專利名稱：一株短小芽孢桿菌及其在枯萎病防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株短小芽孢桿菌及其在枯萎病防治中的應(yīng)用，特別涉及短小芽孢桿菌抗枯1號及其在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物枯萎病是一種世界性的真菌土傳病害，病原菌從根部危害作物，引起維管束病害，造成植株枯死，在植株的整個生長期均可發(fā)病。植物枯萎病會嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量，以瓜類枯萎病為例，病田一般減產(chǎn)20% 30%，嚴(yán)重的情況下可減產(chǎn)50% 60%，甚至絕產(chǎn)。香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)是破壞香蕉維管束導(dǎo)致植株死亡的毀滅性病害。其病菌腐生能力很強(qiáng)，在土壤中可長期存活。香蕉枯萎病是典型的土傳病害，侵染來源主要是帶菌的吸芽、病株殘?bào)w及帶菌土壤。香蕉枯萎病1996年在廣州市開始發(fā)生。近幾年來，該病擴(kuò)散蔓延速度快，發(fā)病程度逐年加重。2000年全市香蕉發(fā)病面積97. 33 hm2，主要發(fā)生在番禹區(qū)萬頃沙鎮(zhèn)；2001年發(fā)病面積377. 33hm2 ；2002年發(fā)病面積1266. 67hm2 ；2003年全市香蕉種植面積11666. 67hm2， 發(fā)病面積3855. 93hm2。廣州市春植蕉香蕉枯萎病在6—7月開始發(fā)病，8—9月病害逐步加重，10—11月為發(fā)病高峰期；秋植蕉發(fā)病高峰期在翌年6月份，植株發(fā)病后死亡率高。香蕉外觀發(fā)病癥狀往往表現(xiàn)在抽蕾期至掛果期，因而容易造成失收，經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。發(fā)病重的蕉田第一年發(fā)病率為10%，第二年發(fā)病率為20% — 30%，第三年發(fā)病率達(dá)70%以上，遭此危害的蕉田基本上不能繼續(xù)種植香蕉。目前，主要通過選育抗菌新品種、輪作及最廣泛的化學(xué)藥劑防治。選育抗病新品種需要的時(shí)間長，得到的抗病品種不一定優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)，種植的經(jīng)濟(jì)效益低下。輪作同樣受到經(jīng)濟(jì)、土地等因素的影響，難以實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)藥劑防治會造成農(nóng)藥殘留，且防治效果不佳。生物防治枯萎病具有環(huán)境友好，防治效果好等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的歡迎。如木霉對多種病菌具有很好的抑制作用；叢枝菌根真菌(AM)可與植株根系建立互惠共生體，選擇性抑制部分病原微生物，減少枯萎病的發(fā)生率，促進(jìn)植株生產(chǎn)、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)，提高植株的抗逆性。此外，還有非致病尖孢鐮刀菌，可以誘導(dǎo)植株產(chǎn)生針對枯萎病原菌的抗性，可以減輕枯萎病的影響。但是非致病尖孢鐮刀菌使用不當(dāng)，則會引起更為嚴(yán)重的枯萎病，后果嚴(yán)重。芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。許多性狀優(yōu)良的天然分離株已成功應(yīng)用于植物病害的生物防治。枯草芽孢桿菌通過成功定殖至植物根際、體表或體內(nèi)，與病原菌競爭植物周圍的營養(yǎng)，分泌抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達(dá)到生防的目的。其主要防治對象為絲狀真菌所引起的植物病害，如水稻紋枯病(Stagonospora curtisii) 、小麥紋才古病(Rhizoctonia cerealis)、番口十霄病(Cladosporium fulvum)、豆類牛艮腐病(Fusariurngrami ner ar um) ( Rhizoctoni a spp .)、蘋果霄心病(Alternaria alternata)、豐帛花立才古病(Rhizoctonia solani )、豐帛花才古妻病(Fusariumoxysporumf sp . vasinfectum)等，其可以產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，所以是理想的生防菌篩選對象?，F(xiàn)階段，大量使用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。如江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳志誼等經(jīng)過多年生物防治水稻病害的研究獲得了防治水稻紋枯病的效果達(dá)50 .0% 81 .0 %的枯草芽孢桿菌B-916菌株，現(xiàn)已在江蘇等地得到廣泛推廣。黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所研發(fā)的枯草芽孢桿菌水劑主要防治瓜類及保護(hù)地蔬菜枯萎病、立枯病和豆類根腐病，已在黑龍江等地進(jìn)行推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株短小芽孢桿菌。