專利名稱：一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
洋蔥屬于百合科(Liliaceae)蔥屬，是世界范圍內(nèi)普遍栽培的重要蔬菜之一，它 以肉質(zhì)鱗片和鱗芽構(gòu)成產(chǎn)品器官，營(yíng)養(yǎng)含量豐富，是重要的營(yíng)養(yǎng)保健型蔬菜。近年來，我國(guó) 洋蔥栽培面積迅速擴(kuò)大，洋蔥及其加工制品已出口至歐美、日本及東南亞許多國(guó)家。但是目 前我國(guó)洋蔥生產(chǎn)上使用的品種大多為國(guó)外品種，國(guó)內(nèi)洋蔥品種較少，造成這一情況的原因 是洋蔥為二年生草本植物，花器結(jié)構(gòu)小，自交后易發(fā)生退化，育種上存在育種周期長(zhǎng)，育種 率低等問題。然而利用組織培養(yǎng)技術(shù)，可以提高育種效率。洋蔥組織培養(yǎng)所用起始材料種類很多，莖尖、鱗莖盤、葉片、鱗片、花器官等取材。 Fridberg曾用附加NAA和KT的MS培養(yǎng)基從洋蔥鱗片直接誘異成芽。姜璐琰等(2003)用 洋蔥花蕾作為外植體，經(jīng)過愈傷組織及體細(xì)胞胚途徑，獲得了較高頻率的再生植株，其愈傷 最高誘導(dǎo)率為68. 71%。自1983年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物問世以來，植物基因工程技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)。煙 草、番茄、辣椒等作物轉(zhuǎn)基因方面已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，一些轉(zhuǎn)基因作物已在生產(chǎn)上應(yīng)用。 洋蔥轉(zhuǎn)基因體系已有報(bào)道，Eady等(1998)以未成熟胚為外植體，建立了高頻的再生體系， 最高誘導(dǎo)頻率為60%，并建立了以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo)，以gfp和npt II為標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化 體系，獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。但目前仍未見實(shí)際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，本 發(fā)明的另一目的是提供該方法專用培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，包括選取洋蔥外植體，采用添加2，4-D、6_BA的B5培 養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)；所述的B5培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，pH 值為5. 8，添加的2,4-D濃度為0. 5 2. 0mg/L，6_BA濃度為1. 0 4. Omg/L。其中，所述的外植體選自洋蔥幼嫩花序或者洋蔥總苞被未開裂的花序中的幼蕾。所述的外植體優(yōu)選洋蔥直徑約0. 8-1. 2cm的幼嫩花序。所述的外植體優(yōu)選洋蔥總苞被未開裂的直徑為1. 5-2. Ocm的花序中的幼蕾。選擇所述的洋蔥總苞被未開裂的直徑為1. 5-2. Ocm的花序中的幼蕾作為外植體 時(shí)，培養(yǎng)基的組成為所述的B5培養(yǎng)基+1. Omg/L 2,4-D+l. Omg/L 6-BA。該誘導(dǎo)方法還包括培養(yǎng)前處理先將花序消毒滅菌，然后撕去總苞被，分別取外植 體，消毒滅菌。所述的消毒滅菌方法為首先用自來水沖洗0.5h，流水沖洗，再用70%的酒精消毒
3lmin，然后用0. 的升汞消毒lOmin，最后用無菌水漂洗3 5次。所述的培養(yǎng)條件為溫度為25 士 1 °C，光照時(shí)間為16h. cf1，光照強(qiáng)度為 50 μ mol · πΓ2 · s-1。以蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，pH值為5. 8的B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加 0. 5 2. Omg/L 2，4-D，1. O 4. Omg/L 6-BA。所述的培養(yǎng)基組成為以蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，pH值為5. 8的B5培 養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1. Omg/L 2，4-D及1. Omg/L 6-BA。有益效果本發(fā)明利用不同生長(zhǎng)時(shí)期的洋蔥花蕾為外植體，對(duì)影響愈傷組織發(fā)生的因素進(jìn)行 研究，從而建立了一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，利用該方法誘導(dǎo)洋蔥愈傷組織，外植體的愈 傷誘導(dǎo)率最高可達(dá)為100%。