專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種用于潮間帶海綿實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用海綿外植體培養(yǎng)方法生產(chǎn)海綿生物量的技術(shù)，具體地說(shuō)是建立一種在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工培養(yǎng)潮間帶海綿的方法。
背景技術(shù)：
：目前已知的海洋生物中，海綿是活性天然產(chǎn)物的最大來(lái)源，如抗腫瘤、抗真菌、甚至抗HIV的活性天然產(chǎn)物，并且發(fā)現(xiàn)從海綿中獲得的活性化合物的幾率高于海洋中的其它動(dòng)植物，因此海綿藥物開(kāi)發(fā)成為近年來(lái)海洋藥輛開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。但是海綿體內(nèi)活性物質(zhì)含量極少，一般只有濕重的10—8，"藥源供給不足問(wèn)題"即無(wú)足夠的海綿量來(lái)進(jìn)行提取一定數(shù)量的活性物質(zhì)可供藥物深入的研究，使得一些藥物僅停留在臨床實(shí)驗(yàn)階段無(wú)法繼續(xù)下去，因而"藥源供給不足問(wèn)題"就成了海綿藥物開(kāi)發(fā)明顯滯后的限制性因素。多種方式被嘗試去解決這一問(wèn)題但都有難解決的關(guān)鍵技術(shù)，例如海綿細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，目前還沒(méi)有建立可以連續(xù)傳代的細(xì)胞系；化學(xué)合成價(jià)格昂貴、歩驟復(fù)雜、實(shí)際可行性太低；目前普遍認(rèn)為海綿工廠化人工養(yǎng)殖被認(rèn)為是可解決"藥源供給不足問(wèn)題"的較有希望的方式之一。國(guó)外有關(guān)海綿養(yǎng)殖方面的報(bào)道大都涉及深海的海綿，他們對(duì)于海綿外植體的養(yǎng)殖大多集屮在海水中的大田養(yǎng)殖，在水深5—10m的水體建造金屬網(wǎng)架、水泥盤(pán)或架設(shè)繩索，將海綿采集切塊后固定其上，但是由于受到不確定的風(fēng)暴等天氣的影響，海綿死亡、被風(fēng)暴帶走時(shí)常發(fā)生，致使大田養(yǎng)殖成功率較低，不確定性扣對(duì)較大。Stone1970年曾報(bào)道繁茂膜海綿野外自然生長(zhǎng)狀態(tài)下以其生長(zhǎng)而積作為指標(biāo)，5個(gè)月間增長(zhǎng)約2倍，平均每個(gè)月增長(zhǎng)約40%，此5個(gè)月也是一年中唯一的兒個(gè)海綿生物量上升的月份。工廠化養(yǎng)殖山于條件可控可以避免自然氣候變化對(duì)海綿生長(zhǎng)的影響的缺點(diǎn)。文獻(xiàn)也曾有報(bào)道在實(shí)驗(yàn)室水族缸養(yǎng)殖海綿的資料，但其目的是研究不同種類(lèi)和地域海綿的生長(zhǎng)規(guī)律，考察外界環(huán)境條件對(duì)海綿生長(zhǎng)影響，例如培養(yǎng)的溫度、鹽度、氨氮等。不同生長(zhǎng)環(huán)境和種類(lèi)的海綿，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求不同，體內(nèi)所含有的活性物質(zhì)的種類(lèi)不同，所以實(shí)驗(yàn)室條件下的海綿人工培養(yǎng)可以根據(jù)自然環(huán)境進(jìn)行調(diào)控。本發(fā)明是針對(duì)潮間帶海綿的養(yǎng)殖方法，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工可控條件下培養(yǎng)潮間帶海綿獲得生物量以供做其相關(guān)方面研究的科研工作者使用。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的是提供一套有效且操作簡(jiǎn)單，可對(duì)潮間帶海綿進(jìn)行室內(nèi)可控培養(yǎng)從而生產(chǎn)海綿生物量的方法。方法原理潮間帶海綿是營(yíng)固生長(zhǎng)無(wú)選擇性濾食的低等動(dòng)物，再生能力較強(qiáng)，在合適外界環(huán)境下，從海綿上切取一塊外植休貼附于其他載體上可繼續(xù)生長(zhǎng)。