專利名稱：一種人工培養(yǎng)長座蟲草子實體的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥用真菌的人工培養(yǎng)方法技術領域，具體涉及用長座被毛孢{Hirsutella Iongissima )菌種進行培養(yǎng)形成長座蟲草子實體。
背景技術：
泛義的蟲草是一大類昆蟲病原真菌，它包含了四個屬，這些真菌主要寄生于昆蟲、蜘蛛和某些大團囊菌的某些地下種類的子實體上，利用寄主的營養(yǎng)完成其生活史的蟲菌復合體。它是一類復型真菌，在其生活史中有產生分生孢子的無性階段和產生子囊孢子的有性階段。蟲草類真菌含有多種生物活性物質，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗病原、抗氧化、抗輻射、殺蟲、鈣離子拮抗及增強人體免疫功能等功能，它們在醫(yī)藥、農業(yè)、食品工業(yè)及現代生物技術的應用中皆有十分重要的意義。冬蟲夏草辦Aiocor辦ceps sinensis、
Paecilomyces cicadae > 1 ^ ji, JfL Elaphocordyceps ophioglossoides > 蟲甬蟲草Cordyceps mi Ii tar is和古尼蟲草C gunnii是其中幾種著名的蟲草類真菌,具有較高的食藥用價值。研究蟲草子實體的人工培養(yǎng)，不僅對于確定蟲草無性型和有性型的對應關系以及在人為控制條件下研究蟲草的分化具有重要的理論意義，而且為人工馴化并開發(fā)冬蟲夏草、蟬花等藥用價值真菌提供了寶貴的資源，因此受到廣泛關注。然而目前有關成功培養(yǎng)蟲草子實體的報道并不多，尤其是能進行大規(guī)模生產并申請專利的蟲草只局限于少數幾種，如蛹蟲草、蟬花、臺灣蟲草等。長座蟲草辦ce/751 longissima (Kobayasi)是寄生于同翅目蝶若蟲上的一類重要的蟲生真菌，主要分布于中國、日本和韓國。長座蟲草于1963年首次在日本被發(fā)現并命名。1999年，李春如等在我國安徽省霍山縣首次采到此長座蟲草，經鑒定，其無性型為長座被毛孢longissima Li et al.新種,并在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)出了近成熟的子座和孢梗束。野生長座蟲草在野外經常有被動物啃食的現象，推測其可能具有食用價值。目前，關于長座蟲草的研究報道很少。本實驗室在其成分、藥理、毒理方面做了一系列研究，研究結果會陸續(xù)報道。長座蟲草可能作為一種潛在的食藥用真菌進行開發(fā)。目前，國內外還沒有關于長座蟲草子實體培養(yǎng)方法的報道與專利，加之野生長座蟲草資源也較少，所以人工培養(yǎng)其子實體是解決開發(fā)利用該資源這一問題的有效途徑之
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發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種人工培養(yǎng)長座蟲草子實體的方法，具體來說是利用其無性型-長座被毛孢iHirsutella longissima )菌株,經過液體培養(yǎng)和固體基質培養(yǎng)誘導出子實體，為將來大規(guī)模培養(yǎng)和開發(fā)利用長座蟲草提供了技術參數并奠定了良好的基礎。實現上述目的具體技術解決方案如下本發(fā)明所用的長座被毛孢(Hirsutella longissima)菌株,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2012年03月02日，保藏編號CGMCC No. 5826。人工培養(yǎng)長座蟲草子實體的具體操作步驟如下
A、斜面試管菌種活化培養(yǎng)
將長座被毛孢菌種點接于斜面試管培養(yǎng)基，溫度25°C培養(yǎng)10 15d，得到斜面菌種；
斜面試管培養(yǎng)基的原料和重量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，加水至1000ml，自然pH;
B、液體搖瓶種子培養(yǎng)
