、接種針、接種架等)消毒自然放涼。先用鑷子一層層的剝?nèi)デo尖外的幼葉和鱗片，然后在解剖鏡下找到生長點(diǎn)(可帶1-2個(gè)葉原基)用接種針挑出生長點(diǎn)(小于O. 5毫米)，放入盛有上述草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，封好瓶口，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)成小植株。
4、室內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)室要求干凈清潔，室內(nèi)裝有紫外線殺菌燈，每天要對室內(nèi)進(jìn)行消毒，以防污染。培養(yǎng)溫度20-28°C，最適溫度25°C，相對濕度70%，光照強(qiáng)度1000-2000勒克斯，每日光照10小時(shí)左右。5、繼代培養(yǎng)。每培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)瓶內(nèi)的小植株就會(huì)分出3_5個(gè)小植株，把這些小植株分出放于由含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基組成的繼代培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；過20-30天后又會(huì)長出小植株，如此反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，增加繁殖系數(shù)。6、誘導(dǎo)生根。根據(jù)生產(chǎn)需要可在1-2月份集中一批苗子生根。草莓試管苗生根很容易，有的在繼代培養(yǎng)基上便可生根?；蛘咴谂囵B(yǎng)基中加入O. 5毫克/升的LBAj^ 30天左右便可長出6-10條長約2-3厘米的小根。7、溫室馴化。把生好根的小苗經(jīng)光照鍛煉7-10天，從試管內(nèi)取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽入土質(zhì)疏松的沙土摻入少量有機(jī)質(zhì)的營養(yǎng)土內(nèi)，移栽后要澆透水，支小拱棚覆蓋塑
料薄膜保濕。馴化溫度以15-20°C，前兩周空氣相對濕度80-100%，第三周開始短時(shí)間放風(fēng)，放風(fēng)強(qiáng)度逐漸加大，至移栽后第四周可去掉覆蓋物。根據(jù)情況每天或隔天噴水一次，保持土壤濕潤而不積水為宜。時(shí)間為2-3個(gè)月以小苗發(fā)出5-6片新葉為宜。8、病毒鑒定和檢驗(yàn)。利用電子顯微鏡檢測草莓病毒，即利用負(fù)染色法及超薄切片法處理待測葉片，然后在電子顯微鏡下觀察，如果被測葉片中含有較多病毒顆粒子，可被直接觀察到。經(jīng)檢驗(yàn)確認(rèn)無毒的草莓苗移入網(wǎng)紗大棚進(jìn)行繁殖。9、網(wǎng)紗大棚內(nèi)繁殖。草莓病毒的傳播主要靠蚜蟲、飛虱等蟲媒傳播。把無病毒苗放入網(wǎng)紗內(nèi)繁殖可防止蚜蟲等傳播病毒。網(wǎng)紗大棚內(nèi)土壤要經(jīng)過嚴(yán)格消毒，并注意定期噴施殺蚜蟲藥，網(wǎng)紗大棚內(nèi)育苗與苗圃育苗大體一致。本發(fā)明的有益效果在于1、利用本發(fā)明提供的初代培養(yǎng)基，即以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，再添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯而組成的初代培養(yǎng)基，在進(jìn)行初代培育過程中，其中的抗壞血酸和油菜素內(nèi)酯可以發(fā)揮防褐變方面的協(xié)同作用，一方面通過發(fā)揮抗壞血酸對滲入到培養(yǎng)基中酚類物質(zhì)的抗氧化作用體現(xiàn)直接還原作用，另一方面油菜素內(nèi)酯在外植體內(nèi)部能增強(qiáng)草莓組織內(nèi)部抗氧化酶的活性，減少褐變根本因素醌類物質(zhì)的產(chǎn)生和擴(kuò)展；兩者的結(jié)合能有效防止草莓初代培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生，將褐變率從常規(guī)的30%以上降低到20%以下。2、褐變率的降低和初代培養(yǎng)草莓組織中的抗氧化情況的改善，萌發(fā)率從40-60%提升至70%以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例
在6-8月選擇植株生長健壯，匍匐莖充實(shí)，尖端生長良好，無病蟲害的優(yōu)良草莓植株取其莖尖組織培養(yǎng)的外植體。將莖尖組織修整后用紗布包好放在自來水龍頭下沖洗2-4小時(shí)，然后進(jìn)行表面消毒。先用70%酒精漂洗半分鐘，然后用O. 1%的新潔爾滅浸泡15-20分鐘，再用O. 1%的升汞(氯化汞)消毒5-8分鐘，最后用1-2%的過氧乙酸消毒I分鐘。每次都要用無菌水沖洗3-4次后再進(jìn)行下一次消毒。整個(gè)消毒過程都應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成。
