專利名稱：農桿菌介導的玉米成熟種子胚的轉基因方法
技術領域：
本發(fā)明涉及玉米基因轉化工程領域，具體是一種農桿菌介導的玉米成熟種子胚的轉基因方法。
背景技術：
玉米是主要的糧食作物之一，與水稻、小麥、高粱等作物相比，玉米(Zea mays L.) 栽培歷史短，但生產發(fā)展速度最快，全世界對玉米的需求量也在與日俱增。為了滿足需求， 改良某些性狀，實現(xiàn)增產，轉基因技術是解決常規(guī)育種遺傳資源不足、選育速度慢的有效手段。玉米轉基因技術近年來得到了很大的發(fā)展，已建立了農桿菌介導法、基因槍法、 PEG法、電擊法、碳化硅纖維介導法和花粉管導入法等一系列轉化技術見表1，這些方法各有其優(yōu)缺點。基因槍法設備昂貴，PEG法、電擊法、超聲波法的受體獲得困難，花粉管導入法必須在花期特定時間進行，轉化率低并且后期篩選工作量大。相對而言，農桿菌介導法以其效率較高而成為目前應用最為廣泛的植物轉基因技術，但是該方法一般采取的是外植體 —愈傷組織一農桿菌介導的轉化一叢生芽一篩選一生根一轉化株的技術操作流程，主要的困難和問題是愈傷組織形成時間往往長達數(shù)星期甚至數(shù)月，十分耗時，工作量繁重；玉米胚性愈傷組織的誘導分化較水稻等作物困難，叢生芽的分化率十分不穩(wěn)定；分化植株的生根難；由于轉基因受體植物的基因型的差異，不能夠適用多樣性品種或品系，也就是適合同種的不同品種/品系的，表現(xiàn)出較為明顯的玉米基因型轉化特異性。玉米中不管是葉還是根等成熟組織都很難再生成株。張榮等Q001)利用幼胚為直接受體通過農桿菌介導法成功獲得轉化株，此法雖然避免了繁雜的組培過程，但幼胚的獲得受季節(jié)的嚴格限制。因此，在玉米轉基因研究中，有必要繼續(xù)開發(fā)快速、高效的轉化方法。表1已報道的玉米轉基因方法
權利要求
1.一種農桿菌介導的玉米成熟種子胚的基因轉化方法，其特征在于，包括如下步驟(1)構建植物基因表達的質粒載體；(2)構建含有步驟(1)中植物基因表達的質粒載體的根癌農桿菌菌株；(3)玉米成熟種子的裸露的胚的制備和創(chuàng)傷；(4)步驟O)中的農桿菌介導的裸露并且經創(chuàng)傷的玉米成熟種子胚的基因轉化；(5)再生苗的除草劑抗性復篩；(6)除草劑篩選處理后存活的苗移栽；(7)玉米轉基因植株的聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定。
2.權利要求1的玉米成熟種子的裸露的胚的制備和胚的創(chuàng)傷的應用，其特征在于，具體步驟為將成熟的玉米種子在無菌雙蒸水中浸泡過夜16 20h，將浸泡過夜的玉米種子在無菌操作臺上用刀片輕輕劃開玉米種皮，再用滅菌縫衣針剝去胚乳，留取胚，將胚再用 0. 1 %的氯化汞滅菌處理8min，雙蒸水清洗四遍，最后用滅菌的縫衣針輕輕扎刺胚，對胚進行創(chuàng)傷。
3.權利要求1的農桿菌介導的裸露并且經創(chuàng)傷的米成熟種子胚的基因轉化，其特征在于，具體步驟為將200粒裸露并且創(chuàng)傷的玉米成熟種子的胚轉入含100 μ M的乙酰丁香酮的0D_為0. 5的農桿菌轉化菌液中，再加20ml的MS液體培養(yǎng)基和6 μ 1的50mg/ml的乙酰丁香酮；在^°C，IOOrpm的搖床上培養(yǎng)18_20h ；接著將創(chuàng)傷的玉米成熟種子的胚轉移到含MS、30g/L蔗糖、100 μ M乙酰丁香酮、7g/L瓊脂、pH6. 0的共培養(yǎng)基上，在黑暗共培養(yǎng) 3天，共培養(yǎng)后，先用雙蒸水將胚沖洗一次，再用含抗生素Cef的雙蒸水洗一次，接著再用雙蒸水洗一次，最后將其轉至含MS、0. lmg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、 30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，pH6.0的抑菌及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周，然后先打開瓶蓋，讓抗性苗下，IMi光照培養(yǎng)3天后轉至經滅菌的土，在，IMi光照培養(yǎng)獲得除草劑Basta抗性玉米苗，所有涉及的實施過程均在無菌條件下進行。
全文摘要
一種農桿菌介導的玉米成熟種子胚的基因轉化方法，包括如下步驟(1)構建植物基因表達的質粒載體；(2)構建含有步驟(1)中植物基因表達的質粒載體的根癌農桿菌菌株；(3)玉米成熟種子的裸露的胚的制備和創(chuàng)傷；(4)步驟(2)中的農桿菌介導的裸露并且經創(chuàng)傷的玉米成熟種子胚的基因轉化；(5)再生苗的除草劑抗性復篩；(6)除草劑篩選處理后存活的苗移栽；(7)玉米轉基因植株的聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定。本發(fā)明避免了玉米愈傷組織組織分化和植株再生周期長和再生根難的問題；有效避開了已報道的玉米幼胚為受體的轉基因操作的季節(jié)的限制、縮短了轉化操作時間。
文檔編號A01H5/00GK102433356SQ20111039928
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權日2012年1月5日
發(fā)明者李有志, 樊憲偉, 潘虹 申請人:廣西大學