專利名稱：桔黃假單胞菌的培育方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術，具體地說是一種桔黃假單胞菌的培育方法及應用。
背景技術：
植物病害造成農作物品質變差、產量下降，給農業(yè)生產和食品安全帶來了巨大的經濟損失和安全隱患?，F(xiàn)有技術植物病害的防治方法主要是利用農藥的化學防治?；瘜W藥劑具有防治速度快、效果好、殺蟲抗菌譜廣、成本低、使用簡單的優(yōu)點?，F(xiàn)有的化學防治缺點是長期使用破壞生態(tài)平衡、造成次要病害猖獗、藥劑殘留導致環(huán)境污染等問題。植物病害的生物防治是利用對植物無害或有益的生物來影響或抑制病原物的生存和活動，減少病害的發(fā)生或降低病害的發(fā)展速率的方法。生物防治不僅有效地控制了農作物病害，又促進了農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，是一種保護生態(tài)環(huán)境、提高農作物產量和品質的好方法。假單胞菌是一種植物根際促生菌(Plant Growth-promoting Rhizobacteria, PGPR), 能夠通過多種方式促進植物生長，同時分泌抗病物質抑制土壤中植物病原菌繁殖，控制植物病害發(fā)生?，F(xiàn)有技術發(fā)現(xiàn)桔黃假單胞菌對多種植物致病菌有抑制作用(Rosas BS等， Phyton-Revista Internacional de Botanica Experimental,2001,67 :203-209) ；Rosas 和 Rovera 等人(Carlier E, Rovera M 等 World JMicrobiol Biotechnol,2008,24 2653-2658)研究發(fā)現(xiàn)，桔黃假單胞菌SRl通過產生鐵載體、拮抗蛋白、氫氰酸(HCN)、植物激素類似物等來抑制植物病原菌、促進植物的生長。！^eklistova和Maksimova(Feklistova IN 等，Bulletin of BSU, chemistry, biology, Geography, 2005, 2 :29-31)發(fā)現(xiàn)，桔黃假單胞菌還能合成吩嗪類物質(phenazines)起到生物防治的作用?，F(xiàn)有桔黃假單胞菌的缺點是桔黃假單胞菌自然界中存在數(shù)量少，繁殖速度慢，無法滿足植物防治病害、促進植物生長的需要，無法滿足農業(yè)生產中減輕作物病害、提高作物產量的需要。所以發(fā)明一種對人畜無毒、生態(tài)環(huán)境友好、對多種植物病原菌有良好防治效果，并能促進植物生長的桔黃假單胞菌新菌種對于保護環(huán)境、促進植物生長和農業(yè)發(fā)展有著重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種對人畜無毒、生態(tài)環(huán)境友好、對多種植物病原菌有良好防治效果，并能促進植物生長的桔黃假單胞菌種。本發(fā)明的另一目的是提供桔黃假單胞菌在防治油菜、水稻、小麥、蕃茄、玉米病害中的應用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的桔黃假單胞菌的培育方法，步驟如下(1)試樣采集從上海市嘉定區(qū)紅薯作物的根際土壤，深度5cm-15cm，采集土樣， 風干，貯存于塑料袋中，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆茫?2)制備培養(yǎng)基
①KB 液體富集培養(yǎng)基蛋白胨 20g、甘油 10mL、K2HP04 1. 5g、MgS04 · 7H20 1. 5g、去離子水1L，混合靜置；②固體富集培養(yǎng)基蛋白胨20g、甘油10mL、K2HP04 1. 5g,MgSO4 · 7H201. 5g、去離子水1L、瓊脂18g，混合靜置;③斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨10g、NaCl 10g、酵母膏5g、瓊脂18g、去離子水1L，混合
