專利名稱：肝癌細(xì)胞系hcc-ly5的建立及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及ー種新的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系HCC-LY5、及其建立方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展是十分復(fù)雜的，要深入的探討各種疾病的發(fā)病機(jī)理及其療效機(jī)制不能在患者身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是可以遵循動(dòng)物保護(hù)法，通過(guò)動(dòng)物對(duì)各種疾病和生命現(xiàn)象進(jìn)行研究，進(jìn)而推繹到人類探索人類生命的奧秘，探索人類疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī) 律，以控制人類疾病的發(fā)生、發(fā)展，治愈疾病和減輕人類患病痛苦，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)人類的壽命。長(zhǎng)期以來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象來(lái)推動(dòng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展是困難的，臨床上所積累的經(jīng)驗(yàn)不僅在時(shí)間和空間上存在著局限性，而且許多實(shí)驗(yàn)還在倫理道德和方法學(xué)上存在著各種限制。人類疾病的動(dòng)物模型(Animal model of human diseases)是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料。使用動(dòng)物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個(gè)極為重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段，有助于更方便、更有效地認(rèn)識(shí)人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。腫瘤細(xì)胞系在腫瘤的基礎(chǔ)研究中具有重要地位，體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞是較困難的，尤其建立能夠長(zhǎng)期生長(zhǎng)、傳代，又具有一定特征的人腫瘤細(xì)胞系。對(duì)于肝癌領(lǐng)域而言，目前，雖然有ー些肝癌細(xì)胞系，但是這些肝癌細(xì)胞系存在多種缺點(diǎn)，其中包括傳代不穩(wěn)定、成瘤性較差、細(xì)胞系的特性不一致、肝癌特異性標(biāo)志物表達(dá)參差不齊、有些甚至不表達(dá)等，因此無(wú)法令人滿意。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)有效的、能夠穩(wěn)定傳代、成瘤性好、且適用于建立動(dòng)物模型的各種腫瘤細(xì)胞系，尤其是肝癌細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供ー種穩(wěn)定傳代、成瘤性好、且適用于建立動(dòng)物模型的各種腫瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的是提供所述的肝癌細(xì)胞系的制備方法和用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種人肝癌細(xì)胞，所述肝癌細(xì)胞是人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞HCC-LY5，它保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :C201099。在本發(fā)明的第二方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的人肝癌細(xì)胞的子代細(xì)胞，其中所述子代細(xì)胞能夠?qū)е侣闶笮纬筛伟?。在另ー優(yōu)選例中，所述的子代細(xì)胞基本保留或全部了親代的人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞HCC-LYC5的特性。在另ー優(yōu)選例中，所述的人肝癌細(xì)胞HCC-LY5或其子代細(xì)胞具有以下特性
(a)有低于O. 2% (約0.02_0.2%，較佳地約0.1%)細(xì)胞表達(dá)0)133;(b)有較高的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移能力；(C)有一定的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(如肺轉(zhuǎn)移)能力。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明上述人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞的用途，它們被用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生肝癌。在另ー優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物選自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。在另ー優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物是免疫缺陷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在另ー優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物為裸鼠(T細(xì)胞缺陷)，N0N/SCID小鼠(T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞聯(lián)合缺陷)。 在本發(fā)明的第四方面，提供了ー種建立肝癌動(dòng)物模型的方法，包括步驟(a)將IX IO4-IX IO9個(gè)本發(fā)明上述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物7-100天，獲得肝癌動(dòng)物模型。在另ー優(yōu)選例中，所述的接種是接種于以下部位肝臟、腹腔、尾靜脈、皮下部位或
