專利名稱：菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)菘藍(lán)試管苗無菌根獲得再生植株的方法， 屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
( Isatis indigotica Fort. )禾斗(cruciferaeIsatis Linn) 2年生草本植物。菘藍(lán)全株入藥，是我國南北各地廣為栽培的藥用植物。在中藥學(xué)中，菘藍(lán)的干燥根稱為板藍(lán)根，干燥葉稱為大青葉，兩者都具有清熱解毒、涼血消斑的功效， 廣泛用于各種方劑中。大青葉中所含生物堿類化學(xué)成分靛玉紅還有治療慢性粒細(xì)胞白細(xì)胞病的作用。利用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖和高產(chǎn)栽培、對節(jié)約耕地、提高產(chǎn)量有重要意義。在植物離體器官發(fā)生過程中，根據(jù)不同的培養(yǎng)條件，不定芽可以不經(jīng)過愈傷組織階段從外植體上直接分化形成(直接器官發(fā)生)；也可以從外植體脫分化形成的愈傷組織中發(fā)生(間接器官發(fā)生)。有關(guān)菘藍(lán)組織培養(yǎng)直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生生成不定芽均有報(bào)道。葉片在 MS + 6 - BA 2 mg/L+ NAA 1 mg/L培養(yǎng)可直接誘導(dǎo)形成不定芽(中草藥，1995，( 1) :52)； 用含KT 2 mg/L + NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)菘藍(lán)下胚軸分化形成不定芽，誘導(dǎo)率達(dá) 87. 5% (西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，四(6):1069);用菘藍(lán)嫩葉、葉柄和嫩莖為外植體(四川師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1991,12 (4) 358)，以下胚軸為外植體分別建立了菘藍(lán)的快速繁殖體系(中國中藥雜志，1993，18(1):21)，這些都是直接器官發(fā)生的報(bào)道。而附加6-BA 0.5 mg/L和NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)歐洲菘藍(lán)子葉愈傷組織(湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，觀 (2) :183)，以及“不同培養(yǎng)基對菘藍(lán)葉片組織培養(yǎng)的效應(yīng)，廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2007，(6) :30”等報(bào)道是菘藍(lán)通過間接器官發(fā)生途徑再生。組織培養(yǎng)過程中，采用不同來源外植體和不同培養(yǎng)條件對優(yōu)化培養(yǎng)過程，降低生產(chǎn)成本具有積極意義。根段相對于其他類型外植體具有以下優(yōu)點(diǎn)首先，它們很容易獲得， 其次，根作為外植體不會(huì)徹底殺死供體植株，另外，根中還可獲得穩(wěn)定的次生代謝產(chǎn)物。液體培養(yǎng)作為試管苗培養(yǎng)的方式也有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，液體培養(yǎng)基省略了瓊脂等凝固劑，降低了經(jīng)濟(jì)成本，減少了凝固劑的雜質(zhì)，保證了培養(yǎng)基在分批配制中的一致性，并且液體培養(yǎng)基更易于配制。已有的菘藍(lán)組培文獻(xiàn)報(bào)道中，無論是直接器官發(fā)生、還是間接器官發(fā)生，都是以菘藍(lán)子葉、葉片、下胚軸或子房為外植體，在固體培養(yǎng)基上通過不同激素的配比，誘導(dǎo)外植體的分化，完成其再生過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以菘藍(lán)試管苗或無菌苗的根為外植體，培養(yǎng)形成大量的毛狀根， 毛狀根進(jìn)一步培養(yǎng)可逐步分化出不定芽，進(jìn)而生根、長成完整植株。本發(fā)明具有取材方便， 不受季節(jié)限制，誘導(dǎo)增殖系數(shù)高，培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下
一種菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，包括毛狀根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于 以菘藍(lán)試管苗或無菌苗的根為外植體，培養(yǎng)形成大量的毛狀根。毛狀根的培養(yǎng)選取在MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菘藍(lán)試管苗根或10-15天的無菌種子苗幼根，切成長度為0. 5 1. Ocm的根段，作為培養(yǎng)外植體；外植體接種于液體分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成毛狀根。所述的MS固體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，pH 為 5. 8 6. 2 ；
液體分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加0 2 mg/L 6-BA，0 lmg/ L NAA, 30 g/L蔗糖，調(diào)pH到5.8 6. 2。上述形成的毛狀根在固體或液體分化培養(yǎng)基上分化形成不定芽，液體分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加0 2 mg/L 6-BA，0 lmg/ L NAA, 30 g/L蔗糖，調(diào)pH到 5. 8 6. 2 ；固體分化培養(yǎng)基是在液體分化培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂。上述形成的不定芽切成單株，接種至生根培養(yǎng)基中生根，生根培養(yǎng)基組成為MS 基本培養(yǎng)基，附加0 1 mg/L IBA, 0. 5 lmg/L NAA, 30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，調(diào)pH到 5. 8 6. 2。繼代苗或無菌苗的培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、分化不定芽、生根培養(yǎng)溫度為25 士 2 光照強(qiáng)度是30 40 mol · πΓ2 · s—1，16 h / 8 h光/暗培養(yǎng)，液體振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速80 r/min。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果