靜置；④真菌培養(yǎng)基馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、去離子水水1L，混合靜置；⑤固體真菌培養(yǎng)基馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂38g、去離子水水1L，混合靜置；(3)抗生素和供試病原真菌①抗生素氨芐青霉素貯存濃度50mg/mL，氯霉素貯存濃度3%ig/mL ；②供試病原真菌油菜菌核病菌klerotinia sclerotiorum、水稻紋枯病菌 Rhizoctonia solani、小麥赤霉病菌 Fusarium graminearum、番爺灰霉病菌 Botrytis cinerea、玉米小斑病菌 Bipolaris maydis ；(4)菌種篩選①菌株分離、純化與保存將采集試樣放入含有氨芐青霉素40 μ g/mL與氯霉素13 μ g/mL的1/3KB液體富集培養(yǎng)基培養(yǎng)6-8小時；將富集好的菌液在含有氨芐青霉素40 μ g/mL與氯霉素13 μ g/mL的KB固體培養(yǎng)基上，梯度稀釋、平板涂布；將涂布好的KB平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接至新鮮固體培養(yǎng)基上，分離純化4-6代后保藏于斜面培養(yǎng)基，備用；②供試菌株平板對峙生長法初篩以油菜菌核病菌為指示菌，將分離到的細菌菌株采用平板對峙生長法進行拮抗性篩選；在內徑90mm的PDA平板中央接種直徑為8mm的油菜菌核病菌菌餅；同時在距菌餅相距25mm的4個角處分別點接4個分離純化后待測的細菌菌株；對照平板接種病原真菌菌餅，重復試驗3次；將做好的平板置于25°C培養(yǎng)，3-5d內觀察待測菌株對油菜菌核病菌的拮抗作用， 選擇對病原真菌有抑制作用的菌株進行復篩；③拮抗菌株的復篩在病原真菌菌餅兩側距離30mm的位置點接同一個菌株，選取拮抗菌株菌落邊緣到病原真菌菌落邊緣距離大、抑菌寬帶、拮抗作用持久的菌株，備用；(5)將上述復篩選出的菌種發(fā)酵繁殖，方法為①制備培養(yǎng)基蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水IL ；②培養(yǎng)基起始ρΗ7· 0 ；③將菌種接種到培養(yǎng)基，接種量3% ；④培養(yǎng)基溫度25 °C ；⑤搖瓶轉速200r/min，培養(yǎng)時間60h。桔黃假單胞菌在防治油菜、水稻、小麥、蕃茄、玉米病害中的應用。本發(fā)明的主要內容是
提供了一種對供試病原真菌具有顯著拮抗作用的桔黃假單胞菌，命名為JD37，在 GeneBank中的登錄號為GQ358919。本發(fā)明還提供了桔黃假單胞菌在油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉病菌的植物病害中的應用。鑒于假單胞菌作為生物防治菌的諸多優(yōu)勢，本發(fā)明以假單胞菌為拮抗試驗的對象，從上海市郊農作物根際土壤中共分離純化得到276株細菌，利用平板對峙法篩選出1 株對小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、/K禾S紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和油菜菌核病菌 (Sclerotiniasclerotiorum)具有強拮抗作用的菌株，命名為JD37。JD37能夠抑制病原真菌的生長，對病原菌產生的菌核也有一定的抑制效果。