在250ml容器中裝入IOOml液體搖瓶種子培養(yǎng)基，在高溫高壓下滅菌，待自然冷卻至室溫，將斜面菌種接種到液體搖瓶種子培養(yǎng)基上，在溫度25土1°C、轉速130r/min、黑暗條件·下恒溫振蕩培養(yǎng)10d，得到液體搖瓶種子；
液體搖瓶種子擴大培養(yǎng)在500ml容器中裝入200ml液體搖瓶種子培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌，待自然冷卻至室溫，用高速勻漿器將所述液體搖瓶種子打散，接種到500ml容器的液體搖瓶種子培養(yǎng)基中，每瓶接種量為20ml，在溫度25土1°C、轉速130r/min、黑暗條件下恒溫振蕩培養(yǎng)9d,得到擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子；
液體搖瓶種子培養(yǎng)基的原料和重量為葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g，加水至 1000ml,自然 pH ;
C、菌絲培養(yǎng)
在400ml容器中加入20g小麥片，按料液比1:2的比例加入子實體栽培營養(yǎng)液，攪拌均勻，封口，浸泡2小時，溫度121°C高溫滅菌20min，自然冷卻，得到固體培養(yǎng)基；用高速分散器將擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子打散，作為種子液接種到固體培養(yǎng)基上，每瓶接種量為9ml ；緊密封口，置于25 V的人工氣候箱中，溫度25 V，培養(yǎng)l(Tl5d，菌絲培養(yǎng)階段，需保持黑暗條件，使菌絲鋪滿固體培養(yǎng)基表面；子實體栽培營養(yǎng)液的原料和重量為馬鈴薯200g、黃粉蟲粉100g、葡萄糖10g、麥芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸鎂I. 5g、磷酸二氫鉀3g、復合維生素B280mg L—1、檸檬酸三胺 0. 4g，加水至 1000ml, pH6 ；
D、子實體培養(yǎng)
將菌絲鋪滿固體培養(yǎng)基表面的容器置于溫度為25± I°C條件下的人工模擬環(huán)境培養(yǎng)室中培養(yǎng)；在子實體培養(yǎng)階段保證連續(xù)的光照，光照強度為I 2001ux，光照時間24h ;在子實體基本長滿罐頭培養(yǎng)瓶，幾乎不再生長并保持健壯的時候采收，即得到人工培養(yǎng)的長座蟲草子實體；人工培養(yǎng)的長座蟲草的子實體有時混有大量白色孢梗束，子實體致密，子座棒狀，單生或分枝，肉桂色，高約f 7cm，直徑I 3_ ;孢梗束叢生，致密，白色或白色略帶微紅色；在子實體培養(yǎng)后期，子座頂部或側面也會生出大量白色孢梗束。本發(fā)明的有益技術效果體現在以下方面
1.本發(fā)明首創(chuàng)了人工培養(yǎng)長座蟲草子實體的方法，利用該方法可以大規(guī)模地進行長座蟲草子實體的培養(yǎng)，不僅解決了野生長座蟲草資源的匱乏，而且為將來長座蟲草的藥食用價值探索、綜合開發(fā)利用奠定了堅實的基礎；
2.本發(fā)明采用長座蟲草的無性型-長座被毛孢longissinm)作大子實體栽培菌株，可以有效保留優(yōu)良菌株的特性；采用對數生長期的液體搖瓶種子接種，子實體生長快、產量高；用無毒的罐頭瓶和耐高溫聚丙烯膜生產保證其安全性；
3.本發(fā)明生產工藝簡單、成本低、原料來源廣泛、無毒、無污染，可大規(guī)模生產，為將來長座蟲草藥食用價值的開發(fā)利用提供了寶貴的資源；
4.本發(fā)明的子實體可以根據市場需求制成各種形態(tài)的產品，既可以將子實體制成有效成分易溶的顆粒體，又可經過處理制成膠囊，便于商品化銷售。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步地描述。 實施例
長座被毛孢{Hirsutella longissima )菌種的獲得可以通過野外采集成熟的長座蟲草，收集彈射的子囊孢子，轉移至無菌的培養(yǎng)基上分離純化而得，也可以將野生長座蟲草內菌核、子座柄部或可孕部分經表面消毒后采用組織分離的方法分離純化獲得。本發(fā)明所用的長座被毛孢longissima)菌株,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號CGMCC No. 5826。長座蟲草子實體的具體培養(yǎng)操作步驟如下
