專利名稱：加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體涉及加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注環(huán)境污染，生態(tài)平衡和人類健康等問(wèn)題。尤其是對(duì)食品品質(zhì)要求也越來(lái)越高。無(wú)公害蔬菜和緑色食品，已經(jīng)得到全社會(huì)的公認(rèn)。開(kāi)發(fā)和利用生物農(nóng)藥，開(kāi)展生物防治，勢(shì)在必行。當(dāng)前，微生物農(nóng)藥在開(kāi)展生物防治中將大顯身手。因?yàn)樗哂忻黠@優(yōu)點(diǎn)對(duì)環(huán)境安全，無(wú)公害，無(wú)殘留，不易產(chǎn)生抗 性，生產(chǎn)成本低，發(fā)酵エ藝簡(jiǎn)単，對(duì)非靶標(biāo)生物安全。作為微生物農(nóng)藥來(lái)源之一的植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)在宿主植物長(zhǎng)期相互作用、協(xié)同進(jìn)化、互相適應(yīng)過(guò)程中，在植物體內(nèi)維持了微生態(tài)系統(tǒng)平衡。同時(shí)，為了保持這種平衡，植物內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與其周邊環(huán)境(即宿主植物)相似或相同作用的次生代謝產(chǎn)物。因此，可以認(rèn)為植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物可以替代宿主植物的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而作為新化合物、新藥物篩選的潛在或替代資源，從而可以有效降低新藥物或其它用途活性物質(zhì)的研發(fā)成本。加拿大一枝黃花canadensis)作為ー種外來(lái)物種，繁埴カ極強(qiáng),傳播速度快，生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯，生態(tài)適應(yīng)性廣闊，與周圍植物爭(zhēng)陽(yáng)光、爭(zhēng)肥料，直至其它植物死亡，從而對(duì)生物多祥性構(gòu)成嚴(yán)重威脅。加拿大一枝黃花可做觀賞切花、飼料、蜜源，同時(shí)可用干天然色素的生產(chǎn)和提煉精油。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)加拿大一枝黃花體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化、自由基消除活性和多種抑菌活性的黃酮類成分。此外還有報(bào)道加拿大一枝黃花的植物浸提液對(duì)許多雜草(如光頭稗和大狗尾草)及多種蔬菜(紫花苜蓿、紅莧菜、小麥、大豆和棉花)的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)具有顯著的化感作用。根據(jù)植物內(nèi)生真菌內(nèi)共生理論，加拿大一枝黃花很有可能存在著特殊的內(nèi)生真菌，通過(guò)產(chǎn)生特殊的具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌抑菌活性的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有較強(qiáng)的抑制植物病原真菌活性的加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的制備方法。本發(fā)明所述的加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌命名為球毛殼菌yt03 (.Chaetomiumglobosum yt03)，現(xiàn)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5088。本發(fā)明所描述的加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌系從中國(guó)安徽省合肥市加拿大一枝黃花{SoIidgo canadensis)植物活體中分離得到的。加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌命名為球毛殼菌Woかxs yt03),保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5088 ；本發(fā)明加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的具體發(fā)酵制備操作步驟如下
(1)菌種活化
在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取少許加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌試管斜面保藏菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴 薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)溫度28°C 土 rc，活化培養(yǎng)5 7天，得到活化菌種；
(2)種子培養(yǎng)
用無(wú)菌打孔器(內(nèi)徑5mm)在無(wú)菌條件下將活化菌種打成直接為5mm菌碟，接種5塊菌碟于含有50ml液體培養(yǎng)基的三角搖瓶?jī)?nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分,溫度280C ±2°C，培養(yǎng)2 3天，得搖床種子；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
將搖床種子接種到裝有50ml液體培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，接種量5%，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ±2°C，培養(yǎng)5 7天，得到加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌發(fā)酵液；加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌發(fā)酵液在無(wú)菌條件下過(guò)濾除去菌絲體，過(guò)0. 22微米過(guò)濾器，即得到加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液；
發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第I天，菌體為少量灰色的粉末；培養(yǎng)第3天，淡粉色的細(xì)粉末減少，出現(xiàn)黑色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，黑色菌絲球繼續(xù)增多，并且體積變大，發(fā)酵液為黃褐色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量黑色的菌絲球，體積也變大，發(fā)酵液為褐色；
所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I
升;
所述液體培養(yǎng)基蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化鈣0.5克，磷酸氫二鉀0. I克，硫酸亞鐵0. 01克,硝酸鈉I克,水1000毫升，pH自然；