本發(fā)明通過外植體的選擇、培養(yǎng)基的優(yōu)化，提供了一種專用 于洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)的外植體和培養(yǎng)基，該組合能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。本發(fā)明誘 導(dǎo)方法提高了洋蔥幼蕾愈傷組織的誘導(dǎo)率，為外源基因的轉(zhuǎn)化和多倍體離體誘導(dǎo)奠定了基 石出。本發(fā)明所選取的外植體具有消毒滅菌方法簡(jiǎn)單方便，接種后污染率低；愈傷組織 誘導(dǎo)率高的優(yōu)點(diǎn)。


圖1、外植體A培養(yǎng)8周后愈傷組織誘導(dǎo)圖片。圖2、外植體B、C接種時(shí)幼蕾圖片。圖3、外植體B培養(yǎng)8周時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)圖片，右上角為放大圖。圖4、外植體C培養(yǎng)8周時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)圖片，右上角為放大圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11. 1無菌材料的獲得實(shí)驗(yàn)所用洋蔥材料取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，品種為“9866”。采用直 徑約0. 8-1. 2cm的幼嫩花序，撕去總苞被后，連同花序軸將其分切成6-8個(gè)小塊為外植體， 編號(hào)A ；采用直徑約1. 5-2. Ocm的總苞被未開裂的花序，取其留有短柄(0. 1-0. 3cm)的幼蕾 為外植體，編號(hào)B ；采用總苞被已開裂的直徑約3. Ocm的花序，取其留有短柄(0. 1-0. 3cm) 的幼蕾為外植體，編號(hào)C。先將花序消毒滅菌，然后撕去總苞被，分別取外植體A和B。取留有短柄的幼蕾， 消毒滅菌得到外植體C。消毒滅菌首先用自來水沖洗0.5h，漂去雜質(zhì)，用70%的酒精消毒 lmin，然后用0. 的升汞消毒lOmin，再用無菌水漂洗3 5遍。將獲得的無菌材料外植 體A、B、C接種到培養(yǎng)基上。1. 2培養(yǎng)基B5為基本培養(yǎng)基，其中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，pH值為5. 8。2，4_D 所設(shè)濃度梯度為0. 5,1. 0,2. Omg/L，6-BA所設(shè)濃度梯度為1. 0,2. 0,4. Omg/L，采用正交試驗(yàn) 設(shè)計(jì)。將外植體A、B、C分別接種到9cm的玻璃培養(yǎng)皿(或玻璃瓶)中，每個(gè)皿接種外植體A4個(gè)，外植體B和C各20個(gè)，外植體B、C接種時(shí)幼蕾圖片見圖2，每處理3個(gè)培養(yǎng)皿，3次 重復(fù)。接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每隔4周繼代培養(yǎng)一次。
表1愈傷組織誘導(dǎo)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)
處理2,4-D6-BA(mg/L)(mg/L)10.51.020.52.030.54.041.01.051.02.061.04.072.01.082.02.092.04.01. 3培養(yǎng)條件將接種后的培養(yǎng)皿或玻璃瓶置于溫度為25士 1°C，光照時(shí)間為16h. cf1，光照強(qiáng)度 為50 μ mol · m_2 · s—1的條件下培養(yǎng)。1. 4三種外植體培養(yǎng)8周以后，分別統(tǒng)計(jì)接種后生成的愈傷數(shù)量，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)分析。1. 4. 1不同外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況外植體A愈傷組織誘導(dǎo)的過程和外植體B和C有著明顯的不同。外植體A接種后， 首先花序軸基部和幼蕾長(zhǎng)大，在生長(zhǎng)4周以后，幼蕾花柄膨大，花序軸和幼蕾上分別有微黃 色或白色的愈傷組織出現(xiàn)。外植體B和C的幼蕾在接種后生緩慢長(zhǎng)，部分花蕾開放，在生長(zhǎng) 四周后有微黃色的愈傷出現(xiàn)(見圖1、3、4)。1. 4. 2不同外植體對(duì)洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的外植體因其生理狀態(tài)的不同，在提供相同的激素濃度配比 的情況下，其愈傷組織誘導(dǎo)的情況存在很大的差異。外植體A的每一個(gè)外植體都有愈傷組 織的出現(xiàn)，外植體的愈傷誘導(dǎo)率為100%，每個(gè)外植體上的愈傷組織的數(shù)量不同(圖1)。外 植體B和C的愈傷組織的誘導(dǎo)見表2和表3。由表2，3知，外植體B (總苞被未開裂的花序中 的幼蕾)形成愈傷組織的平均誘導(dǎo)率為85. 49%，外植體C(總苞被開裂的花序中的幼蕾) 的平均誘導(dǎo)率為55. 78%。在相同的培養(yǎng)條件下，外植體B的處理的愈傷誘導(dǎo)率均高于外植 體C的處理。說明外植體A即幼嫩花序和外植體B即總苞被未開裂的花序所取的洋蔥幼蕾 材料應(yīng)為最佳的愈傷組織的誘導(dǎo)材料。表2外植體B的愈傷誘導(dǎo)情況
