專利名稱：淡水蘆葦非愈傷組織培養(yǎng)方法
淡水蘆葦非愈傷組織培養(yǎng)方法
一、 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
蘆葦(P/ ragw"ey"MWmfe)自然種群多發(fā)生在淺水性濕地，常見(jiàn)于池沼、河流沿岸、灘 涂、河溪邊多水地區(qū)。蘆葦作為經(jīng)濟(jì)作物，葦稈可用于造紙和人造絲、編制蘆席、草墊；生 長(zhǎng)期的蘆葦含大量的蛋白質(zhì)和糖分，為優(yōu)良飼料；蘆葦?shù)娜~、花、莖、根、筍均可入藥。同 時(shí)，蘆葦具有重要的生態(tài)功能，保土固堤，消浪緩流，促淤防蝕等；近年來(lái)，蘆葦耐污、去 污，改善富營(yíng)養(yǎng)化水質(zhì)的能力備受重視，在湖濱帶、河流坡岸與沼澤濕地恢復(fù)與重建中，蘆 葦成為了必選植物，被大面積種植。隨著我國(guó)生態(tài)環(huán)境建設(shè)、水環(huán)境綜合治理和濕地恢復(fù)工 程的大量實(shí)施，蘆葦?shù)姆N苗與種源需求會(huì)愈來(lái)愈緊迫，而當(dāng)前的技術(shù)將難以滿足日益高漲的 市場(chǎng)需要；因此，發(fā)明一種能夠快速提供優(yōu)質(zhì)蘆葦種苗的方法是必然的需要。
經(jīng)中國(guó)專利網(wǎng)與相關(guān)論文網(wǎng)站檢索，發(fā)現(xiàn)目前已有一些關(guān)于盧葦組織培養(yǎng)的報(bào)道，如吳 國(guó)良等在《蘆葦胚性愈傷組織的形成及植株的再生》中用種子通過(guò)愈傷培養(yǎng)獲得完整植株， 但愈傷的周期較長(zhǎng)，過(guò)程較復(fù)雜；王希友在《戸蘋胚性愈傷組織生長(zhǎng)的研究》中只研究了愈 傷組織的生長(zhǎng)，并未長(zhǎng)出完整植株；郭睿在《耐鹽蘆葦莖節(jié)組織體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生的 研究》中也是通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)來(lái)獲得植株，同樣存在周期較長(zhǎng)的問(wèn)題；另外，在楊印根等 的專利《耐鹽蘆葦?shù)臒o(wú)性繁殖方法》中，也描述了通過(guò)愈傷組織培養(yǎng)獲得完整植株的過(guò)程， 同樣存在周期較長(zhǎng)的問(wèn)題。
三
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是發(fā)明一種快速離體繁殖蘆葦?shù)姆椒?，使得短期?nèi)可以獲得大 量?jī)?yōu)質(zhì)同規(guī)格蘆葦苗，滿足濕地恢復(fù)與重建工程中的需要，促進(jìn)環(huán)境的恢復(fù)。 本發(fā)明的技術(shù)方案是
(1) 野外選種，選擇駱馬湖長(zhǎng)勢(shì)高大的蘆葦；
(2) 消毒，將從野外取回的蘆葦莖剪成小段，每段2-3 cm長(zhǎng)，在蒸餾水下洗凈，然后 在超凈臺(tái)上用70%乙醇浸泡30 s，用蒸餾水涮洗2-3次，其后用0.1 %HgCl2水溶液消毒5 min， 再用無(wú)菌蒸餾水洗滌4-5次；
3(3) 將消毒后的蘆葦?shù)膸а吭那o段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 添加了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 6-芐基腺嘌呤(BA)和萘乙酸(NAA);溫度為25土2。C、 光強(qiáng)為20001x、每日光照14h;培養(yǎng)7-23d，多數(shù)莖段的芽在兩周左右可長(zhǎng)到3 cm;
(4) 將產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基中添加了PVP、 BA 和NAA;溫度為25土2。C、光強(qiáng)為20001x、每日光照14 h條件下培養(yǎng)11-24 d;
(5) 當(dāng)芽長(zhǎng)到4-5 cm時(shí)移到生根培養(yǎng)基上誘根，誘根培養(yǎng)基中添加了 PVP、 IBA和NAA; 溫度為25 土 2'C 、光強(qiáng)為2000 lx、每日光照14 h;
(6) 當(dāng)試管苗根長(zhǎng)至約2 cm時(shí)，打開(kāi)瓶口并加少量蒸餾水煉苗2-3 d，然后將根部瓊脂 洗凈，移入珍珠巖中過(guò)渡，3-5d后移入土壤。
各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方(激素配比)如下表
各階段的培養(yǎng)基配方
組培階段培養(yǎng)基組成成分
不定芽誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.43%瓊脂+ BA 6 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 50 mg/L
不定芽繼代MS培養(yǎng)基+30/。蔗糖+0.43%瓊脂+ BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 50 mg/L
植株生根1/2MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.43%瓊脂+ IB A 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+PVP 50 mg/L
注由亍培養(yǎng)基滅菌后pH會(huì)略有下降，所以培養(yǎng)基的pH配制時(shí)調(diào)至6.1;所有培養(yǎng)基在高壓滅 菌鍋中12rC滅菌20 min，滅菌后的培養(yǎng)基放在超凈臺(tái)上1 d后再用，以晾干水膜。