對接種用具(鑷子、接種針、接種架等)消毒自然放涼后用鑷子一層層的剝?nèi)デo尖外的幼葉和鱗片，然后在解剖鏡下找到生長點(diǎn)(可帶1-2個(gè)葉原基)用接種針挑出生長點(diǎn)(小于0.5毫米)，放入盛有不同激素配比的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，封好瓶口，培養(yǎng)溫度20-28°C，最適溫度25°C，相對濕度70%，光照強(qiáng)度1000-2000勒克斯，每日光照10小時(shí)左右，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)成小植株。在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度激素和配方組成的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基的具體組成和初代培養(yǎng)效果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其特征在于還含有濃度為5_15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的基本培養(yǎng)基還可以含有濃度為O. 02 mg/L的赤霉素(GA3)和O. 3mg/L的激動(dòng)素(KT)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)來代替。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的基本培養(yǎng)基的pH控制在5. 7-5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸 (VC)的濃度為8-12 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O. 05-0. 3 mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸 (VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。
7.—種生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于其步驟包括，(1)取材；每年的6-8月，選擇植株生長健壯，匍匐莖充實(shí)，尖端生長良好，無病蟲害的優(yōu)良植株取其莖尖或花藥，作為組織培養(yǎng)的外植體；(2)消毒;(3)配制草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，完成接種后封好瓶口，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)成小植株；所述草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基，以含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和O.1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還含有濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)；(4)室內(nèi)培養(yǎng)和繼代培育；當(dāng)培養(yǎng)瓶內(nèi)的小植株分出3-5個(gè)小植株時(shí)，把這些小植株分出放于含有O. 2-0. 5 mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基組成的繼代培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)并反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)；(5)溫室馴化及病毒鑒定；把生好根的小苗經(jīng)光照鍛煉7-10天后移栽入土質(zhì)疏松的沙土摻入少量有機(jī)質(zhì)的營養(yǎng)土內(nèi)，進(jìn)行馴化并利用電子顯微鏡檢測草莓病毒；(6)網(wǎng)紗大棚內(nèi)繁殖；將網(wǎng)紗大棚內(nèi)土壤嚴(yán)格消毒后，把無病毒苗放入網(wǎng)紗內(nèi)繁殖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于所述步驟(2)消毒中， 采用70%酒精、O. 1%的新潔爾滅、O. 1%的升汞(氯化汞)、1-2%的過氧乙酸等對植物組織進(jìn)行消毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于所述步驟(4)室內(nèi)培養(yǎng)和繼代培育中，其室內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度20-28°C，相對濕度70%，光照強(qiáng)度1000-2000勒克斯，每日光照10小時(shí)左右。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)組培草莓苗的方法，其特征在于所述室內(nèi)培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度的最適溫度為25V。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種草莓防褐變專用初代培養(yǎng)基。其以含有0.2-0.5mg/L的6-芐氨基嘌呤(BA)和0.1-0.2mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并加入了濃度為5-15mg/L的抗壞血酸(VC)和0.001-0.5mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)，可大幅度降低草莓組織初代培養(yǎng)過程中的褐變率并提高萌發(fā)率。本發(fā)明還公開了利用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)草莓莖尖組織生產(chǎn)組培草莓苗的方法，包括草莓苗的取材、消毒、接種和初代培育、繼代培養(yǎng)、馴化及病毒鑒定、網(wǎng)紗大棚內(nèi)繁殖等步驟。本發(fā)明能有效防止草莓初代培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生，初代培養(yǎng)草莓組織中的抗氧化情況有效改善，萌發(fā)率從40-60%提升至70%以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102986534SQ201210540779
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者畢德 申請人:蘇州和美生物科技有限公司