專利名稱：沼澤紅假單胞菌菌株及應用、菌劑藥劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物農藥技術領域，尤其涉及一種沼澤紅假單胞菌菌株及其藥劑在防治水稻病害中的應用。
背景技術：
水稻是我國主要的糧食作物之一，然而水稻病害的持續(xù)發(fā)生一直影響著水稻生產。稻曲病是水稻主要的病害之一，在世界水稻產區(qū)廣泛分布并且有逐年加重的趨勢，由稻曲病引起的水稻病害每年可造成上億元的直接經濟損失，因此，研究和防治水稻稻曲病刻不容緩。目前，稻曲病的防治主要是采用化學農藥防治的方法?；瘜W農藥雖具有應用方便、防效較高的優(yōu)點，但化學農藥的過度使用將會產生以下問題①研制新品種化學抗菌藥難度加大，費用提高；②抗藥性問題越來越嚴重由于化學殺菌劑的長期使用，使得植物病原菌普遍出現(xiàn)了較高水平的抗藥性，其中最常見的是植物病原真菌對殺菌劑的抗藥性；抗藥性的產生往往導致植物病害的化學防治失敗，并且還會給以后的防治帶來連鎖反應，同時給農業(yè)生產帶來巨大的損失；③生態(tài)污染化學殺菌劑對野生和非靶標生物有毒，環(huán)境相容性差，使用甚至濫用化學殺菌劑，將導致大量化學農藥流失到生態(tài)環(huán)境中，對生態(tài)系統(tǒng)造成嚴重的危害；同時，化學農藥不易降解，高殘留，對人畜極不安全，這些都嚴重限制了其在將來農業(yè)生產上的應用。因此，在推行無公害農藥和可持續(xù)農業(yè)生產的今天，開發(fā)研制不易產生抗性、環(huán)境相容性較好的生物農藥已成為當今農藥發(fā)展的必然趨勢。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對目前農業(yè)生產中稻曲病防治難度大、成本高、農藥殘留、化學抗藥性日益突出等問題，目的是要克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種生產成本低、無毒、綠色環(huán)保、使用方便的沼澤紅假單胞菌菌株及其制備的相應菌劑、藥劑，并同時提供相應菌劑、藥劑的制備方法和應用，該應用可防治水稻稻曲病、提高水稻的抗病性。為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案為一株沼澤紅假單胞菌菌株，所述沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)菌株的名稱為沼澤紅假單胞菌CS-1 (即Rhodopseudomonas palustris CS-1),具體為一株光合細菌(Photosynthetic Bacterium)菌株，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)的保藏編號為CCTCC No M 2012224，保藏單位地址位于中國武漢大學，保藏日期為2012年6月12日。本發(fā)明的上述菌株經菌落和形態(tài)觀察、染色反應、常規(guī)生理生化特征實驗以及16SrDNA序列分析，鑒定為是沼澤紅假單胞菌屬中的光合細菌菌株，上述本發(fā)明的光合細菌菌株具有以下主要特征①在表觀形態(tài)上，菌落表面光滑，成規(guī)則圓形，紅色，濕潤易挑起在生理生化特性上，淀粉水解試驗反應陽性，過氧化氫酶試驗反應陽性，檸檬酸鹽試驗反應陽性，G-, V-P反應陰性，甲基紅試驗反應陰性，吲哚試驗反應陰性，脲酶試驗反應陰性，革蘭氏染色反應陰性；耐鹽性良好，氯化鈉濃度低于3%能很好生長，4% 7%生長很緩慢，大于7%時不生長；16S rDNA序列長度為1450bp，在Genbank中的登錄號為JQ863308。作為一個總的技術構思，本發(fā)明提供上述的沼澤紅假單胞菌菌株在防治水稻稻曲病或提高水稻體內過氧化氫酶活性中的應用。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑，所述生防菌劑是由上述沼澤紅假單胞菌菌株經活化、種子培養(yǎng)、生產培養(yǎng)后得到。作為一個總的技術構思，本發(fā)明相應提供上述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑的制備方法，包括以下步驟 (I)活化將上述本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；(2)種子培養(yǎng)將步驟(I)培養(yǎng)出的紅色單菌落接入至血清瓶中，在溫度為30°C 35°C、光照條件為2000Lx 3000Lx條件下，用光合細菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數生長期；(3)生產培養(yǎng)將步驟(2)種子培養(yǎng)后得到的菌液按光合細菌菌株生產培養(yǎng)基總體積的1% 5%的接種量接種到生產瓶中，用光合細菌培養(yǎng)基進行生產培養(yǎng)，在溫度為30°C 35°C、光照條件為2000Lx 3000Lx，培養(yǎng)至對數生長期；得到的培養(yǎng)液即為所述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌菌劑。