本發(fā)明建立了一個(gè)快速離體繁殖蘆葦?shù)耐暾w系，與現(xiàn)有技術(shù)相比其有益效果是(1) 通過(guò)非愈傷組織培養(yǎng)方法來(lái)獲得完整蘆葦組培苗，其過(guò)程簡(jiǎn)單、周期短，通過(guò)外植體長(zhǎng)出 完整試管苗只需約35-65 d; (2)誘導(dǎo)率高達(dá)92.3%，生根率也高達(dá)95.8%; (3)移栽成活 率高，為90.2%; (4)通過(guò)添加50 mg/L PVP消除了褐化現(xiàn)象，阻止了褐化對(duì)培養(yǎng)過(guò)程的 影響；(5)本發(fā)明中所用材料取于駱馬湖，植株高大，平均約6 m，可廣泛用于河道濱岸 與湖濱帶恢復(fù)。
具體實(shí)施例方式
1.外植體消毒
將從野外取回的戸葦莖剪成小段，每段2-3cm長(zhǎng)，在蒸餾水下洗凈，然后在超凈臺(tái)上用 70%乙醇浸泡30 s，用蒸餾水涮洗2-3次，其后用0.1 %HgCl2水溶液消毒5 min，再用無(wú)菌蒸 餾水洗滌4-5次；2. 不定芽的誘導(dǎo)
在超凈臺(tái)上，將消毒后的莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，即MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.43%瓊脂 +BA6 mg/L+NAAO.2 mg/L+PVP 50 mg/L，在溫度為25 土 2°C 、光強(qiáng)為2000 lx、每日光照14 h 的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)7-23 d，多數(shù)莖段的芽在兩周左右可長(zhǎng)到3 cm; BA為6 mg/1時(shí)最好， 誘導(dǎo)率高達(dá)92.3%。
3. 繼代培養(yǎng)
將誘導(dǎo)出的芽轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，即MS培養(yǎng)基+3。/。蔗糖+0.43。/。瓊脂+BA5 mg/L+NAAO.2 mg/L+PVP 50 mg/L，在溫度為25 土 2°C 、光強(qiáng)為2000 lx、每日光照14 h的條 件下培養(yǎng)11-24 d。
4. 生根培養(yǎng)
將叢狀不定芽分離成單個(gè)芽，移到生根培養(yǎng)基上，即1/2MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.43%瓊脂 +IBA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L+PVP50 mg/L，溫度為25 土 2°C 、光強(qiáng)為2000 lx、每日光照14 h 的條件下，培養(yǎng)出完整的再生植株，試管苗生根率達(dá)95.8%。
5. 移栽
當(dāng)試管苗根長(zhǎng)至2 cm左右時(shí)，打開(kāi)瓶口并加少量蒸餾水煉苗2-3 d，然后將根部瓊脂洗 凈，移入珍珠巖中過(guò)渡，3-5d后移入土壤，存活率達(dá)90.2%。
權(quán)利要求
1、一種淡水蘆葦非愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于用生長(zhǎng)高大的蘆葦?shù)那o段進(jìn)行非愈傷組織培養(yǎng)，快速繁殖出完整蘆葦苗，由以下步驟構(gòu)成(1)將采自野外的蘆葦莖段剪成小段，每段2-3cm長(zhǎng)，在蒸餾水下洗凈，然后在超凈臺(tái)上用70％乙醇浸泡30s，用蒸餾水涮洗2-3次后用0.1％HgCl2水溶液消毒5min，再用無(wú)菌蒸餾水洗滌4-5次；(2)將消毒后的蘆葦莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.43％瓊脂+BA6mg/L+NAA0.2mg/L+PVP 50mg/L；溫度為25土2℃、光強(qiáng)為2000lx、每日光照14h；(3)將產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.43％瓊脂+BA5mg/L+NAA0.2mg/L+PVP 50mg/L；溫度為25土2℃、光強(qiáng)為2000lx、每日光照14h；(4)在生根培養(yǎng)基上誘根，產(chǎn)生完整組培苗；生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+3％蔗糖+0.43％瓊脂+IBA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+PVP50mg/L；溫度為25土2℃、光強(qiáng)為2000lx、每日光照14h；(5)當(dāng)試管苗根長(zhǎng)約2cm時(shí)，打開(kāi)瓶口并加少量蒸餾水煉苗2-3d，然后將根部瓊脂洗凈，移入珍珠巖中過(guò)渡，3-5d后移入土壤。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述淡水蘆葦非愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于所有培養(yǎng)基的pH配制時(shí) 調(diào)至6.1;所有培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中12rC滅菌20 min，滅菌后的培養(yǎng)基放在超凈臺(tái)上1 d 后再用，以晾干水膜。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。運(yùn)用蘆葦?shù)那o段，建立一種通過(guò)非愈傷組織培養(yǎng)的快速離體繁殖方法，獲得完整優(yōu)質(zhì)蘆葦植株。其過(guò)程簡(jiǎn)單、繁殖周期短，并且誘導(dǎo)率高達(dá)92.3％，移栽成活率也很高，達(dá)90.2％。通過(guò)此方法能夠快速提供優(yōu)質(zhì)蘆葦種苗，滿足日益高漲的市場(chǎng)需要，發(fā)揮其在生態(tài)環(huán)境建設(shè)、水環(huán)境綜合治理和濕地恢復(fù)工程方面的作用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101491213SQ20091002566
公開(kāi)日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者孫一香, 孫利芳, 安樹(shù)青, 瑤 莊, 華 清, 陸霞梅 申請(qǐng)人:南京大學(xué)