生長(zhǎng)在溫帶的繁茂膜海綿其生長(zhǎng)發(fā)育受到季節(jié)溫度的影響較大，呈現(xiàn)出春夏季節(jié)生長(zhǎng)旺盛、秋冬季節(jié)衰退的生長(zhǎng)規(guī)律，為海綿室內(nèi)控制培養(yǎng)調(diào)件提供了理論基礎(chǔ)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為一種用于潮間帶海綿實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖方法，實(shí)驗(yàn)室人工制造適宜生長(zhǎng)環(huán)境培養(yǎng)潮間帶固著生長(zhǎng)的低等動(dòng)物一海綿；以實(shí)驗(yàn)室人工模擬潮間帶固著生長(zhǎng)的海綿自然生長(zhǎng)環(huán)境來(lái)生產(chǎn)海綿生物量；具體步驟，將生長(zhǎng)在潮間帶礁石上的海綿采集后，立即放入盛海水的小桶里，帶回實(shí)驗(yàn)室清除海綿表面雜質(zhì)及臟物，然后將海綿切割成大小適宜的小塊，放入玻璃缸中暫養(yǎng)，然后固定在載體上，置于培養(yǎng)器內(nèi)，控溫、避光培養(yǎng)，投喂餌料藻類(lèi)作為主體食物，以海綿貼附狀況、形態(tài)變化及生物量變化情況作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，培養(yǎng)10-20天可達(dá)到原代海綿生長(zhǎng)的生物量最大值。本發(fā)明克服了海綿實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖生長(zhǎng)相對(duì)緩慢、周期長(zhǎng)的問(wèn)題。具體操作過(guò)程為1)海邊潮間帶礁石上采集海綿時(shí)，選擇顏色鮮艷，表面相對(duì)平坦，突起短而粗壯，表面干凈(雜質(zhì)臟物較少)海綿，采集后立即將海綿置于盛海水的小桶里；2)海綿帶回實(shí)驗(yàn)室后，用鑷子和注射針頭小心清理海綿體表雜質(zhì)臟物時(shí)，如果碰到海綿組織內(nèi)有較多泥沙石粒，則放棄選擇其他海綿，若組織內(nèi)石粒較少且相對(duì)較大，則用鑷子小心取出；.3)無(wú)菌手術(shù)刀切割海綿，適宜大小為面積約3-9cm2，放入玻璃缸中暫養(yǎng)2—7天，至其切割和采集時(shí)形成的傷口初步愈合，完成初步愈傷過(guò)程，暫養(yǎng)溫度與海邊采集時(shí)溫度相適應(yīng)，然后再逐漸調(diào)節(jié)到培養(yǎng)溫度；4)海綿用細(xì)線固定在載體上置于反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，載體大小約為海綿大小的4一8倍；5)控制海綿培養(yǎng)密度2-15^。(m/v),;K溫15-25r，溶氧濃度5-9mg/L;6)玻璃缸外面遮蓋一層牛皮紙或直接將反應(yīng)器放置在無(wú)陽(yáng)光直射的地方避免陽(yáng)光直射海綿；7)培養(yǎng)期內(nèi)，保持培養(yǎng)水體內(nèi)的NH4+濃度低于lmg/L;8)投喂?jié)舛葹?X104—2X105的單胞藻類(lèi)作為食物；靜培養(yǎng)每天換水，海綿以投喂餌料藻類(lèi)等為主體食物；流加培養(yǎng)方式是根據(jù)每日流水量計(jì)算培養(yǎng)器內(nèi)應(yīng)投喂的藻類(lèi)濃度；8)培養(yǎng)過(guò)程中，海綿貼附鋪展、形態(tài)變化用數(shù)碼相機(jī)拍照并記錄，生物量用濕重(濕海綿質(zhì)量)衡量，稱(chēng)量后換算成濕重增長(zhǎng)百分比，公式如下S-(Mn-Mo)/M^100n/。，MQ,Mt分別為海綿在培養(yǎng)第0天和第n天的濕重；9)視海綿采集季節(jié)狀態(tài)不同培養(yǎng)10-20天，即可達(dá)到原代海綿生長(zhǎng)的生物量最大值，冬春季節(jié)培養(yǎng)15—20天，夏秋季節(jié)培養(yǎng)10—15天。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.技術(shù)相對(duì)完整，首次對(duì)繁茂膜海綿給出一套完整方法用于實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖。