專利名稱：一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金錢松植物的組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
金錢松是我國特有的古老孑遺松科樹種。根據(jù)世界保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)新制定的物種受威脅的分類系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)和中國植物紅皮書的標(biāo)準(zhǔn)，金錢松被定為漸危種，并被列為國家二級保護(hù)植物。金錢松既是重要的園林植物，同時更是一種重要的、應(yīng)用前景廣闊的藥用植物。研究發(fā)現(xiàn)，金錢松最主要的藥用成分是從其樹皮和根皮中提取出來的二萜類化合物土槿酸， 它具有抗腫瘤、抗真菌、抗早孕和使膽囊自截等功效，尤其是抗腫瘤的功效使得金錢松的藥用價值更加凸顯?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，土槿酸及其衍生物能作用于多種癌細(xì)胞，如胃癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞等，并具有明顯的量效關(guān)系。土槿酸及其衍生物的抗癌機(jī)制是通過破壞腫瘤細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，在細(xì)胞凋亡過程中土槿酸及其衍生物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體和細(xì)胞凋亡峰，上調(diào)凋亡基因的表達(dá)，促凋亡蛋白與線粒體電壓依賴性陰離子通道相互作用促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔高水平開放的直接效應(yīng)是導(dǎo)致線粒體膜電位下降，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。大量開展人工栽種金錢松是解決當(dāng)前金錢松藥材短缺的重要途徑。目前金錢松人工種植主要采用有性繁殖和無性繁殖兩種方式。有性繁殖即種子繁殖，由于金錢松存在結(jié)實(shí)率低、結(jié)實(shí)間隔期較長(一般3 5年結(jié)實(shí))、采種條件苛刻(采種母樹年齡以100年左右為最好)、種子成活率低(僅為60% -70% )、以及種子需低溫保存等因素的限制，因此目前還不可能通過有性繁殖大量種植金錢松。無性繁殖即扦插繁殖，金錢松為菌根性樹種，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土內(nèi)有菌的林間育苗，植物生長周期長， 并易受金錢松小卷蛾的嚴(yán)重危害，這些因素限制了金錢松的大量無性繁殖。利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用植物具有生長周期短，繁殖率高、能有效避免災(zāi)害性氣候?qū)χ参锷L的不利影響等優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。目前還未見有關(guān)利用組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模地生產(chǎn)金錢松有效成分的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養(yǎng)方法，該方法能實(shí)現(xiàn)對愈傷組織的有效誘導(dǎo)和快速增殖，以解決當(dāng)前金錢松藥材資源短缺的問題。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方法包括下列步驟(I)材料的選取和消毒選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝?nèi)パ可系难亏[片后將芽放在超凈工作臺上，先用濃度為70%的酒精消毒10 50s，再用濃度為0. 1% 0. 15%的升萊消毒3 25min,最后用無菌水沖洗2 5次后用已滅菌的濾紙吸干水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)取已消毒的芽，切取芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+6-BA1. 0 2. Omg .!^+NAAO. I I. Omg *L_1+IAA 0. I 0. 5mg .171+ 蔗糖20 50g L—1+瓊脂5. 0 7. Og L—1中進(jìn)行培養(yǎng)，pH值為5. 6 6. 5，培養(yǎng)溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強(qiáng)度為1000 20001x ；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)選取無褐變、顏色為翠綠色、質(zhì)地較緊密的愈傷組織，將其切成大小為3 8mm3的團(tuán)塊后轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0. 5
I.Omg L i+NAA 0. I I. Omg .L1+ 鹿糖 20 50g .L1+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 或 MS+6-BA
0.5 I. Omg L i+IAA 0. I I. Omg .L1+ 鹿糖 20 50g .L1+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 中進(jìn)行培養(yǎng)，PH值為5. 6 6. 5，培養(yǎng)溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強(qiáng)度為1000 20001xo本發(fā)明通過對金錢松愈傷組織的有效誘導(dǎo)和快速增殖，縮短了金錢松藥材的生長周期、降低了生產(chǎn)成本，且能實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)，從而可有效解決當(dāng)前金錢松植物資源和藥材資源短缺的問題；并且所生產(chǎn)的金錢松藥材不變性，有效成分含量高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(I)材料的選取和消毒選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝?nèi)パ可系难亏[片后將芽放在超凈工作臺上，先用濃度為70 %的酒精消毒30s，再用濃度為