其組合。在另ー優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物是免疫缺陷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在另ー優(yōu)選例中，步驟(b)中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物14-50天，獲得肝癌動(dòng)物模型。在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物選自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。在另ー優(yōu)選例中，所述的動(dòng)物是裸鼠或N0N/SCID小鼠。在本發(fā)明的第五方面，提供了ー種體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的方法，包括步驟在適合培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)本發(fā)明上述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選治療肝癌的候選化合物的方法，包括步驟(a)將IX IO4-IX IO9個(gè)本發(fā)明上述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物7-100天，獲得肝癌動(dòng)物模型；和(c)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的肝癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行比較，其中施用后導(dǎo)致肝癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療肝癌的候選化合物；或者所述方法包括(a)測(cè)試組中，在本發(fā)明所述的人肝癌細(xì)胞HCC-LY5的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在人肝癌細(xì)胞HCC-LY5的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或増殖有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。在另ー優(yōu)選例中，其特征在于，在步驟(C)中，將測(cè)試化合物的施用方式選自下組局部施用于肝癌病灶處、靜脈給藥、ロ服給藥。在本發(fā)明的第七方面，提供了用本發(fā)明上述方法制備的形成的肝癌模型動(dòng)物。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖I顯示了本發(fā)明細(xì)胞系HCC-LY5的成瘤性。圖2顯示了細(xì)胞系HCC-LY5的培養(yǎng)情況。該圖顯示了半干法培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞爬出組織塊的情況(100X)圖3顯示了本發(fā)明細(xì)胞系HCC-LY5細(xì)胞形態(tài)。圖4顯示了本發(fā)明細(xì)胞系HCC-LY5的luciferase/GFP雙標(biāo)記結(jié)果。左圖為明場(chǎng)(200x)，右圖為熒光(200x)。圖5顯示了 HCC-LY5免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。
圖6顯示了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCC-LY5細(xì)胞肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果。圖6A E分別是流式分析HCC-LY5細(xì)胞⑶133、EpCAM,⑶44、⑶24和⑶45分子表達(dá)結(jié)果。圖7顯示了本發(fā)明細(xì)胞系HCC-LY5中不存在SP細(xì)胞群。圖8顯示了本發(fā)明HCC-LY5細(xì)胞⑶133+/-細(xì)胞群皮下成瘤結(jié)果。從上至下分別為10/只、100/只和1000/只的成瘤情況。圖9顯示了 HCC-LY5細(xì)胞克隆形成能力比較。HCC-Y5細(xì)胞⑶133+ (上)與CD133-(下)細(xì)胞群平板克隆形成實(shí)驗(yàn)(500細(xì)胞/孔)結(jié)果表明，兩者無(wú)顯著區(qū)別。圖10顯示了不同傳代數(shù)HCC-LY5細(xì)胞分離的CD133+/-細(xì)胞群的RT-PCR檢測(cè)結(jié)
果O圖11顯示了本發(fā)明HCC-LY5細(xì)胞系的Western印跡檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，對(duì)上百個(gè)肝癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶腫瘤標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)，最后建成ー種肝癌無(wú)限細(xì)胞系HCC-LY5。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明人將上百個(gè)患者的原發(fā)性肝癌組織，分別接種于免疫缺陷小鼠，經(jīng)生長(zhǎng)后，進(jìn)行裸鼠間連續(xù)傳代。再取腫瘤組織行體外培養(yǎng)，建立相應(yīng)的體外細(xì)胞系。對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)檢測(cè)。終于篩選得到一種純種人肝癌細(xì)胞系。該細(xì)胞系生長(zhǎng)穩(wěn)定(已穩(wěn)定傳代46代)，并且在光鏡下的形態(tài)學(xué)特征與誘發(fā)腫瘤組織一致。免疫組化分析顯示，細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物及癌基因蛋白產(chǎn)物呈高表達(dá)。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，該細(xì)胞系接種裸鼠后導(dǎo)致裸鼠生產(chǎn)腫瘤，其組織病理形態(tài)與原肝癌患者的腫瘤組織一致。本發(fā)明的人肝癌細(xì)胞不僅可以制備肝癌模型動(dòng)物，還可用于篩選治療肝癌的候選藥物的方法。一種優(yōu)選的篩選治療藥物(或?qū)δ[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有)的方法包括步驟(a)測(cè)試組中，在人肝癌細(xì)胞HCC-LY5的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在人肝癌細(xì)胞HCC-LY5的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組(存在顯著性差別)，則提示該測(cè)試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或増殖有抑制作用；此外，如果測(cè)試組中肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量或生長(zhǎng)速度大于對(duì)照組(存在顯著性差別)，則提示該測(cè)試化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或増殖有促進(jìn)作用。在另ー優(yōu)選例中，所述的小于表示測(cè)試組與對(duì)照組的數(shù)量之比或生長(zhǎng)速度之比彡O. 5，更佳地彡O. 25。在另ー優(yōu)選例中，所述的大于表示測(cè)試組與對(duì)照組的數(shù)量之比或生長(zhǎng)速度之比彡2，更佳地彡4。在另ー優(yōu)選例中，所述的顯著區(qū)別是P < O. 05。一種優(yōu)選的篩選治療藥物的方法包括步驟(a)將 I X IO4-I X IO9 (較佳地 I X IO5-I X IO8 更佳地 I X IO6-I X IO7)上述的人肝癌細(xì)胞HCC-LY5接種于哺乳動(dòng)物；(b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物7-100天，獲得肝癌動(dòng)物模型；