2.簡(jiǎn)單易操作，海綿載體制作、固定方法、溫度控制、光照控制、溶解氧濃度控制等均非常簡(jiǎn)單，容易達(dá)到要求。3.應(yīng)用廣泛，此方法可用于短期內(nèi)生產(chǎn)繁茂膜海綿原代生物量；可以培養(yǎng)質(zhì)量?jī)?yōu)良海綿提供海綿研究國(guó)際難點(diǎn)一細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)良材料；可以進(jìn)行海綿組織塊傳代培養(yǎng)研究及目標(biāo)活性物質(zhì)調(diào)控的比較?？傊?，本發(fā)明可提供繁茂膜海綿在實(shí)驗(yàn)室可控條件下進(jìn)行有效的培養(yǎng)生產(chǎn)海綿原代生物量，技術(shù)相對(duì)較完整、操作簡(jiǎn)便，在室內(nèi)可控培養(yǎng)生產(chǎn)海綿生物量，為海綿工廠化養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐，從而為解決海綿生物藥物的"藥源供給不足問(wèn)題"提出一種新途徑，具有廣泛應(yīng)用前景。圖1為5L凈水培養(yǎng)體系圖；其中1海綿培養(yǎng)玻璃缸，2海綿貼附載體及橙色海綿，3通氣管，4氣石，5氣泵；6水域缸，7溫度控制機(jī)，8桌子，9水域水儲(chǔ)槽，10淺水泵，11水浴管；圖2為5L流水培養(yǎng)體系圖；其中12空氣，13臭氧發(fā)生器，14攪拌漿，15餌料藻液，16混料桶，17空氣濾膜，18海綿培養(yǎng)器，19廢液收集槽，20熱交換器，21海水，22海水處理槽，23除蛋白器；圖3為繁茂膜海綿培養(yǎng)過(guò)程中外觀生長(zhǎng)狀態(tài)圖；其屮a為培養(yǎng)初始海綿狀態(tài)；b為培養(yǎng)結(jié)束吋海綿狀態(tài)；圖4為繁茂膜海綿在靜水培養(yǎng)過(guò)程中生物量變化曲線圖5為繁茂膜海綿在流加培養(yǎng)過(guò)程中生物量變化曲線圖6為海綿提取物中5a-Cholestan-30-ol的GC-MS譜圖7為5a-Cholestan-3P-ol標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法與結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明使用購(gòu)買(mǎi)深海水作為養(yǎng)殖海水，用于海綿養(yǎng)殖和餌料藻類(lèi)的培養(yǎng)；濕重采用分析天平稱(chēng)取質(zhì)量，通過(guò)減重法得海綿生長(zhǎng)質(zhì)量，水銀溫度計(jì)測(cè)量培養(yǎng)水體內(nèi)實(shí)際水溫便于調(diào)節(jié)；便攜式溶氧儀測(cè)量水體內(nèi)溶解氧濃度便于調(diào)節(jié)氣泵供給的空氣流量，餌料藻的培養(yǎng)采用過(guò)濾滅菌海水錐形瓶培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)鹽采用藻類(lèi)培養(yǎng)通用的康維坊營(yíng)養(yǎng)鹽。5L靜水體系培養(yǎng)。潮間帶繁茂膜海綿(//，e"/^^o"pe/'/we)，2005年7月份采集于屮國(guó)大連凌水橋潮間帶，海綿表面雜質(zhì)及臟物較少，采集吋選取面積約2X2em2的小塊，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于盛海水的12L玻璃缸內(nèi)暫養(yǎng)2天，暫養(yǎng)溫度控制在20士rC左右。培養(yǎng)體系如圖l所示。培養(yǎng)起始，將海綿用線固定在4X4cm的毛玻璃載體上，共15塊放入盛有海水的5L玻璃缸內(nèi)，然后將玻璃缸置于溫度約為20士2'C的水域內(nèi)，氣泵和氣體分布器通入空氣，溶氧儀測(cè)水體內(nèi)溶氧，調(diào)節(jié)通入空氣流量的大小使水中的溶解氧氣濃度在7士0.5mg/L范圍內(nèi)，玻璃缸外面用牛皮紙遮住防止陽(yáng)光直接照射到海綿體上，每天換水100%，換水前先將儲(chǔ)備海水在水域內(nèi)調(diào)節(jié)到海綿培養(yǎng)相同的溫度，換水后投喂新月菱形藻和球等邊金藻作為食物，濃度各為？Xl()S/ml。培養(yǎng)期內(nèi)，每隔2天稱(chēng)量海綿與載體的濕重，培養(yǎng)到海綿濕重相對(duì)處于平臺(tái)期停止實(shí)驗(yàn)。