經過形態(tài)學觀察、生理生化特征以及16S rDNA的同源性分析，初步鑒定該菌株為桔黃假單胞菌(Pseudomonas aurantiaca)，該菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注冊，登錄號為 GQ3589190本發(fā)明采用單因素實驗和正交試驗對具抑菌活性的桔黃假單胞菌 JD37 (Pseudomonas aurantiaca JD37)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化選擇。確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水1L。確定最佳發(fā)酵條件培養(yǎng)溫度25°C， 起始pH7. 0，接種量3%，裝瓶量150mL/500mL，搖瓶轉速200r/min條件下培養(yǎng)60h。本發(fā)明結果為大規(guī)模的發(fā)酵提供了有價值的數(shù)據(jù)。桔黃假單胞菌產生的抑菌物質主要存在于發(fā)酵液中，PhlD, phz⑶，PrnC基因分別是2，4-DAPG，PCA，Prn合成所必須的，同時也可以作為產此種抗生素的分子標記[93’92’96]。通過PCR檢測，在JD37中擴增得到的ftnC與phzCD的基因片段，與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應的抗生素合成基因簇的基因片段具有較高的同源性，最高達到98%。根據(jù)二氯甲烷萃取液的紫外吸收光譜的全波段掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰出現(xiàn)在 250nm附近，因此選擇紫外檢測波長254nm進行HPLC分析。結果在色譜圖上發(fā)現(xiàn)4個波峰， 其中峰1的主吸收峰在255nm左右，峰2的主吸收峰在255nm，還有一個接近370nm的副峰， 在低波段有較高的峰值，故推測該制備樣品中有兩種主成分物質峰1與峰2，且這兩種物質的紫外波峰與PCA和Prn的波峰較為相似。因此判斷桔黃假單胞菌JD37能夠產生抗生素吩嗪-1-羧酸PCA和硝吡咯菌素ftii。本發(fā)明提供了測定菌株發(fā)酵上清液中抑菌物質的方法，具體方法為抑菌物質合成相關基因的基因克隆與分析，C18反相高效液相色譜RP-HPLC檢測抑菌物質。本發(fā)明提供了制備菌劑的方法，將其施用到植物根部，觀察其對植物的促進生長作用。本發(fā)明還提供了一種控制或抑制植物病原真菌生長的方法，具體方法為將發(fā)酵培養(yǎng)^h的JD37菌液稀釋60倍，含菌量為1. 2 X 108CFU/mL后和病原真菌先后施用到玉米和小麥植物葉片上，觀察菌株對植株的生物防治效果。本發(fā)明的優(yōu)點是1、具有高效抑菌活性，防治植物病害效果顯著。2、人畜安全、無毒。3、促進農作物生長。
4、發(fā)酵繁殖容易。5、使用簡便。


圖1為本發(fā)明桔黃假單胞菌在KB培養(yǎng)基上的形態(tài)圖；圖2為本發(fā)明桔黃假單胞菌的電鏡照片圖；圖3為本發(fā)明桔黃假單胞菌的總DNA電泳圖；M =Lamda DNA/Hind IIIMarker ；1， 2 JD37菌株圖 4 為本發(fā)明 16srDNA 電泳圖；M :DL2000Marker ；1,2 JD37 菌株 16srDNA ；圖5為本發(fā)明菌株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖6為本發(fā)明菌株對植物病原真菌的抑菌效果圖；其中1為對番茄灰霉病菌的抑制效果；2為對小麥赤霉病菌的抑制效果；3為對水稻紋枯病菌的抑制效果；4為對玉米小斑病菌的抑制效果；5為對油菜菌核病菌的抑制效果；6為對油菜菌核病菌菌核的抑制效果。圖7為JD37合成抗生素相關基因檢測電泳圖；M:DL2000DNA Marker，其中1: phzCD擴增產物；2 =PrnC擴增產物；圖8為純化后的樣品高效液相色譜圖(UV波長2Mnm)；圖9為制備樣品的高效液相色譜圖(UV波長2Mnm) ；1 =Prn的波峰；2 =PCA的波峰；3，4:雜質波峰；圖10為Prn紫外吸收光譜全波段掃描圖；圖11為PCA紫外吸收光譜全波段掃描圖；圖12為兩種雜質紫外吸收光譜全波段掃描圖；3，4 =HPLC圖譜中的雜質3和4。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