(C)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的肝癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行比較，其中施用后導(dǎo)致肝癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療肝癌的候選化合物。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在干(a)本發(fā)明的肝癌細(xì)胞系HCC-LY5的性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代；(b)本發(fā)明的肝癌細(xì)胞系HCC-LY5的成瘤性好，遺傳特性明確，是肝癌的基礎(chǔ)和臨床前期應(yīng)用研究的理想細(xì)胞系(有效性試驗(yàn))。(c)本發(fā)明的肝癌細(xì)胞系HCC-LY5可用于肝癌相關(guān)基因的體外、體內(nèi)功能研究(如通過(guò)生長(zhǎng)行為、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移能力觀察等)；(d)本發(fā)明的肝癌細(xì)胞系HCC-LY5可用于肝癌敏感性藥物的體外、體內(nèi)篩選(如通過(guò)生長(zhǎng)行為、運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移能力觀察等)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)' (New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)為重量百分比和重量份數(shù)。實(shí)施例I肝癌細(xì)胞系HCC-LY5的建立(a)來(lái)源該細(xì)胞系來(lái)自于一位男性肝癌患者(患者編號(hào)603320)，其臨床信息如下表所
/Jn ο表I
權(quán)利要求
1.一種人肝癌細(xì)胞，其特征在干，所述肝癌細(xì)胞是人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞HCC-LY5，它保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :C201099。
2.如權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞的子代細(xì)胞，其特征在于，所述子代細(xì)胞能夠?qū)е侣闶笮纬筛伟?br> 3.如權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞或權(quán)利要求2所述的子代細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞具有以下特性 (a)有低于O.2% (約O. 02-0. 2% )細(xì)胞表達(dá)CD 133 ； (b)具有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移能力；和 (c)具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(如肺轉(zhuǎn)移)能力。
4.如權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞的用途，其特征在于，用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生肝癌。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物選自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。
6.ー種建立肝癌動(dòng)物模型的方法，其特征在于，包括步驟 (a)將IX IO4-I X IO9個(gè)權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物； (b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物7-100天，獲得肝癌動(dòng)物模型。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物選自大鼠、小鼠、兔、羊、狗、猴子。
8.—種體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟在適合培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞。
9.一種篩選治療肝癌的候選化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟 (a)將IX IO4-I X IO9個(gè)權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞或其子代細(xì)胞接種于哺乳動(dòng)物； (b)培養(yǎng)步驟(a)的哺乳動(dòng)物7-100天，獲得肝癌動(dòng)物模型；和 (c)將測(cè)試化合物施用于步驟(b)的肝癌動(dòng)物模型，并與未施用測(cè)試化合物的步驟(b)的肝癌動(dòng)物模型進(jìn)行比較，其中施用后導(dǎo)致肝癌癥狀改善或治愈的測(cè)試化合物就是治療肝癌的候選化合物； 或者所述方法包括 (a)測(cè)試組中，在權(quán)利要求I所述的人肝癌細(xì)胞HCC-LY5的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在人肝癌細(xì)胞HCC-LY5的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況； 其中，如果測(cè)試組中肝癌細(xì)胞HCC-LY5的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或増殖有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(C)中，將測(cè)試化合物的施用方式選自下組局部施用于肝癌病灶處、靜脈給藥、ロ服給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了肝癌細(xì)胞系HCC-LY5的建立及應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供的所述肝癌細(xì)胞系HCC-LY5的性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代，并且適用于建立的肝癌動(dòng)物模型，是肝癌的基礎(chǔ)和臨床前期應(yīng)用研究的理想細(xì)胞系。另外，該肝癌細(xì)胞系HCC-LY5中極少部分表達(dá)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133。本發(fā)明還提供了該細(xì)胞系在建立模型動(dòng)物、篩選藥物等方面的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102690785SQ20111006978
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者劉蕾, 姚明, 孫荷芬, 張立行, 李錦軍, 葛超, 郝向芳, 閆明霞, 顧健人 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所