A、斜面試管菌種活化培養(yǎng)
將長座被毛孢菌種點接于斜面試管培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)10 15d，得到斜面菌種。斜面試管培養(yǎng)基的原料和重量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，加水至1000ml,自然pH;
B、液體搖瓶種子培養(yǎng)
在250ml三角瓶中裝入IOOml液體搖瓶種子培養(yǎng)基，在121 °C高溫、I X IO5Pa高壓下滅菌20min，待自然冷卻至室溫，將斜面菌種接種到液體搖瓶種子培養(yǎng)基上，在溫度25±1°C、轉速130r/min、黑暗條件下恒溫振蕩培養(yǎng)10d，得到液體搖瓶種子。液體搖瓶種子擴大培養(yǎng)在500ml三角瓶中裝入200ml液體搖瓶種子培養(yǎng)基，在121°C高溫、I X IO5Pa高壓下滅菌20min，待自然冷卻至室溫，用高速勻漿器將所述液體搖瓶種子打散，用移液槍接種到500ml三角瓶的液體搖瓶種子培養(yǎng)基中，每瓶接種量為20ml，在溫度25±1°C、轉速130r/min、黑暗條件下恒溫振蕩培養(yǎng)9d，得到擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子。液體搖瓶種子培養(yǎng)基的原料和重量為葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g，加水至1000ml，自然pH ;
C、菌絲培養(yǎng)
在400ml干凈的罐頭培養(yǎng)瓶中加入20g小麥片，按料液比1:2的比例加入子實體栽培營養(yǎng)液，攪拌均勻，用耐高溫聚丙烯封口膜覆蓋，并用皮筋扎緊封口，浸泡2小時，溫度121°C高溫滅菌20min，自然冷卻，得到固體培養(yǎng)基；用高速分散器將擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子打散，將擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子接種到固體培養(yǎng)基上，每瓶接種量為9ml ;緊密封口，外面用黑色塑料袋包裹，置于25°C的人工氣候箱中，溫度25°C，培養(yǎng)l(Tl5d，菌絲培養(yǎng)階段，需保持黑暗條件，使菌絲鋪滿固體培養(yǎng)基表面；子實體栽培營養(yǎng)液的原料和重量為馬鈴薯200g、黃粉蟲粉100g、葡萄糖10g、麥芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸鎂I. 5g、磷酸二氫鉀3g、復合維生素B 280mg L'梓檬酸三胺0. 4g，加水至1000ml, pH6 ；
D、子實體培養(yǎng)將菌絲鋪滿固體培養(yǎng)基表面的罐頭培養(yǎng)瓶置于溫度為25土TC條件下的人工模擬環(huán)境培養(yǎng)室中培養(yǎng)；在子實體培養(yǎng)階段打開培養(yǎng)室光源，撤去黑色塑料袋，保證連續(xù)的光照，光照強度為I 2001ux，光照時間24h ;在子實體基本長滿罐頭培養(yǎng)瓶，幾乎不再生長并保持健壯的時候采收，即得到人工培養(yǎng)的長座蟲草子實體。人工培養(yǎng)的長座蟲草的子實體有時混有大量白色孢梗束，子實體致密，子座棒狀，單生或分枝，肉桂色，高約f 7cm，直徑I 3_;孢梗束叢生，致密，白色或白色略帶微紅色；在子實體培養(yǎng)后期，子座頂部或側面也會生出大量白色孢梗束。
權利要求