以5a-Cholestan-3P-ol作為繁茂膜海綿體內(nèi)的目標(biāo)活性物質(zhì)，培養(yǎng)結(jié)束后，用GC-MS連用方法檢測(cè)海綿體內(nèi)在實(shí)驗(yàn)初始和結(jié)束吋目標(biāo)活性物質(zhì)的含量，海綿提取物中5a-Cholestan-3P-ol的GC-MS譜圖如圖6所示，根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)計(jì)算樣品中5a-Chdestan-3{3-ol含量。結(jié)果，培養(yǎng)過(guò)程中，海綿顏色變得比初始時(shí)更加鮮艷，海綿在載體上具有較大的貼附鋪展，形態(tài)發(fā)生了改變，從原來(lái)的平坦的表面變成了具有很多飽滿的長(zhǎng)突起(芽體)狀(如圖3所示)，此芽體內(nèi)原細(xì)胞含量較海綿其他部位豐富，是海綿細(xì)胞培養(yǎng)的良好材料，培養(yǎng)過(guò)程中水體內(nèi)的NH/濃度始終低于lmg/(如表1所示)，實(shí)驗(yàn)到第ll天結(jié)束，存活率達(dá)到100%，海綿生物量增長(zhǎng)到原始濕重的140%(如圖4所示)，平均每天增長(zhǎng)超過(guò)4%。海綿體內(nèi)的5a-Cholestan-3P-ol含量也由實(shí)驗(yàn)前的6.244mg/g干重海綿增長(zhǎng)到了10.478mg/g干重海綿(如表3)，約為實(shí)驗(yàn)初始時(shí)的1.5倍。表1為靜水培養(yǎng)下不同培養(yǎng)時(shí)間水體內(nèi)NH/濃度表；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2為流水培養(yǎng)下不同培養(yǎng)時(shí)間水體內(nèi)NH/濃度表;<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3為靜水培養(yǎng)下海綿體內(nèi)5a-Cholestan-3P-ol含量變化表；<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例25L流加體系培養(yǎng)。繁茂膜海綿(/^we"/"c/ob"pw/eve)于.2005年7月份采集于中國(guó)大連凌水橋潮間帶，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于盛海水的12L玻璃缸內(nèi)暫養(yǎng)2天，溫度控制在18-2(TC。培養(yǎng)體系如圖2所示。培養(yǎng)起始，將海綿用線固定在直徑約5cm的圓形毛玻璃載體上，共15塊放入盛有海水的5L液升培養(yǎng)器內(nèi)，水流量為20L/day，培養(yǎng)器外面包裹冷卻管控制培養(yǎng)水體溫度在2o士rc，氣泵和氣體分散器提供海綿所需氧氣，整個(gè)體系置于室內(nèi)無(wú)陽(yáng)光照射的地方，投喂新月菱形藻、球等邊金藻作為食物，濃度各為2X105/ml，培養(yǎng)過(guò)程中控制培養(yǎng)水體內(nèi)的NH/濃度不超過(guò)1mg/L。培養(yǎng)期內(nèi)，每隔2天測(cè)量海綿生物量，海綿外觀狀態(tài)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象吋停止實(shí)驗(yàn)。以5(x-Cholestan-3P-ol作為繁茂膜海綿體內(nèi)的目標(biāo)活性物質(zhì)，培養(yǎng)結(jié)束后川GC-MS連用的方法檢測(cè)海綿體內(nèi)在實(shí)驗(yàn)初始和結(jié)束吋目標(biāo)活性物質(zhì)的含量，結(jié)果，培養(yǎng)過(guò)程中，海綿顏色變得比初始吋更加鮮艷，海綿在載休上具有較大的貼附鋪展，形態(tài)發(fā)生了改變，從原來(lái)的平坦的表面變成了具有很多飽滿的長(zhǎng)突起狀，培養(yǎng)過(guò)程中水體內(nèi)的NH/濃度始終低于0.6mg/L(如表2所示)，實(shí)驗(yàn)到第16天結(jié)束，海綿存活率為87%。海綿生物量增長(zhǎng)到原始濕重的140%(如圖5所示)，平均每天的增長(zhǎng)量都超過(guò)了4%，海綿體內(nèi)的5a-Cholestan-3P-ol含量也由實(shí)驗(yàn)前的6.721mg/g干重海綿增長(zhǎng)到了10.733mg/g干重海綿(如表4)，約為實(shí)驗(yàn)初始吋的1.5倍。