對本發(fā)明做進一步說明。菌株的篩選將供試土樣放入1/3KB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有氨芐青霉素40 μ g/mL 與氯霉素13 μ g/mL,培養(yǎng)6小時。將富集好的菌液在含有氨芐青霉素40 μ g/mL與氯霉素 13 μ g/mL的KB固體培養(yǎng)基上，按照梯度稀釋進行平板涂布，分離純化得到276株菌株，作為初篩備用。以油菜菌核病菌為指示菌，將分離到的細菌菌株采用平板對峙生長法進行拮抗性篩選。在內徑90mm的PDA平板中央接種直徑為8mm的油菜菌核病菌菌餅，同時在距菌餅相距25mm的四個角處分別點接4個分離純化后待測的細菌菌株。對照平板只接種病原真菌菌餅，不點接篩選菌，將做好的平板置于25°C培養(yǎng)，3-5d內觀察抑菌圈形成，并選出有抑菌圈的48株菌株進入復篩。其中一株采自嘉定區(qū)紅薯田地中的菌株JD37表現(xiàn)出較強的拮抗活性，經多次實驗后確定該菌株長勢良好、性質穩(wěn)定，故用作進一步實驗的菌株。菌種的鑒定菌落圓形微隆起，微黃色，邊緣光滑，表面較濕潤，易被挑起；培養(yǎng) 4 后菌體產生桔紅色色素，覆蓋在菌落表面，同時菌落周圍產生桔黃色色素，隨著培養(yǎng)時間的增加，慢慢擴散至培養(yǎng)基中如圖1所示。取一定濃度的樣品進行電鏡觀察，菌體呈桿狀，(0.3-0.5) μ mX (1.0-1.4) μ m，兩端極生多根鞭毛，長度約為4.4 μ m，其電鏡照片見圖 2。
對該菌株進行常規(guī)生理生化特征鑒定，該菌是革蘭氏陰性菌，能夠產生色素，但不能產生水溶性的熒光色素，最適的生長溫度在之間，葡萄糖產酸但不能產氣，氧化酶反應陽性，結果見表2、表3。結合形態(tài)學的鑒定，本發(fā)明JD37菌株與假單胞菌的特征較為接近。以基因組DNA為模板見圖3，用細菌通用引物Sl和S2進行PCR擴增，得到的序列片段見圖4。(GenBank :GQ358919，附錄一)，經BLAST比對，結果如表1所示JD37菌株的 16S rDNA序列與 Pseudomonas aurantiaca VKMB-816T (AY271791)的同源性高達 100%，結合上述生理生化及形態(tài)學的鑒定結果，初步判斷JD37為I^seudomonas aurantiaca.選取相似度達99%的部分序列和其它假單胞菌屬的序列共11條構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株JD37 在親緣關系上與綠針假單胞菌較為接近見圖5。該菌株的16S rDNA序列已在(ienBank中注冊，登錄號為GQ358919?？咕V的測定對復篩得到的菌株JD37進行了初步的抗菌譜測定如圖6，發(fā)現(xiàn)該菌株對油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、玉米小斑病菌、番茄灰霉病菌都有比較好的拮抗性，尤其對小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌的拮抗效果最佳，見表2，雖然不能完全殺死病原真菌，但能起到良好的抑制作用。JD37不僅能夠抑制病原真菌菌絲體的生長，對菌核也有較好的拮抗效果，如表2 中顯示，油菜菌核病菌的菌核主要集中在拮抗菌的四周，且數(shù)量明顯少于對照組表3，菌核形成的時間比對照組提前1-2天。