1.一種人工培養(yǎng)長座蟲草子實體的方法，其特征在于所用長座被毛孢Iongissima^菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號CGMCC No. 5826 ;具體培養(yǎng)操作步驟如下 A、斜面試管菌種活化培養(yǎng) 將長座被毛孢菌種點接于斜面試管培養(yǎng)基，溫度25°C培養(yǎng)10 15d，得到斜面菌種； 斜面試管培養(yǎng)基的原料和重量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，加水至1000ml，自然pH; B、液體搖瓶種子培養(yǎng) 在250ml容器中裝入IOOml液體搖瓶種子培養(yǎng)基，在高溫高壓下滅菌，待自然冷卻至室溫，將斜面菌種接種到液體搖瓶種子培養(yǎng)基上，在溫度25土1°C、轉速130r/min、黑暗條件下恒溫振蕩培養(yǎng)10d，得到液體搖瓶種子； 液體搖瓶種子擴大培養(yǎng)在500ml容器中裝入200ml液體搖瓶種子培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌，待自然冷卻至室溫，用高速勻漿器將所述液體搖瓶種子打散，接種到500ml容器的液體搖瓶種子培養(yǎng)基中，每瓶接種量為20ml，在溫度25土1°C、轉速130r/min、黑暗條件下恒溫振蕩培養(yǎng)9d,得到擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子； 液體搖瓶種子培養(yǎng)基的原料和重量為葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g，加水至 1000ml,自然 pH ; C、菌絲培養(yǎng) 在400ml容器中加入20g小麥片，按料液比1:2的比例加入子實體栽培營養(yǎng)液，攪拌均勻，封口，浸泡2小時，溫度121°C高溫滅菌20min，自然冷卻，得到固體培養(yǎng)基；用高速分散器將擴大培養(yǎng)的液體搖瓶種子打散，作為種子液接種到固體培養(yǎng)基上，每瓶接種量為9ml ；緊密封口，置于25 V的人工氣候箱中，溫度25 V，培養(yǎng)l(Tl5d，菌絲培養(yǎng)階段，需保持黑暗條件，使菌絲鋪滿固體培養(yǎng)基表面； 子實體栽培營養(yǎng)液的原料和重量為馬鈴薯200g、黃粉蟲粉100g、葡萄糖10g、麥芽糖10g、蛋白胨10g、硫酸鎂I. 5g、磷酸二氫鉀3g、復合維生素B 280mg L'朽1檬酸三胺0. 4g,加水至 1000ml, pH6 ； D、子實體培養(yǎng) 將菌絲鋪滿固體培養(yǎng)基表面的容器置于溫度為25± I°C條件下的人工模擬環(huán)境培養(yǎng)室中培養(yǎng)；在子實體培養(yǎng)階段保證連續(xù)的光照，光照強度為I 2001ux，光照時間24h ;在子實體基本長滿罐頭培養(yǎng)瓶，幾乎不再生長并保持健壯的時候采收，即得到人工培養(yǎng)的長座蟲草子實體；人工培養(yǎng)的長座蟲草的子實體有時混有大量白色孢梗束，子實體致密，子座棒狀，單生或分枝，肉桂色，高約f 7cm，直徑I 3_ ;孢梗束叢生，致密，白色或白色略帶微紅色；在子實體培養(yǎng)后期，子座頂部或側面也會生出大量白色孢梗束。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工培養(yǎng)長座蟲草子實體的方法。所用菌種為長座蟲草無性型-長座被毛孢(Hirsutella longissima)，其具體培養(yǎng)步驟如下A.斜面試管菌種活化培養(yǎng)；B.液體搖瓶種子培養(yǎng)；C.菌絲階段培養(yǎng)；D.子實體培養(yǎng)。人工培養(yǎng)的長座蟲草子實體子座棒狀，單生或分枝，肉桂色，長度1～7cm，直徑1～3mm，子實體培養(yǎng)后期在子座頂端或側面會生出大量白色孢梗束，致密。本發(fā)明為首創(chuàng)，利用該方法可以大規(guī)模地進行長座蟲草子實體的培養(yǎng)，不僅解決了野生長座蟲草資源的匱乏，而且為將來長座蟲草藥食用價值的綜合開發(fā)和工廠化生產奠定基礎和提供技術保障。本發(fā)明生產工藝簡單、成本低、原料來源廣泛、無毒、無污染，可大規(guī)模生產。
文檔編號A01G1/04GK102742454SQ20121018069
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權日2012年6月5日
發(fā)明者丁海燕, 劉洋, 李春如, 樊美珍, 潘丹丹 申請人:安徽農業(yè)大學