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述短小牙孢桿菌在生物防治枯萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明的短小芽孢桿菌(feciBm pumiIus^抗枯1號，于2011年7月8日送至位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心并登記入冊，保藏號為CCTCC NO :M2011M3，培養(yǎng)物的活性由保藏中心于2011年7月14日檢測完畢，結(jié)果為存活。本發(fā)明的菌株，易于培養(yǎng)，使用方便，對香蕉枯萎病有很好的防治作用。


圖1是本發(fā)明菌株對香蕉枯萎病的抑制作用效果圖。
具體實(shí)施例方式、菌株的篩選
該菌株分離來源于韭菜葉，在室內(nèi)無菌條件下用75%酒精對新鮮韭菜葉進(jìn)行表面消毒，后用鑷子撕下一小塊韭菜葉，再將韭菜葉放置于NA培養(yǎng)基(其成分如下蛋白胨10g/L、 肉膏粉3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15g/L、pH7. 3士0. 2)上，放置時(shí)韭菜的葉肉組織貼于培養(yǎng)基，表面朝上。后將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，2天后再進(jìn)行培養(yǎng)物純化，經(jīng)過2-3次純化后得到純的單菌株培養(yǎng)物?？箍?號的形態(tài)特征
1、菌落奶酪色，表面干燥不透明，有圓心環(huán)紋，邊緣不整齊；
2、液體培養(yǎng)基中呈沉淀性混濁；
3、菌體單個或成對排列；
4、芽孢中性，橢圓形?？箍?號的生理生化特征
1、革蘭氏陽性；
2、接觸酶實(shí)驗(yàn)呈陽(+)性；
3、氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陰(一)性；
4、厭氧生長試驗(yàn)呈陽(+)性；
5、V-P測定呈陰(一)性;6、硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陰(一)性；
7、淀粉水解實(shí)驗(yàn)呈陰(一)性；
8、明膠液化試驗(yàn)呈陰(一)性；
9、糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)D-葡萄糖和L-阿拉伯糖呈陽(+)性，D-甘露醇、D-木糖和葡萄糖產(chǎn)氣呈陰性；
10、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)呈陰(一)性；
11、耐鹽性試驗(yàn)2%和5%NaCl呈陽(+)性，7%和10%NaCl呈陰(一)性;
12、檸檬酸鹽利用呈陰(一)性；
13、pH6. 8營養(yǎng)肉湯呈陽(+)性，pH5. 7營養(yǎng)肉湯呈陰(一)性；
14、卵磷酸脂酶試驗(yàn)呈陰(一)性；
15、吲哚試驗(yàn)呈陰(一)性；
16、生長溫度在30、40和50°C時(shí)呈陽(+)性，60°C時(shí)呈陰(一)性；
17、洛素水解試驗(yàn)呈陰(一)性；
18、絡(luò)氨酸水解呈陰(一)性；
19、脲酶試驗(yàn)呈陰(一)性。根據(jù)以上形態(tài)特征及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，查《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定》可知抗枯1號與Bacillus pumilus (短小芽孢桿菌)最相似，可見抗枯1號為一株短小芽孢桿菌(Mcillus pumilus)?？箍?號的抗枯萎病實(shí)驗(yàn)
在室內(nèi)無菌條件下將每ml含1. 4X IO7個短小芽孢桿菌(feciBm /^ffliAz1S)的菌液涂在NA培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿自然晾干后，取直徑為0.8cm香蕉枯萎病菌放置于平板中央， 并將放置在未涂短小芽孢桿菌(feciBM /^tfBiAz1S)菌液的NA培養(yǎng)基上的處理作空白對照組。96小時(shí)后觀察不同處理組的香蕉枯萎病病原菌的生長情況，并測量其直徑的大小。
權(quán)利要求
1.短小芽孢桿菌抗枯1號，其保藏號為CCTCCNO :M2011243o
2.權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌抗枯1號在防治枯萎病中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的短小芽孢桿菌抗枯1號在防治香蕉枯萎病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了短小芽孢桿菌抗枯1號，其保藏號為CCTCC NOM2011243。該菌株易于培養(yǎng)，使用方便，可很好的防治香蕉枯萎病。
文檔編號A01P3/00GK102399715SQ201110316589
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者廖永林, 張揚(yáng), 張振飛, 李燕芳, 肖漢祥 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所