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種沼澤紅假單胞菌菌株的生防藥劑，所述生防藥劑為上述生防菌劑經發(fā)酵、離心后制得的發(fā)酵上清液。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供上述生防藥劑的制備方法，包括以下步驟將所述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑發(fā)酵培養(yǎng)5d 7d,培養(yǎng)完成后在6000rpm 8000rpm條件下離心2min 4min，收集離心后的上清液，再經細菌過濾器過濾，得到生防藥劑。作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供另一種沼澤紅假單胞菌菌株的生防藥劑，所述生防藥劑為上述生防菌劑經發(fā)酵培養(yǎng)、破碎后制得的菌體破碎液。本發(fā)明還相應提供上述第二種生防藥劑的制備方法，包括以下步驟(I)將上述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑發(fā)酵培養(yǎng)5d 7d，培養(yǎng)完成后在6000rpm 8000rpm條件下離心4min 8min,棄上清，收集菌體；(2)將步驟(I)中收集的菌體用緩沖液清洗后再置于緩沖液中進行超聲波破碎；(3)將經過步驟(2)中超聲波破碎后的菌液于2°C 6°C、10000rpm HOOOrpm條件下離心8min 12min,收集的上清液即為生防藥劑。上述的制備方法中，超聲波破碎時的工藝條件優(yōu)選為超聲波強度控制在200W 400W,破碎8s IOs間隔8s IOs,超聲波破碎IOmin 15min。作為一個總的技術構思，本發(fā)明提供上述的生防菌劑或生防藥劑在防治水稻稻曲病或提高水稻體內過氧化氫酶活性中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于
I、本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌CS-I的培養(yǎng)方法簡單，生產成本低，且該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法制備得到防治水稻稻曲病的生防菌劑及生防藥劑；2、本發(fā)明菌株制備得到的生防菌劑及藥劑不僅對水稻稻曲病害有顯著防效，而且具有低毒、對人畜無害、對農作物無藥害、綠色環(huán)保、使用方便等特點；3、本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌CS-I不但對水稻稻曲病有顯著的防效，而且，菌株本身具有多種營養(yǎng)成分及活性物質，能夠有效促進作物生長，提高作物體內防御酶活性，能在一定程度上提高作物抗病性。一種沼澤紅假單胞菌 CS-1 (Rhodopseudomonas palustris CS-1),其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)的保藏編號為CCTCC No M 2012224，保藏單位地址位于中國武漢大學，保藏日期為2012年6月12日。



圖I為本發(fā)明實施例I中沼澤紅假單胞菌CCTCC M 2012224的雙層平板培養(yǎng)圖。圖2為本發(fā)明實施例5中沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑(發(fā)酵上清液)皿內抑制稻曲病菌生長的結果照片，其中a為I : 3，b為I : 2，c為I : l，d為CK，e為3 1，f 為 2 I。圖3為本發(fā)明實施例5中沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑(菌體破碎液)皿內抑制稻曲病菌生長的結果照片，其中a為CK，b為CKt^c為I : 3，d為I : 2，e為3 l，f為
