專利名稱：一種桔黃假單胞菌微生物農(nóng)藥及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥領(lǐng)域，具體涉及一種桔黃假單胞菌微生物農(nóng)藥及其制備方
法。
背景技術(shù)：
目前，農(nóng)業(yè)上對(duì)植物病蟲害的防治方法主要是化學(xué)防治方法，化學(xué)防治容易引起抗藥性產(chǎn)生；大量使用時(shí)會(huì)造成農(nóng)藥殘留物超標(biāo)，危害人類及其他生物的生存，引起環(huán)境污染，破壞生態(tài)平衡。而生物防治方法則可以有效避免這些危害。生物農(nóng)藥是指用來(lái)防治農(nóng)林牧業(yè)有害生物的生物活體及其代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，一般分為生物體農(nóng)藥和生物化學(xué)農(nóng)藥兩大類，其中生物體農(nóng)藥又分為動(dòng)物體農(nóng)藥、植物體農(nóng)藥和微生物體農(nóng)藥；生物化學(xué)農(nóng)藥又分為動(dòng)物源生物化學(xué)農(nóng)藥、植物源生物化學(xué)農(nóng)藥和微生物源生物化學(xué)農(nóng)藥等。本實(shí)驗(yàn)室自行篩選的一株桔黃假單胞菌JD37 (菌種保藏號(hào)CGMCCNo. I. 10967)對(duì)多種植物病菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，根據(jù)JD37菌株生長(zhǎng)所需的溫度、pH等條件，選取硅藻土作為載體，羧甲基纖維素作為助劑，通過(guò)載體結(jié)合法研制活體微生物農(nóng)藥。該菌劑中有效菌體釋放率較高，貯藏期內(nèi)菌劑中活菌數(shù)保持在較高水平(> 108cfu/mL)，且生防效果較為理想，對(duì)今后降低化學(xué)農(nóng)藥的使用以及生物菌劑的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用等方面奠定的良好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種延長(zhǎng)菌體存活期，生防作用良好的微生物農(nóng)藥，同時(shí)提供其制備方法，以解決目前活體微生物農(nóng)藥菌體釋放率不高、貯藏期短的問(wèn)題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下上述桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法如下(I)將硅藻土在I. 0-1. 2 X IO5Pa, 120_130°C下滅菌兩次，每次時(shí)間30_35min，烘干備用；硅藻土具有以下特點(diǎn)質(zhì)量輕；成微粒狀，具有較大表面積；表面密集多孔，具有良好的吸附能力；親水性強(qiáng)，具有良好的保濕效果，這些特點(diǎn)有利于增加菌體的吸附量并且延長(zhǎng)保質(zhì)期；(2)將桔黃假單細(xì)胞菌JD37菌株接種如液體KB培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)24h，得發(fā)酵液；取上述發(fā)酵液接種于新鮮液體KB培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)24h，得菌體懸液；在無(wú)菌條件下將菌體懸液離心去除上清液，得菌體，每升菌體懸液所得菌體用3-5mL新鮮KB液體培養(yǎng)基吹打使之充分懸?。浑x心后用少量的新鮮KB培養(yǎng)基重新懸浮菌體，為菌體的正常生存提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌體的存活率和存活期也隨之提高；(3)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的羧甲基纖維素溶液，混勻后得懸浮液，將懸浮液與經(jīng)步驟
(I)處理的硅藻土混合均勻，室溫過(guò)夜，得桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥。所得農(nóng)藥轉(zhuǎn)入塑封袋中室溫下貯藏。
步驟(2)中發(fā)酵液與液體KB培養(yǎng)基的體積比為1:100。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，JD37以1%的接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C，24h)后，其菌體數(shù)量以及抑菌能力均達(dá)到最大值，此時(shí)收集的菌體存活能力強(qiáng)且生防效果最佳。步驟(3)中加入的羧甲基纖維素溶液與步驟(2)中用于懸浮所得菌體的新鮮KB培養(yǎng)基體積比為1:1。根據(jù)載體硅藻土的飽和吸水量以及菌體存活率，步驟(3)中硅藻土與懸浮液的混合比例為500-700g/L。本發(fā)明所得到的桔黃假單胞菌活體微生物農(nóng)藥，制作方法簡(jiǎn)單，成本低，以硅藻土為載體加入羧甲基纖維素助劑后對(duì)菌體的吸附率高，同時(shí)菌體的存活率和保存期以及應(yīng)用過(guò)程中菌體的釋放率較高。且研究證實(shí)，該菌株不僅能夠有效控制病害，同時(shí)對(duì)植物還具有促生能力。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I以硅藻土為載體制備微生物農(nóng)藥(I)將選定的載體材料(硅藻土)進(jìn)行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(121 °C，30min),烘干備用。(2)液體 KB 培養(yǎng)基蛋白胨 20g、K2HPO4L 5g、MgSO4 · 7H201. 5g、甘油 10mL、去離子水 1L。(12rC,30min)(3)挑取單菌落至IOOmL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)24h后，按1%接種量取IOmL發(fā)酵液于IOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C，200rpm，24h)，在無(wú)菌條件下，將菌體懸液在8000rpm下離心15min，去除上清液，用5mLKB液體培養(yǎng)基輕輕吹打使之充分懸浮。