PCR檢測菌株JD37的抑菌物質以細菌的基因組DNA為模板，用引物對PCAh、 PCA3b(Raaijmakers J 等 Appl Environ Microbiol,1997,63 881 887)， PHL2a、 PHL2b 及 PrnCf, PrnCr (van P ee KH 等，J Antibiot (Tokyo)，1983，36 (12) :173542)進行 PCR 擴增 (表 4)。PCR 反應體系(50 μ L) 2XMaster Mix 25 μ L，引物各 1 μ L，DNA 模板 2 μ L，雙蒸水加至 50 μ L，PCR程序PCR擴增條件為94°C 5min ；94°C lmin，65°C 0. 5min，72°C lmin，30 個循環(huán)；72 °C IOmin。取2μ L PCR擴增產物，在1. 0%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測擴增產物的濃度和分子量，本發(fā)明的純化和測序工作由華大基因科技股份有限公司完成。將測序結果輸入NCBI，通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行對比分析。實驗結果如圖7，在1號和2號泳道上均有一條明亮的長約750bp和1200bp的條帶，與預計的序列長度一致，故可初步判斷這兩組條帶是Phz⑶基因和ftnC基因。將相應的基因序列測序結果(Prn :693bp, PCA :1086bp)提交到NCBI，通過Blast程序與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進行對比分析。在桔黃假單胞菌JD37中擴增得到的Prn合成基因簇中ftnC的基因片段，與已發(fā)表的多個菌株的ftiiC具有較高的同源性，最高達98% (表5)；擴增得到的phzCD基因片段也與已知的PCA合成基因簇有著較高的同源性(表6)。因此判斷本發(fā)明桔黃假單胞菌 JD37能夠產生抗生素吩嗪-1-羧酸PCA和硝吡咯菌素ftii。HPLC檢測菌株JD37的抑菌物質1.樣品制備在優(yōu)化后的YPG液體培養(yǎng)基中活化JD37，把經活化的細菌培養(yǎng)物以的比例加入到新鮮的YPG液體培養(yǎng)基，比例150mL/500mL，25°C，200rpm振蕩培養(yǎng)60h，然后將細菌發(fā)酵液IOOOOrpm條件下離心15min，收集上清液，用等體積的二氯甲烷萃取兩次，旋轉蒸發(fā)濃縮后抽干有機相，最終用Iml乙酸乙酯與甲醇的混合液重新溶解，用作HPLC檢測。2.色譜條件將上述萃取物混合液用0. 22 μ m濾膜過濾后經C18反相高效液相色譜RP-HPLC檢測。分析柱為AQ-C18，規(guī)格150mmX4. 6mm，5ym，流動相為甲醇水磷酸(V V V)= 65 35 0. 1 ；柱溫為室溫，流速為l.OmL/min，二極管陣列器檢測，檢測波長為2Mnm。取拮抗效果最好的二氯甲烷萃取液進行紫外吸收光譜的全波段掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰出現(xiàn)在250nm附近；選擇常規(guī)的紫外檢測波長254nm進行檢測。結果如圖10、圖11、圖 12，在色譜圖上發(fā)現(xiàn)4個波峰，分別對這4個波峰進行分析。峰1的主吸收峰在255nm左右， 峰2的主吸收峰在255nm，還有一個接近370nm的副峰，全波段紫外掃描兩者圖譜較為相似， 故推測該兩種物質結構可能較為相似。峰3和峰4只有在低波段有較高的峰值，推測極有可能是雜質。根據(jù)HPLC分析結果，我們確認該制備樣品中有兩種主成分物質峰1與峰2，且這兩種物質的紫外波峰與PCA[94](峰2~)和Prn[95](峰1)的波峰較為相似，這與PCR檢測結果相吻合。溫室盆栽試驗檢測JD37菌株對玉米植株幼苗的促生作用用0. 3 %的次氯酸鈉溶液對玉米種子進行表面消毒，沖洗干凈后，清水浸泡2 小時，取四個平皿，鋪上滅菌的濾紙，分別加入稀釋60、80、100、120倍，含菌量分別為 1. 2 X 108、9 X IO7,7. 