現(xiàn)有組培技術(shù)方法中，毛狀根的獲得通常都是通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)根在液體培養(yǎng)基中未經(jīng)轉(zhuǎn)化先形成大量的毛狀根，本發(fā)明可獲得一種新的可用于藥理學(xué)和植物化學(xué)研究的根擴(kuò)增體系。對于用根的藥用植物而言，根中的次生代謝產(chǎn)物含量高于其他組織，在體外建立根培養(yǎng)體系利于藥用成分的提取利用。本發(fā)明所提供的菘藍(lán)植株再生方法，具有取材方便，不受季節(jié)限制，誘導(dǎo)增殖系數(shù)高，毛狀根在分化培養(yǎng)基中僅需 2-7天就可逐步分化出不定芽，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，對于菘藍(lán)的育種及加速良種的無性繁殖具有積極作用。


圖1為液體分化培養(yǎng)的毛狀根； 圖2為液體分化培養(yǎng)的不定芽；
圖3為再生完整植株； 圖4為固體分化培養(yǎng)的毛狀根。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明使用的縮略語對應(yīng)的中文名稱如下
6-BA (6-芐基嘌呤)NAA (萘乙酸)IBA (3-吲哚丁酸)
本發(fā)明使用的MS培養(yǎng)基按手冊通用方法配制，組成與含量如下大量元素NH4NO3 1650 mg/L, KNO3 1900 mg/L，CaCl2 · 2H20 440 mg/L，MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 1700 mg/ L ；微量元素KI 0. 83 mg/L, H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L，ZnSO4 · 7H20 8.6 mg/L，Na2MnO4 ·2Η20 0. 25 mg/L，CuSO4 · 5Η20 0. 025 mg/L，CoCl2 ·6Η20 0. 025 mg/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 (27. 8)mg/L +Na2-EDTA · 2H20 (27. 3) mg/L ；有機(jī)成分肌醇 100 mg/L，煙酸 0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇(維生素B6) 0.5 mg/L，鹽酸硫胺素(維生素Bi) 0.5 mg/L，甘氨酸2 mg/L。以下通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1 菘藍(lán)種子剝除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0.1 % HgCl2消毒10 min,無菌水振蕩清洗5次，置于無菌濾紙上吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基上于黑暗處萌發(fā)，獲得無菌苗。培養(yǎng)10 15d的無菌苗根、下胚軸切成約1 cm的小段，子葉切成約0. 5X0. 5 cm 的小塊，置于附加ang/L的6-BA和O.aiig/L NAA, 3%蔗糖，0.7%瓊脂的固體分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)。均可出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，繼續(xù)培養(yǎng)每個(gè)芽點(diǎn)處可形成不定芽，呈叢生狀。將生長狀態(tài)良好的叢生不定芽苗切成單株，接種在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的生根，生根率達(dá)85. 4%。再生的組培苗可通過扦插方式繼代培養(yǎng)。通過上述組織培養(yǎng)過程獲得的繼代無菌苗根切成約1 cm的小段，置于不附加激素的液體分化培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)。根段首先形成大量的白色毛絨狀根，包裹整個(gè)外植體(圖 1)。將白色毛絨狀根接種在含ang/L 6-BA和0.5mg/L NAA, 3%蔗糖的固體分化培養(yǎng)基中， 觀察到不定芽點(diǎn)的形成，繼續(xù)培養(yǎng)可形成不定芽(圖2)。將生長狀態(tài)良好的叢生不定芽苗切成單株，接種在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的生根，生根率達(dá)80.3%，形成完整植株(圖3)。實(shí)施例2 菘藍(lán)種子剝除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0. 1 % HgCl2消毒10 min,無菌水振蕩清洗5次，置于無菌濾紙上吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基上于黑暗處萌發(fā)，獲得無菌苗。培養(yǎng)10 15d的種子苗根切成約1 cm的小段，置于不附加激素的液體分化培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)。根段首先形成大量的白色毛絨狀根，包裹整個(gè)外植體。將白色毛絨狀根接種在含ang/L 6-BA和0. 5mg/L NAA, 3%蔗糖的固體分化培養(yǎng)基中，觀察到不定芽的形成， 繼續(xù)培養(yǎng)可形成不定芽(圖4)。將生長狀態(tài)良好的叢生不定芽苗切成單株，接種在附加0.4 mg/L IBA的MS生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的生根。實(shí)施例3 菘藍(lán)種子剝除果皮，70 %的乙醇浸洗60 s，而后0. 1 % HgCl2消毒10 min,無菌水振蕩清洗5次，置于無菌濾紙上吸干水分，接種于MS培養(yǎng)基上于黑暗處萌發(fā)，獲
