一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌 方法。 技術(shù)背景
[0002] 業(yè)內(nèi)人士共知，能否獲得無菌材料是決定植物組織培養(yǎng)工作能否真正開始和繼續(xù) 進行的第一道門檻。而能否對外植體進行成功的消毒滅菌，則是獲得無菌材料的首要環(huán)節(jié)。 一般的植物外植體，通過流水沖洗，次氯酸鈉、酒精、升汞、洗衣粉、吐溫，等殺菌劑與表面活 性劑的配合使用，即可取得較好的消毒滅菌效果。但是，對于那些表面多刺多毛的外植體， 特別是在毛、刺比較密集的部位（例如花蕾、包有多層鱗片的休眠芽和仙人掌類的莖段， 等），由于滅菌液體表面張力的存在，很容易在刺毛間產(chǎn)生頑固的氣泡，形成滅菌劑無法觸 及的"死角"，即使加入足夠多的強力表面活性劑吐溫，加上反覆地搖動，也成效甚微。最終 導(dǎo)致外植體的污染率極高，甚至全軍覆沒，造成材料、人力和試劑的嚴重浪費。如果是珍稀 的外植體材料，更會令人心痛不已。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種創(chuàng)造負壓環(huán)境使氣泡破裂逸出氣體，徹底清 除藏菌死角，保證滅菌液充分浸潤到外植體的每一部分，快速、安全、高效獲得多刺多毛植 物外植體無菌材料的多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法。
[0004] 本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：
[0005] 一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法，包括以下步驟：
[0006] (1)將外植體按常規(guī)流水沖洗表面灰塵，除去游離水，按常規(guī)對外植體進行表面消 毒；
[0007] (2)將外植體浸泡到用容器裝盛的含表面活性劑的消毒殺菌液中，消毒殺菌液的 液面高出外植體Icm以上；
[0008] (3)將容器放入連接有抽氣泵的真空干燥器中，啟動抽氣泵，抽氣時間為2-10分 鐘，至沒有氣體逸出消毒殺菌液的液面時停止抽氣，將外植體取出，用無菌水按常規(guī)反復(fù)洗 滌外植體至無皂泡發(fā)生，即獲得多刺多毛植物外植體的無菌材料。
[0009] 所述消毒殺菌液為HgCl2，其質(zhì)量濃度為0. 1 %。
[0010] 表面活性劑為吐溫，添加量為2- 5滴。
[0011] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：創(chuàng)造負壓環(huán)境破壞多毛多刺部位形成的頑固氣泡，徹底 清除藏菌死角，保證消毒殺菌液能充分浸潤到外植體的每一部分，提高獲得多刺多毛外植 體無菌材料的幾率，且省時，安全。
【具體實施方式】
[0012] 以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。在未背離本發(fā)明 精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明的方法、步驟或創(chuàng)造負壓環(huán)境的條件所作的修改或替換，均 屬于本發(fā)明的范圍。
[0013] 以仙人掌科植物火龍果的莖段為實驗材料：
[0014] 取火龍果健壯幼嫩的帶芽眼莖段作外植體，芽眼處刺毛特別密集。先將三棱莖段 按常規(guī)流水沖洗表面灰塵，毛巾除去游離水，棉簽沾75%酒精對"莖溝"消毒，沿著"莖溝"縱 向分切，獲得單棱莖段，繼而再橫向分切成單芽眼莖段，每段2cm-3cm，共120段。在2000ml 燒杯中用75%酒精消毒30s后，取出莖段分別移至6個250ml，裝有質(zhì)量濃度為0. 1 %HgCl2 溶液的廣口瓶中，每瓶20個莖段，保證溶液液面高過外植體約2cm，每瓶加入5滴吐溫-20， 充分搖動。然后分成A，B兩大組，每大組3個廣口瓶。
[0015] A組常規(guī)消毒殺菌作對照（CK)，依消毒時間再分為3小組:A-l、A-2、A-3,按常規(guī) 在凈化工作臺上分別消毒殺菌5111；[11、101]1；[11、151]1；[11，然后及時用無菌水洗絳外植體6遍，接 種于MS+BA3. 0+NAA0. 1培養(yǎng)基，每瓶培養(yǎng)基接種1個外植體，每小組20瓶。
[0016]B組為負壓處理消毒殺菌，也分為3小組：B-I、B-2、B-3,分別放入3個連接有小型 電動抽氣泵的真空干燥器中。啟動抽氣泵并計時組抽氣2min時，不再有氣泡逸出，關(guān) 閉抽氣泵，打開真空干燥器取出廣口瓶，在凈化工作臺上用無菌水洗滌外植體6遍，接種于 上述同樣的培養(yǎng)基，每瓶培養(yǎng)基接種1個外植體。B-2組抽氣5min，B-3組抽氣lOmin，其他 操作同B-I組。
[0017] 上述A，B兩大組材料消毒殺菌后接種于同樣的培養(yǎng)基中，并在溫度、光照完全相 同的條件下進行常規(guī)培養(yǎng)觀察，按下列公式定時統(tǒng)計：
[0018] 污染率=污染莖段數(shù)/接種莖段數(shù)X100% ;
[0019] 發(fā)芽率=發(fā)芽莖段數(shù)/接種莖段數(shù)X100%(不論污染與否）；
[0020] 死亡率=死亡莖段數(shù)/接種莖段數(shù)X100% (不論污染與否）。
[0021] 其中，死亡率包括污染腐爛死亡和汞中毒死亡。輕度污染仍有發(fā)芽可能。
[0022] 結(jié)果見表1。
[0023] 表1常規(guī)消毒滅菌與負壓消毒滅菌的效果對比
[0024]
【主權(quán)項】
1. 一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將外植體按常規(guī)流水沖洗表面灰塵，除去游離水，按常規(guī)對外植體進行表面消毒； (2) 將外植體浸泡到用容器裝盛的含表面活性劑的消毒殺菌液中，消毒殺菌液的液面 高出外植體Icm以上； (3) 將容器放入連接有抽氣泵的真空干燥器中，啟動抽氣泵，抽氣時間為2-10分鐘，至 沒有氣體逸出消毒殺菌液的液面時停止抽氣，將外植體取出，用無菌水按常規(guī)反復(fù)洗滌外 植體至無皂泡發(fā)生，即獲得多刺多毛植物外植體的無菌材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法，其特征在于，所 述消毒殺菌液為HgCl2，其質(zhì)量濃度為0. 1 %。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法，其特征在于，表 面活性劑為吐溫，添加量為2- 5滴。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多刺多毛植物外植體的消毒滅菌方法，包括以下步驟：(1)、將外植體按常規(guī)流水沖洗表面灰塵，除去游離水，按常規(guī)用酒精表面消毒；(2)、將裝有外植體與消毒殺菌液的容器放入連接有抽氣泵的真空干燥器中，創(chuàng)造負壓環(huán)境，使外植體多毛多刺部位形成的頑固氣泡破裂，氣體逸出，徹底清除藏菌死角，保證消毒殺菌液浸潤到外植體所有的表面，快速、安全、高效獲得多毛多刺外植體無菌材料。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104542279
【申請?zhí)枴緾N201410817763
【發(fā)明人】許鴻源, 周鳳玨, 龔銀花, 梁瓊月, 許皓翔, 莫淑媚
【申請人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月24日