2 X 107、6 X 107CFU/mL,培養(yǎng) 28h 的桔黃假單胞菌 JD37 發(fā)酵液 40ml 浸泡 4h，清水對照。種子附菌后種入花盆，待幼苗長到一葉期時再用上述稀釋的發(fā)酵液澆灌幼苗根部土壤，待幼苗長到五葉期時每處理隨機取30株，通過測定苗高，苗鮮重，苗干重，根鮮重四項指標判斷JD37菌對玉米植株的促生作用。本實驗重復三次。通過表7可以看出，不同稀釋度的菌液都能促進玉米幼苗的生長，其中稀釋60倍的菌液(含菌量為1. 2 X IO8Cfu/ ml)促生效果最顯著。桔黃假單胞菌JD37對玉米小斑病和小麥赤霉病的防治效果將玉米、小麥種子用0.3%的次氯酸鈉消毒后，室溫下催芽他后種入花盆，待玉米、小麥植株長到五葉期時，將事先培養(yǎng)好的JD37菌稀釋到1. 2 X IO8CfVml、病原菌調整適當濃度1. OX IO8孢子/ml。對玉米、小麥葉片進行以下處理，每次處理30片葉子，重復兩次(1)先用清水涂抹植物葉片表面，晾干后用保鮮膜包被保濕24h后，每天一次，處理一周后再涂抹病原菌于植株葉片表面，晾干后用保鮮膜包被保濕Mh，每天1次，處理1 周，作為對照試驗。(2)先用病原菌涂抹于植株葉片表面，晾干后用保鮮膜包被保濕24h后，每天一次，處理一周后再涂抹JD37菌發(fā)酵液于植株葉片表面，晾干后用保鮮膜包被保濕Mh，每天處理1次，處理1周。C3)先用JD37菌發(fā)酵液涂抹于植株葉片表面，晾干后用保鮮膜包被保濕Mh后，每天一次，處理一周后再涂抹病原菌于植株葉片表面，晾干后用保鮮膜包被保濕Mh，每天處理1次，處理1周。
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觀察病斑情況，統(tǒng)計病情指數(shù)玉米小斑病情嚴重程度分級指標0:葉片沒有染?。? 病斑直徑在5CM以下；2 病斑直徑在5CM彡r < IOCM ；3 病斑直徑在 IOCM ^ r < 15CM ；4 病斑面積占葉面1/2左右；5 病斑面積占葉面2/3左右；6 病斑面積占整個葉面，整葉枯死。小麥赤霉病情嚴重程度分級指標0:葉片沒有染病；1 接種部位有少許病斑，直徑> 6mm的病斑數(shù)不超過10個；2 病斑侵染直徑0 < r < 6cm，接種面積1/2發(fā)黃；3 病斑侵染直徑0 < r < 6cm,接種面積2/3發(fā)黃；4 病斑侵染直徑0 < r < 6cm，接種面積全部發(fā)黃；5 病斑侵染直徑6 < r << 11cm，接種面積全部發(fā)黃；病情指數(shù)=Σ (各病級X各級葉片數(shù))/(最高病級X總調查葉片數(shù))防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情情指數(shù)X 100%從表8、9中可以看出處理3的生防效果最好，分別達到43. 63%、29. 57%，因此可以推斷出JD37菌的發(fā)酵液中有抑菌物質，對病原真菌的生長有抑制作用。但這種抑制作用體現(xiàn)在接種病原真菌前，當病原真菌已經侵入到植株葉片后，JD37防治效果不明顯。以上所述僅為本發(fā)明部分實施例，并不用于限制本發(fā)明。對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的原則之內，所作的任何修改、改進等，均應包括在本發(fā)明的保護范圍之內。表1序列相似性分析表
權利要求