得無菌苗。培養(yǎng)10 15d的無菌苗根切成約1 cm的小段，直接置于附加0. 5mg/L 6-BA和 0. 2mg/L NAA液體分化培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)。根段首先形成白色毛絨狀根，但數(shù)量明顯少于實(shí)施例2和3中所述在MS無激素培養(yǎng)基中數(shù)量。繼續(xù)培養(yǎng)，觀察到不定芽的形成。將生長狀態(tài)良好的叢生不定芽苗切成單株，接種在附加0.2 mg/L IBA的MS生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的生根，生根率達(dá)49. m。在已有菘藍(lán)組培文獻(xiàn)中，取苗齡10天的無菌苗子葉和胚軸，接種于誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基中，1周后所有外植體略顯膨大，并于切口處長出愈傷紀(jì)織，20天左右陸續(xù)出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)(植物生理學(xué)通訊，1990，(12) :43)。菘藍(lán)幼嫩葉片外植體置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，7 天后葉片邊緣向葉遠(yuǎn)軸面卷曲，葉片有膨大現(xiàn)象，20天左右露出不定芽點(diǎn)，不定芽出現(xiàn)的高峰期在接種后的觀 32天(安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，21(4): 14)。比較菘藍(lán)毛狀根段在固體或液體分化培養(yǎng)基中分化時(shí)間和文獻(xiàn)報(bào)道中子葉，下胚軸，幼葉等外植體分化時(shí)間，發(fā)現(xiàn)根段分化所需時(shí)間最短，僅2 7天就可分化芽點(diǎn)。外植體可100%分化，并且每個(gè)外植體的繁殖系數(shù)高，可達(dá)到四十個(gè)不定芽，以此方法可在30天周期中快速高效繁殖出大量組
培試管苗。 本發(fā)明所提供的菘藍(lán)植株再生方法，具有取材方便，不受季節(jié)限制，誘導(dǎo)增殖系數(shù)高，毛狀根在分化培養(yǎng)基中僅需2 7天就可逐步分化出不定芽，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)， 對于菘藍(lán)的育種及加速良種的無性繁殖具有積極作用。
權(quán)利要求
1.一種菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，包括毛狀根的形成、分化不定芽、生根，其特征在于以菘藍(lán)試管苗或無菌苗的根為外植體，培養(yǎng)形成毛狀根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，其特征在于選取在MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菘藍(lán)試管苗根或10 15天的無菌種子苗幼根，切成長度為0. 5 1. 0 cm的根段，作為培養(yǎng)外植體；外植體接種于液體分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成毛狀根。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，其特征在于MS固體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，7 8/1瓊脂，？!1為5.8 6.2;液體分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加0 2 mg/L 6-BA，0 lmg/ L NAA, 30 g/L蔗糖，調(diào)pH到5.8 6. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，其特征在于根在固體或液體分化培養(yǎng)基上分化形成不定芽；液體分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加0 2 mg/L 6-BA，0 lmg/ L NAA, 30 g/L 蔗糖，調(diào) pH 到 5. 8-6. 2 ；固體分化培養(yǎng)基是在液體分化培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，其特征在于將增殖后的叢生不定芽苗切成單株，接種至生根培養(yǎng)基中生根；生根培養(yǎng)基組成為:MS基本培養(yǎng)基，附加0 1 mg/L ΙΒΑ，0·5 lmg/L NAA, 30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，調(diào)pH到5. 8 6. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意之一所述的菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，其特征在于繼代苗或無菌苗的培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、分化不定芽、生根培養(yǎng)溫度為25 士 2 °C，光照強(qiáng)度是 30 40 mol · πΓ2 · S、16 h / 8 h光/暗培養(yǎng)，液體振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速80 r/min。
全文摘要
一種菘藍(lán)根外植體器官發(fā)生方法，包括毛狀根的形成、分化不定芽、生根，具體選取在MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菘藍(lán)試管苗根或10～15天的無菌種子苗幼根，切成長度為0.5～1.0cm的根段，作為培養(yǎng)外植體；外植體接種于液體分化培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成毛狀根。本發(fā)明所提供的菘藍(lán)植株再生方法，具有取材方便，不受季節(jié)限制，誘導(dǎo)增殖系數(shù)高，毛狀根在分化培養(yǎng)基中僅需2-7天就可逐步分化出不定芽，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102283124SQ20111019890
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月16日
發(fā)明者李娜, 步懷宇, 畢彥博, 潘紅艷, 王英娟 申請人:西北大學(xué)