2: 1， g為 I : I。圖4為本發(fā)明實施例6中沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑(發(fā)酵上清液)搖瓶內抑制稻曲病菌生長的結果照片，其中a為CK，b為CKtl, c為I : 3，d為I : 2，e為3 1，f 為 2 1，g 為 I : I。圖5為本發(fā)明實施例6中沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑(菌體破碎液)搖瓶內抑制稻曲病菌生長的結果照片，其中a為CK，b為CKtl, c為I : 3，d為I : 2，e為3 1，f 為 2 1，g 為 I : I。圖6為本發(fā)明實施例8中沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑對稻曲病菌致畸作用結果照片，其中，a為CK對照；b為本發(fā)明發(fā)酵上清液處理過的稻曲病菌菌絲照片。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。實施例I :一株本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌菌株，其名稱為沼澤紅假單胞菌CS-1，具體為一株光合細菌菌株，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCC No M 2012224，保藏單位地址位于中國武漢大學，保藏日期為2012年6月12日。本發(fā)明菌株的初始樣品是在2010年11月2日采集于湖南省農業(yè)科學院內的一口干涸水塘。當初進行初始樣品的采集時，為了保持厭氧環(huán)境及樣品新鮮，截取了水塘污泥中3cm 4cm深處的沉積物及池塘泥水混合物。將采集來的水樣取5ml、水泥樣沉淀后取5ml、污泥樣用適量的無菌水混勻后取5ml分別加入裝有IlOml光合細菌液體培養(yǎng)基的吊瓶中，置于光照強度為7500Lx、溫度為30°C的光照培養(yǎng)箱恒溫光照培養(yǎng)，定期觀察至菌液變紅時，分別取出Iml培養(yǎng)液至新鮮光合細菌液體培養(yǎng)基((NH4) 2S040. I %、MgSO4O. 02%, NaHCO3O. 5 %、K2HPO4O. 05%, NaCl O. 02%,酵母膏O. 15%，pH 7. O 7. 2)中，繼續(xù)培養(yǎng)，如此連續(xù)富集三次。用接種環(huán)分別沾取富集三代后的培養(yǎng)液，雙層平板劃線培養(yǎng)，于上述同等條件下培養(yǎng)至平板出現(xiàn)紅色菌落。將得到的不同單菌落繼續(xù)雙層平板劃線純化，反復轉接3代以上，直至獲得純化的單菌落(本實施例中沼澤紅假單胞菌菌株的雙層平板培養(yǎng)圖參見圖I)。本實施例培養(yǎng)篩選的上述菌株經菌落和菌體形態(tài)觀察、染色反應、常規(guī)生理生化特征實驗以及16S rDNA基因PCR擴增和序列分析，鑒定為是沼澤紅假單胞菌屬中的光合細菌菌株，上述本發(fā)明的光合細菌菌株具有以下主要特征①在表觀形態(tài)上，菌落表面光滑，成規(guī)則圓形，紅色，濕潤易挑起在生理生化特性上，淀粉水解試驗反應陽性，過氧化氫酶試驗反應陽性，檸檬酸鹽試驗反應陽性，G-, V-P 反應陰性，甲基紅試驗反應陰性，吲哚試驗反應陰性，脲酶試驗反應陰性，革蘭氏染色反應陰性；耐鹽性良好，氯化鈉濃度低于3%能很好生長，4% 7%生長很緩慢，大于7%時不生長；16S rDNA序列長度為1450bp，在Genbank中的登錄號為JQ863308 (具體鑒定結果參見下表I)。表I :沼澤紅假單胞菌CS-I生理生化特征實驗結果
特性結果
~淀粉水解試驗+
過氧化氫酶實驗+
檸檬酸鹽試驗+
Π引哚試驗=
甲基紅與V.P試驗二
脲酶試驗-
革蘭氏染色反應一
耐鹽性試驗氯化鈉濃度0% 3%生長良好,4% 7% __生長很緩t曼，>7%時不生長。_注表I中，“ + ”表示反應結果為陽性表示反應結果為陰性。實施例2 :沼澤紅假單胞菌CS-I生防菌劑及其制備方法。一種沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑，該生防菌劑是由上述實施例I中獲得的沼澤紅假單胞菌菌株經活化、種子培養(yǎng)、生產培養(yǎng)后得到。本實施例的生防菌劑的具體制備方法包括以下步驟(I)活化將實施例I的沼澤紅假單胞菌CCTCC M 2012224的超低溫保存種按雙層平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；采用的光合細菌固體培養(yǎng)基為(NH4)2SO4O. I %, MgSO4O. 02%, NaHCO3O. 5%, K2HPO4O. 05%, NaCl O. 02 %、酵母膏 O. 15% 和瓊脂 I. 5%, pH7. O 7· 2 ;(2)種子培養(yǎng)將步驟(I)培養(yǎng)出的紅色單菌落接入至容積為120mL左右的血清瓶中，在溫度為30°C 35°C、光照條件為2000Lx 3000Lx，用光合細菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數生長期；所用的光合細菌液體培養(yǎng)基為(NH4)2SO4O. I %、MgSO4O. 02%, NaHCO3O. 5%,K2HPO4O. 05%, NaCl O. 02%、酵母膏 O. 15%, pH 7. O 7. 