0.I %的升汞消毒15min，最后用無菌水沖洗4次后用已滅菌的濾紙吸干水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)取已消毒的芽，切取芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA I. Omg .171+NAA 0. 3mg L^+IAA 0. Img .171+蔗糖 30g .171+瓊脂
6.5g T1中進(jìn)行培養(yǎng)，pH值為6. 0，培養(yǎng)溫度25°C、每天光照12小時、光照強(qiáng)度為15001x， 培養(yǎng)40d后愈傷組織誘導(dǎo)率為98% ；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)選取無褐變、顏色為翠綠色、質(zhì)地較緊密的愈傷組織，將其切成大小為5mm3的團(tuán)塊后轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS+6-BA I. Omg P+NAA
0.5mg L-1+蔗糖30g L-1+瓊脂6. 5g L-1中進(jìn)行培養(yǎng)，pH值為6. 0，培養(yǎng)溫度25°C、每天光照12小時、光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)40天后愈傷組織增殖4倍。實(shí)施例2將實(shí)施例I步驟(2)中的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基改為MS+6-BA 2. Omg L^+NAA 0. 5mg L^+IAAO. 3mg L—1+蔗糖30g L—1+瓊脂6. 5g L_S其它步驟同實(shí)施例1，外植體培養(yǎng)40d后愈傷組織誘導(dǎo)率為85%。實(shí)施例3將實(shí)施例I步驟(3)中的愈傷組織增殖培養(yǎng)基改為MS+6-BA I. Omg L^+IAA
0.5mg L-1+蔗糖30g L-1+瓊脂6. 5g L-1，其它步驟同實(shí)施例1，培養(yǎng)40天后愈傷組織增殖I. 8倍。實(shí)施例4將實(shí)施例I步驟(3)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)溫度改為5°C，其它步驟同實(shí)施例1， 培養(yǎng)40天后愈傷組織的增殖倍數(shù)不足I倍。
實(shí)施例5將實(shí)施例I步驟(3)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)條件改為每天光照24小時，其它步驟同實(shí)施例1，培養(yǎng)40天后愈傷組織增殖3倍。實(shí)施例6將實(shí)施例I步驟(3)中愈傷組織的增殖培養(yǎng)條件改為每天無光照，其它步驟同實(shí)施例1，培養(yǎng)40天后愈傷組織增殖I. 5倍。比較實(shí)施例將實(shí)施例I步驟(2)中誘導(dǎo)愈傷組織的外植體改為芽，其它步驟同實(shí)施例1，芽外植體在培養(yǎng)40d后的愈傷組織誘導(dǎo)率僅為65%，說明外植體的選擇對愈傷組織的誘導(dǎo)率影響較大。
權(quán)利要求
1.一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟(1)材料的選取和消毒選取落葉后生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝?nèi)パ可系难亏[片后將芽放在超凈工作臺上，先用濃度為70%的酒精消毒10 50s，再用濃度為 0. 1% 0. 15%的升萊消毒3 25min,最后用無菌水沖洗2 5次后用已滅菌的濾紙吸干水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)取已消毒的芽，切取芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+6-BA I. 0 2. Omg L :+NAA 0. I I. Omg L :+IAA 0. I 0. 5mg .L1+ 蔗糖20 50g L—1+瓊脂5. 0 7. Og L—1中進(jìn)行培養(yǎng)，pH值為5. 6 6. 5，培養(yǎng)溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強(qiáng)度為1000 20001x ；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)選取無褐變、顏色為翠綠色、質(zhì)地較緊密的愈傷組織，將其切成大小為3 8mm3的團(tuán)塊后轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0. 5 I. Omg -L^+NAA0.I I. Omg L :+ 糖 20 50g L 丨+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 或 MS+6-BA 0. 5 1.Omg L i+IAA 0. I I. Omg .L1+ 鹿糖 20 50g .L1+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 中進(jìn)行培養(yǎng)， pH值為5. 6 6. 5，培養(yǎng)溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強(qiáng)度為1000 20001x。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養(yǎng)方法，該方法是先將金錢松的芽進(jìn)行消毒處理，再切取消毒后的芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0～2.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+IAA 0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+瓊脂5.0～7.0g·L-1和增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+瓊脂5.0～7.0g·L-1或MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+IAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+瓊脂5.0～7.0g·L-1中進(jìn)行培養(yǎng)，最終實(shí)現(xiàn)了對金錢松植物愈傷組織的有效誘導(dǎo)和快速增殖。本發(fā)明有效地解決了當(dāng)前金錢松藥材資源短缺的問題。
文檔編號A01H4/00GK102599064SQ20121010486
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月11日
發(fā)明者劉洪明, 唐旭, 孫雁霞, 李紅梅, 楊小萍, 王丹, 王強(qiáng), 王杰, 王躍華, 蔡銳, 袁暢, 黃興 申請人:成都大學(xué)