權(quán)利要求
一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于包括選取洋蔥外植體，采用添加2，4 D、6 BA的B5培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)；所述的B5培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8，添加的2，4 D濃度為0.5～2.0mg/L，6 BA濃度為1.0～4.0mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的外植體選自洋蔥 幼嫩花序或者洋蔥總苞被未開裂的花序中的幼蕾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的外植體選擇洋蔥 直徑0. 8-1. 2cm的幼嫩花序。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的外植體選擇洋蔥 總苞被未開裂的直徑為1. 5-2. Ocm的花序中的幼蕾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于選擇所述的洋蔥總苞被 未開裂的直徑為1. 5-2. Ocm的花序中的幼蕾作為外植體時(shí)，培養(yǎng)基的組成為所述的B5培 養(yǎng)基 +1. Omg/L 2,4-D+l. Omg/L 6-BA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于該誘導(dǎo)方 法還包括培養(yǎng)前處理先將花序消毒滅菌，然后撕去總苞被，分別取外植體，消毒滅菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的消毒滅菌方法為 首先用自來水沖洗0. 5h，流水沖洗，再用70 %的酒精消毒lmin，然后用0. 1 %的升汞消毒 lOmin，最后用無菌水漂洗3 5次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的培 養(yǎng)條件為溫度為25士 1°C，光照時(shí)間為16h/d，光照強(qiáng)度為50μπιΟ1 · πΓ2 · Γ1。
9.一種誘導(dǎo)洋蔥愈傷組織用培養(yǎng)基，其特征在于該培養(yǎng)基組成為以蔗糖濃度為30g/ L,瓊脂濃度為8g/L，pH值為5. 8的B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0. 5 2. 0mg/L 2,4-D, 1· 0 4. 0mg/L6-BA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)洋蔥愈傷組織用培養(yǎng)基，其特征在于所述的培養(yǎng)基組 成為以蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，pH值為5. 8的B5培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 1. 0mg/L2，4-D 及 1. 0mg/L 6-BA。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，公開了一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法及其專用培養(yǎng)基。一種洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)方法，包括選取洋蔥外植體，采用添加2，4-D、6-BA的B5培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)；所述的B5培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30g/L，瓊脂濃度為8g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8，添加的2，4-D濃度為0.5～2.0mg/L，6-BA濃度為1.0～4.0mg/L。本發(fā)明所選取的外植體具有消毒滅菌方法簡(jiǎn)單方便，接種后污染率低；愈傷組織誘導(dǎo)率高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101960991SQ20101054535
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者侯喜林, 劉照坤, 王建軍 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)