表4為流水培養(yǎng)下海綿體內(nèi)5a-Cholestan-3P-ol含量編化表;<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種用于潮間帶海綿實(shí)驗(yàn)室人工養(yǎng)殖方法，實(shí)驗(yàn)室人工制造適宜生長(zhǎng)環(huán)境培養(yǎng)潮間帶固著生長(zhǎng)的低等動(dòng)物-海綿；其特征在于將海綿在潮間帶采集后，帶回實(shí)驗(yàn)室后首先清除海綿表面雜質(zhì)及臟物，然后切割成小塊，放入培養(yǎng)器中暫養(yǎng)，然后固定在載體上，放入培養(yǎng)器控溫、避光培養(yǎng)，投喂餌料藻類(lèi)作為主體食物，以海綿貼附狀況、形態(tài)變化及生物量變化情況作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，培養(yǎng)10-20天可達(dá)到原代海綿生長(zhǎng)的生物量最大值。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于潮間帶礁石上采集海綿時(shí)，選擇顏色鮮艷，表面相對(duì)平坦、突起短而粗壯，表而千凈的海綿，采集后立即將海綿置于盛海水的小桶里備用。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用無(wú)菌手術(shù)刀切割海綿，適宜面積大小為約3-9cm2;載體大小為海綿面積的4-8倍；海綿載體可選擇玻璃或塑料材質(zhì)，海綿選擇細(xì)線固定。4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于海綿帶回實(shí)驗(yàn)室后要暫養(yǎng)2-7天，至其切割和采集時(shí)形成的傷口初步愈合，暫養(yǎng)溫度與海邊采集吋溫度相適應(yīng)，然后再逐漸調(diào)節(jié)到培養(yǎng)溫度，海綿培養(yǎng)溫度15-25°C。5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于海綿培養(yǎng)密度2-15%。(m/v)，培養(yǎng)水體溶氧濃度5-9mg/L，保持培養(yǎng)水體內(nèi)的NH/濃度低于lmg/L;投喂餌料藻類(lèi)食物時(shí)濃度2X104—2X105cells/ml;培養(yǎng)過(guò)程屮避免陽(yáng)光直射海綿。'全文摘要本發(fā)明涉及一種潮間帶海綿在實(shí)驗(yàn)室條件下人工養(yǎng)殖獲得生物量的方法，將海綿在潮間帶采集后，帶回實(shí)驗(yàn)室后首先清除海綿表面雜質(zhì)及臟物，然后切割成小塊，放入培養(yǎng)器中暫養(yǎng)，然后固定在載體上，放入培養(yǎng)器控溫、避光培養(yǎng)，投喂餌料藻類(lèi)作為主體食物，以海綿貼附狀況、形態(tài)變化及生物量變化情況作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，培養(yǎng)10-20天可達(dá)到原代海綿生長(zhǎng)的生物量最大值。本發(fā)明是首次在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)潮間帶海綿進(jìn)行人工養(yǎng)殖，方法簡(jiǎn)單而有效，可將海洋中野生的潮間帶海綿在實(shí)驗(yàn)室的規(guī)模下養(yǎng)殖生長(zhǎng)并獲得一定的海綿生物量。本發(fā)明的潮間帶海綿的室內(nèi)養(yǎng)殖方法為海綿工廠化養(yǎng)殖提供技術(shù)支撐，從而為解決海綿生物藥物的“藥源供給不足問(wèn)題”提出一種新途徑，具有廣泛應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N5/06GK101099452SQ20061004712公開(kāi)日2008年1月9日申請(qǐng)日期2006年7月5日優(yōu)先權(quán)日2006年7月5日發(fā)明者付晚濤,衛(wèi)張,張喜昌,曹旭鵬,薛凌云,艷靳申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所