使用前以上述兩種培養(yǎng)基在溫度121°C、壓力0. IMPa下滅菌30 min。本發(fā)明通過(guò)對(duì)球毛殼菌yt03的抗菌發(fā)酵液的抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)供試六種植物病原真菌(即辣椒疫霉病菌iPhytophthora capsici),番爺枯萎病菌ifusariumoxysporum)，蘋(píng)果腐爛病菌〈Cytospora mandshurica)，蘋(píng)果炭疽病菌(Colle to trichumgloeosporioides),率炭疽病菌(Gloelsporium fructigenum),小麥赤霉病菌(/7W1Sari應(yīng)
具有較為明顯的抑制菌絲生長(zhǎng)作用。本發(fā)明利用植物內(nèi)生真菌資源，以求獲得抗植物病原真菌病害新型農(nóng)用抗生素類天然成分。本發(fā)明所述加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的抗菌試驗(yàn)如下
1.植物病原真菌
辣椒疫霉病菌{Phytoph thora capsici ),番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum),蘋(píng)果腐爛病菌(Qytospora mandshuri ca),蘋(píng)果炭疽病 HCo I Ietotrichumgloeospori oi des )，率炭疽病菌(Gloelspori um fruc tigenum)，小麥赤霉病菌 QFusari umgraminearum )；
2.病原微生物的培養(yǎng)
取病原菌的斜面培養(yǎng)物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板活化，在(28±2) °C恒溫箱中培養(yǎng)5天；
3.抑制菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抗菌活性
在100毫升的無(wú)菌三角瓶中加入6毫升本發(fā)明制備的加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液和54毫升馬鈴薯葡萄糖瓊脂無(wú)菌融化的培養(yǎng)基，搖勻，分別各取10毫升置于直徑為9厘米無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，冷卻后在每個(gè)培養(yǎng)基平面放入I個(gè)供試病原菌菌餅(直徑為6毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養(yǎng)基表面，將平板置于28±1°C培養(yǎng)96小吋。采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑，用下述公式計(jì)算抑制率
權(quán)利要求
1.加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于所述加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌命名為球毛殼菌yt03 (.Chaetomium globosum yt03),保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5088 ； 具體發(fā)酵制備操作步驟如下 (1)菌種活化 在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取少許加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌試管斜面保藏菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，置培養(yǎng)箱內(nèi)溫度28°c 土rc，活化培養(yǎng)5 7天，得到活化菌種； (2)種子培養(yǎng) 用無(wú)菌打孔器(內(nèi)徑5mm)在無(wú)菌條件下將活化菌種打成直接為5mm菌碟，接種5塊菌碟于含有50ml液體培養(yǎng)基的三角搖瓶?jī)?nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分,溫度280C ±2°C，培養(yǎng)2 3天，得搖床種子； (3)發(fā)酵培養(yǎng) 將搖床種子接種到裝有50ml液體培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，接種量5%，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ±2°C，培養(yǎng)5 7天，得到加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌發(fā)酵液；加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌發(fā)酵液在無(wú)菌條件下過(guò)濾除去菌絲體，過(guò)0. 22微米過(guò)濾器，即得到加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液； 發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第I天，菌體為少量灰色的粉末；培養(yǎng)第3天，淡粉色的細(xì)粉末減少，出現(xiàn)黑色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，黑色菌絲球繼續(xù)增多，并且體積變大，發(fā)酵液為黃褐色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量黑色的菌絲球，體積也變大，發(fā)酵液為褐色； 所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升; 所述液體培養(yǎng)基蛋白胨15克，葡萄糖20克，氯化鈣0.5克，磷酸氫二鉀0. I克，硫酸亞鐵0. 01克,硝酸鈉I克,水1000毫升，pH自然； 使用前上述兩種培養(yǎng)基在溫度121°C、壓力0. IMPa下滅菌30 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液的制備方法。該方法包括以下操作步驟1.菌株活化，2.一級(jí)種子培養(yǎng)，3.二級(jí)種子培養(yǎng)，4.發(fā)酵培養(yǎng)，得到加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌發(fā)酵液，發(fā)酵液為褐色；加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌發(fā)酵液在無(wú)菌條件下過(guò)濾除去菌絲體，過(guò)0.22微米過(guò)濾器，即得到加拿大一枝黃花內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液。本發(fā)明明確了具有廣譜抗菌活性的球毛殼菌yt03(Chaetomiumglobosumyt03)菌株的抗菌發(fā)酵液的制備方法，通過(guò)對(duì)球毛殼菌yt03抗菌發(fā)酵液的抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液對(duì)供試六種植物病原真菌具有較為顯著的抑制菌絲生長(zhǎng)作用。
文檔編號(hào)A01N63/04GK102719363SQ201210180678
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者吳祥為, 唐俊, 操海群, 李學(xué)德, 柏鈺, 花日茂, 郭正彥 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)