1. 一種桔黃假單胞菌的培育方法，步驟如下(1)試樣采集從上海市嘉定區(qū)紅薯作物的根際土壤，深度5cm-15cm，采集土樣，風干， 貯存于塑料袋中，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆茫?2)制備培養(yǎng)基①KB液體富集培養(yǎng)基蛋白胨20g、甘油IOmU2HPO41. 5g、MgS04 · 7H20 1. 5g、去離子水1L，混合靜置；②固體富集培養(yǎng)基蛋白胨20g、甘油IOmL,K2HPO4 1. 5g、MgSO4 · 7Η201· 5g、去離子水 1L、瓊脂18g，混合靜置;③斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨10g、NaCl10g、酵母膏5g、瓊脂18g、去離子水1L，混合靜置；④真菌培養(yǎng)基馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、去離子水水1L，混合靜置；⑤固體真菌培養(yǎng)基馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂38g、去離子水水1L，混合靜置；(3)抗生素和供試病原真菌①抗生素氨芐青霉素貯存濃度50mg/mL，氯霉素貯存濃度3%ig/mL；②供試病原真菌油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、水稻紋枯病菌 Rhizoctonia solani、小麥赤霉病菌 Fusarium graminearum、番爺灰霉病菌 Botrytis cinerea、玉米小斑病菌 Bipolaris maydis ；(4)菌種篩選①菌株分離、純化與保存將采集試樣放入含有氨芐青霉素40 μ g/mL與氯霉素13 μ g/mL的1/3KB液體富集培養(yǎng)基培養(yǎng)6-8小時；將富集好的菌液在含有氨芐青霉素40 μ g/mL與氯霉素13 μ g/mL的KB固體培養(yǎng)基上， 梯度稀釋、平板涂布；將涂布好的KB平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落接至新鮮固體培養(yǎng)基上，分離純化4-6代后保藏于斜面培養(yǎng)基，備用；②供試菌株平板對峙生長法初篩以油菜菌核病菌為指示菌，將分離到的細菌菌株采用平板對峙生長法進行拮抗性篩選；在內徑90mm的PDA平板中央接種直徑為8mm的油菜菌核病菌菌餅；同時在距菌餅相距 25mm的4個角處分別點接4個分離純化后待測的細菌菌株；對照平板接種病原真菌菌餅， 重復試驗3次；將做好的平板置于25°C培養(yǎng)，3-5d內觀察待測菌株對油菜菌核病菌的拮抗作用，選擇對病原真菌有抑制作用的菌株進行復篩；③拮抗菌株的復篩在病原真菌菌餅兩側距離30mm的位置點接同一個菌株，選取拮抗菌株菌落邊緣到病原真菌菌落邊緣距離大、抑菌寬帶、拮抗作用持久的菌株，備用；(5)將上述復篩選出的菌種發(fā)酵繁殖，方法為①制備培養(yǎng)基蛋白胨2g，葡萄糖12g，酵母膏15g，水IL；②培養(yǎng)基起始PH7.O ；③將菌種接種到培養(yǎng)基，接種量3%；④培養(yǎng)基溫度25°C ；⑤搖瓶轉速200r/min，培養(yǎng)時間60h。
2. 一種桔黃假單胞菌在防治油菜、水稻、小麥、蕃茄、玉米病害中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術，一種桔黃假單胞菌的培育方法及應用?，F(xiàn)有技術發(fā)現(xiàn)桔黃假單胞菌對多種植物致病菌有抑制作用，但是桔黃假單胞菌在自然界中存在數(shù)量少，繁殖速度慢，無法滿足植物防治病害、促進植物生長的需要。本發(fā)明桔黃假單胞菌的培育方法，步驟如下試樣采集；制備培養(yǎng)基；選擇和確定抗生素和供試病原真菌；菌種初篩和復篩；將復篩選出的菌種發(fā)酵繁殖。將桔黃假單胞菌在防治油菜、水稻、小麥、蕃茄、玉米病害中應用。本發(fā)明的優(yōu)點是具有高效抑菌活性，防治植物病害效果顯著；人畜安全、無毒；促進農作物生長；繁殖容易；使用簡便。
文檔編號A01N63/02GK102199558SQ20101024753
公開日2011年9月28日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權日2010年8月6日
發(fā)明者朱再玲, 王慧捷, 肖明 申請人:上海師范大學