(4)加入5mLl%羧甲基纖維素溶液，混勻后按比例與載體材料混合(600g硅藻土吸附IOOmL菌懸液)，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻或用震蕩器震蕩均勻，室溫過(guò)夜，轉(zhuǎn)入無(wú)菌塑封袋中室溫下貯藏。實(shí)施例2以滑石粉為載體制備微生物農(nóng)藥(I)將選定的載體材料(滑石粉)進(jìn)行高壓(1.034X 105Pa)滅菌兩次(121 °C，30min),烘干備用。(2)液體 KB 培養(yǎng)基蛋白胨 20g、K2HPO4L 5g、MgSO4 · 7H201. 5g、甘油 10mL、去離子水 1L。(12rC,30min)(3)挑取單菌落至IOOmL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)24h后，按1%接種量取IOmL發(fā)酵液于IOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C，200rpm，24h)，在無(wú)菌條件下，將菌體懸液在8000rpm下離心15min，去除上清液，用5mLKB液體培養(yǎng)基輕輕吹打使之充分懸浮。(4)加入5mLl%羧甲基纖維素溶液，混勻后按比例與載體材料混合(600g滑石粉吸附IOOmL菌懸液)，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻或用震蕩器震蕩均勻，室溫過(guò)夜，轉(zhuǎn)入無(wú)菌塑封袋中室溫下貯藏。
實(shí)施例3以蛭石為載體制備微生物農(nóng)藥(I)將選定的載體材料(蛭石)進(jìn)行高壓(I. 034X IO5Pa)滅菌兩次(121°C，30min),烘干備用。(2)液體 KB 培養(yǎng)基蛋白胨 20g、K2HPO4L 5g、MgSO4 · 7H201. 5g、甘油 10mL、去離子水 1L。(12rC,30min)(3)挑取單菌落至IOOmL液體KB培養(yǎng)基中，28°C、200rpm培養(yǎng)24h后，按1%接種量取IOmL發(fā)酵液于IOOOmL新鮮液體KB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(28°C，200rpm，24h)，在無(wú)菌條件下，將菌體懸液在8000rpm下離心15min，去除上清液，用5mLKB液體培養(yǎng)基輕輕吹打使之充分懸浮。
(4)加入5mLl%羧甲基纖維素溶液，混勻后按比例與載體材料混合(600g蛭石吸附IOOmL菌懸液)，用無(wú)菌玻璃棒攪拌均勻或用震蕩器震蕩均勻，室溫過(guò)夜，轉(zhuǎn)入無(wú)菌塑封袋中室溫下貯藏。實(shí)施例4實(shí)施例I、2、3有效活菌數(shù)檢測(cè)(I)在無(wú)菌條件下，分別稱取以上三種微生物農(nóng)藥10g，加入裝有IOOmL無(wú)菌水的錐形瓶中，放入搖床(200rpm)搖勻40_60min。(2)梯度稀釋后,取O. ImL在涂平板(含氨節(jié)青霉100μ g/mL,氯霉素50μ g/mL),三次重復(fù)。28°C，培養(yǎng)l-2d后計(jì)數(shù)。結(jié)果如下表I不同載體微生物農(nóng)藥有效活菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將硅藻土在I.0-1. 2X IO5Pa, 120_130°C下滅菌兩次，每次時(shí)間30_35min，烘干備用； (2)將桔黃假單細(xì)胞菌JD37菌株接種如液體KB培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)24h，得發(fā)酵液；取上述發(fā)酵液接種于新鮮液體KB培養(yǎng)基中，在28°C下培養(yǎng)24h，得菌體懸液；在無(wú)菌條件下將菌體懸液離心去除上清液，得菌體，每升菌體懸液所得菌體用3-5mL新鮮KB液體培養(yǎng)基吹打使之充分懸浮； (3)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的羧甲基纖維素溶液，混勻后得懸浮液，將懸浮液與經(jīng)步驟(I)處理的硅藻土混合均勻，室溫過(guò)夜，得桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥。
2.權(quán)利要求I所述的桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于，步驟(2)中發(fā)酵液與液體KB培養(yǎng)基的體積比為1:100。
3.權(quán)利要求I所述的桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于，步驟(3)中加入的羧甲基纖維素溶液與步驟(2)中用于懸浮所得菌體的新鮮KB培養(yǎng)基體積比為1:1。
4.權(quán)利要求I所述的桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥的制備方法，其特征在于，步驟(3)中硅藻土與懸浮液的混合比例為500-700g/L。
5.一種桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥及其制備方法，以硅藻土為載體，將桔黃假單細(xì)胞菌JD37菌株經(jīng)培養(yǎng)獲得菌體，加入助劑羧甲基纖維素溶液，與經(jīng)處理的硅藻土混合均勻，得桔黃假單細(xì)胞菌微生物農(nóng)藥。該活體微生物農(nóng)藥制備方法簡(jiǎn)單，保水性強(qiáng)，為菌體的生存提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而增加了菌體的存活率和存活期。同時(shí)能夠增強(qiáng)植株對(duì)病原真菌的防御能力，降低其發(fā)病率。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102919275SQ201210452050
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者肖明, 方蕊 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)