三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系trmf及其建立方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF及其建立方法。所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為C2013110。所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系具有對鯉春病毒血癥病毒的易感性。所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的生物學(xué)特性包括:細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣、胞漿豐富貼壁生長、具有接觸抑制生長特性，細(xì)胞倍增時間為36.01小時，特征染色體數(shù)目為75條。
【專利說明】三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系T RM F及其建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]泥嫩(Mis gurn us angui 11 iCaudatus)在分類學(xué)中屬于鯉形目(CypriniformeS)、鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)、泥鰍屬(Misgurnus),是亞洲特有的野生小型淡水魚類，廣泛分布于我國遼河以南大部分地區(qū)以及越南、朝鮮和日本。我國各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水溝、稻田等均有分布。泥鰍肉質(zhì)細(xì)嫩、味美，營養(yǎng)豐富，有“水中人參”之稱，除了較高的食用價值，它還具有一定的滋補(bǔ)藥用功效，是市場上暢銷的特種水產(chǎn)品之一。除了具有重要經(jīng)濟(jì)價值外，泥鰍還是一種很好的細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究材料。與二倍體泥鰍相比，三倍體泥鰍具有生長快、抗性強(qiáng)的特點(diǎn)，但目前對這些生物學(xué)特性的機(jī)理尚沒有明確的分析。
[0003]魚類細(xì)胞系的建立可用于病毒的分離、環(huán)境污染物檢測以及其他一些生物學(xué)特性的研究。三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系與其他魚類細(xì)胞系一樣可以滿足生物學(xué)研究、病毒的分離與擴(kuò)增、功能基因研究以及毒理學(xué)等應(yīng)用研究，除此之外，還可用于三倍體魚類的生長、抗性等的機(jī)制分析。然而，迄今為止還沒有三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系TRMF及其建立方法。
[0005]所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF于2013年8月19日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為C2013110。
[0006]所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF支持鯉春病毒血癥病毒的生長和復(fù)制。
[0007]木發(fā)明還提供一種建立三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF的方法，包括以下步驟:
[0008]1、制備細(xì)胞培養(yǎng)液
[0009]所用培養(yǎng)基為市售的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入胎牛血清、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，配制成所述培養(yǎng)液，胎牛血清占培養(yǎng)液總體積的20%，人堿性成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/ml，I型胰島素樣生長因子的終濃度為20ng/ml，硫酸軟骨素的終濃度為10 μ g/ml，所述培養(yǎng)液存放在4°C ;
[0010]I1、原代培養(yǎng)
[0011]在無菌環(huán)境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織，先用IOwt%的碘伏浸泡剪下的所述鰭組織15分鐘，再用含有終濃度為500IU/mL的青霉素和終濃度為500 μ g/mL的鏈霉素的混合液浸泡30分鐘，然后用無菌PBS漂洗，將漂洗后的鰭組織剪成Imm3左右的小塊，均勻接種在沒有加入培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中正置干貼24小時，然后往所述培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加所述培養(yǎng)液，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0012]II 1、傳代培養(yǎng)[0013]待步驟II的細(xì)胞長成單層后，移走培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，然后往所述培養(yǎng)瓶中加入
0.25%的胰蛋白酶溶液對所述細(xì)胞進(jìn)行消化處理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一層胰蛋白酶膜繼續(xù)消化I分鐘，加入培養(yǎng)液吹打消化后的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按預(yù)定比例轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)加培養(yǎng)液，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0014]IV、按照步驟III的過程傳代，30代后所用培養(yǎng)液為含有20Vol%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基 。
[0015]本發(fā)明所提供的三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系可用于進(jìn)行病毒學(xué)、病理學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳育種和種質(zhì)保存等理論研究。此外，該細(xì)胞系還可用于病毒疫苗研制等應(yīng)用研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是示出在顯微鏡下本發(fā)明三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系形態(tài)的圖。
[0017]圖2是圖1所示三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的染色體分析圖。
[0018]圖3是對圖1所示三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系進(jìn)行SSR分析的結(jié)果圖。
[0019]圖4是示出圖1所示三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系生長曲線的圖。
[0020]圖5是示出接種鯉春病毒血癥病毒四天后，三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系及其建立方法進(jìn)行說明。
[0022]1、細(xì)胞系的建立
[0023]所用的三倍體泥鰍是由二倍體泥鰍和四倍體泥鰍雜交獲得的。
[0024]該三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系TRMF的建立過程包括下述三個階段。
[0025](I)制備細(xì)胞培養(yǎng)液
[0026]所用培養(yǎng)基為市售的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入胎牛血清(FBS)、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，配制成細(xì)胞培養(yǎng)液。其中，胎牛血清占培養(yǎng)液總體積的20%，人堿性成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/mL，I型胰島素樣生長因子的終濃度為20ng/mL，硫酸軟骨素的終濃度為10 μ g/mL。配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液存放在4°C。
[0027](2)原代培養(yǎng)
[0028]在無菌環(huán)境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織。接下來，先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鰭組織15分鐘，再用青霉素和鏈霉素的混合液(青霉素終濃度為500IU/mL,鏈霉素終濃度為500 μ g/mL)浸泡30分鐘。浸泡結(jié)束之后，再用無菌PBS (配方:8gNaCl、0.2gKCl、
3.639Na2HP04.12Η20和0.24gKH2P04，溶于蒸餾水并定容至1L)漂洗兩遍。然后，將漂洗后的鰭組織剪成Imm3左右的小塊，均勻接種在沒有加入培養(yǎng)液的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中正置干貼24小時。然后往細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至5mL/瓶，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0029](3)傳代培養(yǎng)