2 ;(3)生產培養(yǎng)將步驟(2)培養(yǎng)得到的菌液按光合細菌菌株生產培養(yǎng)基總體積的1% 5%的接種量接種到生產瓶中，用光合細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，在溫度為30°C 35°C、光照條件為2000Lx 3000Lx條件下，培養(yǎng)至對數生長期；(4)出瓶分裝將步驟(3)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液出瓶分裝得到沼澤紅假單胞菌CCTCCM2012224生防菌劑。上述步驟(I) (4)的全流程培養(yǎng)時間為25天，培養(yǎng)結束后，菌體數量達到lX109cfu/mL 以上。實施例3 :沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑及其制備方法。一種本發(fā)明沼澤紅假單胞菌菌株的生防藥劑，該生防藥劑為實施例2中得到的生防菌劑經發(fā)酵、離心后制得的發(fā)酵上清液。本實施例的生防藥劑的制備方法，具體包括以下步驟取實施例2中制得的生防菌劑再發(fā)酵培養(yǎng)6d 8d，得到沼澤紅假單胞菌CCTCC M 2012224發(fā)酵液，在8000rpm條件下離心2min，收集離心后的上清液，將離心后的上清液用細菌過濾器過濾，得到無光合細菌菌體的無菌發(fā)酵上清液，4°C保存?zhèn)溆?。實施? :沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑及其制備方法。一種本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌菌株的生防藥劑，該生防藥劑為實施例2中得到的生防菌劑經發(fā)酵培養(yǎng)、破碎后制得的菌體破碎液。本實施例的生防藥劑的制備方法，具體包括以下步驟(I)取實施例2中制得的生防菌劑發(fā)酵培養(yǎng)6d，培養(yǎng)完成后在5000rpm條件下離心5min,棄上清,收集菌體；(2)將步驟(I)中收集的菌體用pH = 7. 5的磷酸緩沖液漂洗2 3次，再置于適量的緩沖液中進行超聲波破碎；超聲波破碎時的工藝條件控制為超聲波強度控制在300w，破碎IOs間隔IOs,超聲波破碎過程控制在IOmin冰?。粸榇_定合適的超聲次數及強度,應隨時鏡檢觀察菌體是否破碎完全；(3)將經過步驟⑵中超聲波破碎后的菌液于4°C、12000rpm條件下離心IOmin,將得到的上清液加無菌水定容到和原始培養(yǎng)體積一致，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。實施? :沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑抑制稻曲病菌生長應用實驗。取上述實施例3、實施例4得到的沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑與45°C 50°C熔融態(tài)的5XPSA培養(yǎng)基分別按照I : 3、1 2、1 1、2 1、3 I的配比混勻，制成混合平板；以不加入上述生防藥劑的PSA的培養(yǎng)基和加入光合細菌培養(yǎng)基的PSA培養(yǎng)基為對照，分別記為CK、Cl。在平板中央接入預先培養(yǎng)12d的直徑為6mm的稻曲病菌菌餅，每平板接種一片，每處理重復3次，倒置于28°C恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，逐日觀察菌絲的生長情況并記錄菌落直徑的大小，按照下列公式計算抑菌率抑菌率(％ )=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑X 100 %，菌落直徑單位厘米(cm)。經過觀察、檢測和實驗分析后，實施例3得到的沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑(發(fā)酵上清液)對稻曲病菌皿內生長的抑制作用實驗結果如下表2所示(皿內抑制稻曲病菌生長應用實驗的結果照片參見圖2)，實施例4得到的沼澤紅假單胞菌CS-I生防藥劑(菌體破碎液)對稻曲病菌皿內生長的抑制作用實驗結果如下表3所示(皿內抑制稻曲病菌生長應用實驗的結果照片參見圖3)。表2 :沼澤紅假單胞菌CS-I的生防藥劑(發(fā)酵上清液)對稻曲病菌皿內生長的抑制作用