[0030]待原代培養(yǎng)的細(xì)胞長成單層后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到干凈容器中備用。接著往細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入ImL0.25%的胰蛋白酶溶液，用于對細(xì)胞進(jìn)行消化處理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一層胰蛋白酶膜，繼續(xù)消化I分鐘，輕柔地磕碰細(xì)胞培養(yǎng)瓶。然后將前述轉(zhuǎn)移到干凈容器中備用的培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用吸管吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。按體積比1:1將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到兩個新的培養(yǎng)瓶中，并分別補(bǔ)加培養(yǎng)液至5mL。在25°C的0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞再次長成單層后，按照上述方法進(jìn)行傳代。30代后所用培養(yǎng)液為含20vol% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0031]2、細(xì)胞系的保存
[0032]所用的細(xì)胞凍存液配方如下:20%FBS，60%DMEM/F12和20%二甲基亞砜。保存于4°C冰箱中備用。
[0033]取生長旺盛的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶溶液消化。消化結(jié)束后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清，然后用ImL細(xì)胞凍存液重懸沉淀。調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0X IO6個/mL，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入凍存管中。
[0034]對細(xì)胞懸液逐漸降溫，具體降溫程序如下:首先在4°C冰箱中放置30min，然后轉(zhuǎn)入-20°C冰箱中放置2h，接著轉(zhuǎn)入-80°C冰箱中放置24h，最后放入液氮中(_196°C )長期保存。
[0035]取在液氮中保存的細(xì)胞，在4(TC水中解凍，待細(xì)胞懸液融化后轉(zhuǎn)入2 5 °C水浴中3min。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管，加入等量的DMEM/F12培養(yǎng)基，1500rpm離心5min，棄上清，用含20vol% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至5mL，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0036]同時，取少量解凍過程中重懸的細(xì)胞液，加入臺盼藍(lán)(Trypan Blue)染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的存活率，存活率=(活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))X100 %。
[0037]凍存的三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF存活率為(84.48± 1.13) %。
[0038]3、染色體分析
[0039]向培養(yǎng)有三倍體泥鰍鰭細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入終濃度為I μ g/mL的秋水仙素，將培養(yǎng)瓶置于25°C的C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3~5h。然后用0.25%的胰蛋白酶溶液消化，將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1500rpm離心5min，收集細(xì)胞。用0.075mol/L的KCl溶液低滲40min,然后Carnoy固定液固定15min,固定三次后滴片,干燥后用Giemsa染液染色。
[0040]顯微鏡下觀察拍照。計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，并進(jìn)行核型分析，根據(jù)染色體的長度、著絲點(diǎn)位置、臂長等特征，對染色體進(jìn)行分組、配對。
[0041]本發(fā)明所建立的三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系的染色體核型如圖2所示。
[0042]4、SSR 分析
[0043]通過SSR(Simple Sequence Repeats)技術(shù)來鑒定所建立的三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF是否與泥鰍具有相同的遺傳特征。
[0044]采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提法提取泥鰍肌肉組織(用作陽性對照)和斑馬魚肌肉組織(用作陰性對照)的基因組DNA。
[0045]按如下步驟提取三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF的基因組DNA:①取出冷凍在_20°C的傳代細(xì)胞，在4°C解凍后放入1.5mL離心管中，離心后去除上清液；②加入250yL的DNA裂解液(含有 I Ommo I/L Tris_Cl、50mmol/LKCl 和 0.5% Tween-20, pH8.0)，再加入 5μ L 蛋白酶Κ(濃度為0.5mg/mL)，于55°C水浴恒溫裂解3h;③參照苯酚-氯仿抽提法，用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。
[0046]接下來，進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增。[0047]根據(jù)已報道的泥鰍微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，合成Mac9、Mac50兩對引物(具體序列見表I)。
[0048]表1
【權(quán)利要求】
1.一種三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF，于2013年8月19日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為C2013110。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三倍體泥鰍的鰭細(xì)胞系TRMF，其特征在于，所述三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系支持鯉春病毒血癥病毒的生長和復(fù)制。
3.一種建立三倍體泥鰍鰭細(xì)胞系TRMF的方法，包括以下步驟: I、制備細(xì)胞培養(yǎng)液 所用培養(yǎng)基為市售的DMEM/F12培養(yǎng)基，加入胎牛血清、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、I型胰島素樣生長因子和硫酸軟骨素，配制成所述培養(yǎng)液，胎牛血清占培養(yǎng)液總體積的20%，人堿性成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/ml，I型胰島素樣生長因子的終濃度為20ng/ml，硫酸軟骨素的終濃度為10μ g/mi，所述培養(yǎng)液存放在4°C ； II、原代培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下剪取三倍體泥鰍的鰭組織，先用IOwt %的碘伏浸泡剪下的鰭組織15分鐘，再用含有終濃度為500IU/mL的青霉素和終濃度為500 μ g/mL的鏈霉素的混合液浸泡30分鐘，然后用無菌PBS漂洗，將漂洗后的鰭組織剪成imm3左右的小塊，均勻接種在沒有加入培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中正置干貼24小時，然后往培養(yǎng)瓶中加入所述培養(yǎng)液，在25 °C的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)； II I、傳代培養(yǎng) 待步驟II的細(xì)胞長成單層后，移走培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，然后往培養(yǎng)瓶中加入0.25%的胰蛋白酶溶液對細(xì)胞進(jìn)行消化處理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一層胰蛋白酶膜繼續(xù)消化I分鐘，加入培養(yǎng)液吹打消化后的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液按預(yù)定比例轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)加培養(yǎng)液，在25°C的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； IV、按照步驟III的過程傳代，30代后所用培養(yǎng)液為含20VOl%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12R1/91GK103525749SQ201310538151
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】李霞, 馬辰, 秦艷杰, 李雅娟, 楊艷津 申請人:大連海洋大學(xué)