權利要求
1.一株沼澤紅假單胞菌菌株，其特征在于所述沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)菌株的名稱為沼澤紅假單胞菌CS-1,其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為 CCTCC No M 2012224。
2.一種如權利要求I所述的沼澤紅假單胞菌菌株在防治水稻稻曲病或提高水稻體內過氧化氫酶活性中的應用。
3.—種沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑，其特征在于所述生防菌劑是由權利要求I所述沼澤紅假單胞菌菌株經活化、種子培養(yǎng)、生產培養(yǎng)后得到。
4.一種沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑的制備方法，包括以下步驟 (1)活化將權利要求I所述沼澤紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)； (2)種子培養(yǎng)將步驟(I)培養(yǎng)出的紅色單菌落接入至血清瓶中，在溫度為30°C 35°C、光照條件為2000Lx 3000Lx、自然pH條件下，用光合細菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數生長期； (3)生產培養(yǎng)將步驟(2)種子培養(yǎng)后得到的菌液按光合細菌菌株生產培養(yǎng)基總體積的1% 5%的接種量接種到生產瓶中，用光合細菌培養(yǎng)基進行生產培養(yǎng)，在溫度為30°C 35°C、光照條件為2000LX 3000LX，培養(yǎng)至對數生長期；得到的培養(yǎng)液即為所述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑。
5.一種沼澤紅假單胞菌菌株的生防藥劑，所述生防藥劑為權利要求3所述生防菌劑經發(fā)酵、離心后制得的發(fā)酵上清液。
6.一種如權利要求5所述生防藥劑的制備方法，包括以下步驟將所述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑發(fā)酵培養(yǎng)5d 7d,培養(yǎng)完成后在6000rpm 8000rpm條件下離心2min 4min，收集離心后的上清液，再經細菌過濾器過濾，得到生防藥劑。
7.—種沼澤紅假單胞菌菌株的生防藥劑，所述生防藥劑為權利要求3所述生防菌劑經發(fā)酵培養(yǎng)、破碎后制得的菌體破碎液。
8.—種如權利要求7所述生防藥劑的制備方法，包括以下步驟 (1)將所述沼澤紅假單胞菌菌株的生防菌劑發(fā)酵培養(yǎng)5d 7d,培養(yǎng)完成后在6000rpm 8000rpm條件下離心4min 8min,棄上清，收集菌體； (2)將步驟(I)中收集的菌體用緩沖液清洗后再置于緩沖液中進行超聲波破碎； (3)將經過步驟(2)中超聲波破碎后的菌液于2°C 6°C、IOOOOrpm HOOOrpm條件下離心8min 12min,收集的上清液即為生防藥劑。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎時的工藝條件為超聲波強度控制在200W 400W，破碎8s IOs間隔8s 10s，超聲波破碎IOmin 15min。
10.一種如權利要求3所述生防菌劑、權利要求5或7所述生防藥劑在防治水稻稻曲病或提高水稻體內過氧化氫酶活性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沼澤紅假單胞菌CCTCC M 2012224及其在防治水稻稻曲病或提高水稻體內過氧化氫酶活性中的應用，還公開了該菌株經活化、種子培養(yǎng)、生產培養(yǎng)后制得的生防菌劑；用該生防菌劑經發(fā)酵、離心后制得的發(fā)酵上清液可以作為生防藥劑，用該生防菌劑經發(fā)酵培養(yǎng)、破碎后制得的菌體破碎液也可作為生防藥劑，本發(fā)明的生防菌劑、生防藥劑均可用于防治水稻稻曲病或提高水稻體內過氧化氫酶活性。本發(fā)明產品具有生產成本低、無毒、綠色環(huán)保、使用方便等優(yōu)點，可有效防治水稻稻曲病，提高水稻的抗病性。
文檔編號A01P3/00GK102876615SQ20121039495
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權日2012年10月17日
發(fā)明者劉勇, 陳莎, 張松柏, 張德詠, 羅香文, 彭靜, 程菊娥, 譚新球, 成飛雪, 朱春暉, 楊春曉 申請人:湖南省植物保護研究所