專利名稱：麻瘋樹毒蛋白基因、組織特異性啟動(dòng)子和毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物的生產(chǎn)的制作方法
麻瘋樹毒蛋白基因、組織特異性啟動(dòng)子和毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物的生產(chǎn)相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年6月5日提交的美國臨時(shí)專利申請61/184，416號(hào)的優(yōu)先權(quán)， 在此通過引用將其并入本申請。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白基因(Jatropha curcas curcin gene)和組織特異性啟動(dòng)子的分離，以及毒蛋白缺陷型麻瘋樹屬植物的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白 1、毒蛋白2和毒蛋白2A的分離。本發(fā)明進(jìn)一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒蛋白2基因， 更具體地涉及毒蛋白1和毒蛋白2A基因的組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過使用RNAi技術(shù)抑制毒蛋白基因表達(dá)來生產(chǎn)毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物。本文所用的出版物和其它材料是用于說明本發(fā)明的背景，或提供與實(shí)踐有關(guān)的額外細(xì)節(jié)，它們在此援引加入且分別列在參考書目中供參考。植物生物技術(shù)十分需要組織特異性啟動(dòng)子，以在合適時(shí)間在特定植物組織中表達(dá)感興趣基因(Mansoor et al.，2006)。植物種子胚乳積累諸如淀粉、蛋白和脂類等儲(chǔ)存物質(zhì)(Berger et al. ,2006 ；Hannah and James，2008)。胚乳特異性啟動(dòng)子已被用于驅(qū)動(dòng)參與這些存儲(chǔ)物質(zhì)生物合成途徑的基因的表達(dá)(Roesler et al. , 1997 ；Plant et al. , 1994 ； Kuwano et al.，2009)。殺蟲毒素，如蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis (Bt)) S -內(nèi)毒素已被用于控制昆蟲(Christou et al. ,2006 ；Roh et al. ,2007) 雖然Bt毒素作為殺蟲毒素具有高特異性且對環(huán)境安全，但仍希望使Bt毒素在葉組織而非在種子和果實(shí)中特異地表達(dá)(Datta et al.，1998)。因此，越來越需要特異性啟動(dòng)子來控制感興趣基因在特定發(fā)育時(shí)期在特定組織中的表達(dá)。此外，多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)被用于遞送在一個(gè)表達(dá)載體中同時(shí)構(gòu)建的若干基因(Lin et al.，2003 ；Chen et al.，2006 ；Wakasa et al.，2006)。為避免基因沉默，這些多重基因中的每種均需要不同的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)。然而，缺乏適合的啟動(dòng)子是這類研究的重要限制因素(Quet al.，2008)。麻瘋豐對屬(Jatropha)(麻瘋豐對(Jatropha curcas))屬于大卓戈禾斗(Euphorbiaceae) 的小型熱帶木本植物。麻瘋樹為雙子葉植物，其種子包含高達(dá)40%的油(Bringi，1987)。來自麻瘋樹的油可作為化石燃料的有效替代物(Augustus et al.，2002 ；Azam et al.，2005 ； Forson et al.，2004 framanik，2003)。然而，麻風(fēng)樹具有幾個(gè)缺點(diǎn)，這限制了其廣泛的應(yīng)用。此植物的產(chǎn)量受到不利的雄花與雌花比的限制，并且其含油量尚未通過育種進(jìn)行優(yōu)化。 該植物對生物脅迫如病毒(Narayarma et al.，2007)、真菌和細(xì)菌病原體，和非生物脅迫特別是寒冷和干旱也很敏感(http://WWW. jatropha. org)。在植物的種子和葉中若干毒性組分(例如蛋白毒素、毒蛋白和致癌劑佛波酯)的存在給麻風(fēng)樹產(chǎn)業(yè)的農(nóng)民和生物加工工人帶來健康危害。毒蛋白是在麻瘋樹種子中鑒定的毒素蛋白(Stirpe et al. 1976)。麻瘋樹種子中毒蛋白以及其它毒素的存在阻礙了將麻瘋樹種子粉作為動(dòng)物飼料的應(yīng)用(Malikar et al.,1997)。毒蛋白屬于I類核糖體失活蛋白(RIP)，其具有RNAN-糖苷酶活性且能夠不可逆地滅活核糖體(Barbieri，1993，Lin et al.，2003a)。目前，五個(gè)毒蛋白已經(jīng)保藏在GenBank中， 它們的登錄號(hào)為 AAL58089(Linet al.，2003a)、AAL86778 (Lin et al. ,2003b), ABZ04128, AAR08395和ABW17M5。根據(jù)長度和它們的氨基酸殘基，這些毒蛋白可被分為兩類。1類毒蛋白的前體由293個(gè)氨基酸殘基組成，而2類毒蛋白的前體包含309個(gè)氨基酸殘基。Lin et al. (2003a)從麻瘋樹種子中鑒定了 1類毒蛋白，其編碼具有42個(gè)氨基酸信號(hào)肽的32_kDa 的毒蛋白前體。Wei et al. (2005)克隆了 2類毒蛋白基因。發(fā)現(xiàn)被命名為毒蛋白2的毒蛋白基因被脅迫誘導(dǎo)。此類中的毒蛋白成員在氨基酸上顯示出93%至98%的相同性，而兩種不同類之間的成員顯示出87%的氨基酸相同性。改進(jìn)麻瘋樹農(nóng)藝學(xué)和質(zhì)量性狀的重要策略是遺傳修飾?？僧a(chǎn)生表達(dá)同源和異源基因序列的麻瘋樹植物。在許多情況中，期望一個(gè)或多個(gè)確定功能的同源基因的過量表達(dá)或通過RNA干擾(RNAi)沉默。麻瘋樹屬的基因序列可從cDNA和基因組文庫中獲得，且這些基因的功能可通過與已知功能的其它植物基因的序列同源性來暫定。通常利用組織特異性啟動(dòng)子在所希望的組織中表達(dá)同源或異源基因序列。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后靶基因沉默技術(shù)，其使用雙鏈RNA (dsRNA)來引起包含與dsRNA 相同序列的信使RNA(mRNA)的降解(Constans，2002)。小干擾RNA或siRNA在至少兩步中產(chǎn)生內(nèi)源性核糖核酸酶將較長的dsRNA切割為較短的dsRNA，即21-23個(gè)核苷酸長度的RNA。 隨后，siRNA片段介導(dǎo)靶mRNA的降解(Zamore，2001)。RNAi以類似于反義寡核苷酸的方式被用于基因功能的確定(Constans，2002)。已對在瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)siRNA 的表達(dá)載體進(jìn)行工程化以表達(dá)小發(fā)夾RNA(shRNA)，其在體內(nèi)被加工為能進(jìn)行基因特異性沉默的 siRNA 樣分子(Brummelkamp et al. ,2002 ；Paddison et al.，2002)。通過雙鏈 RNA 進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的更多細(xì)節(jié)參見Hutvdgner and Zamore, 2002 ；Vaucheret et al.， 2001 ；Hammond et al.，2001 ；Maine,2000 ；Fire et al.，1998 ；禾口Timmons and Fire，1998。 使用RNAi抑制基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見例如美國專利5，034，323 號(hào)；6，326，527 號(hào)；6，452，067 號(hào)；6，573，099 號(hào)；6，753，139 號(hào)；和 6，777，588 號(hào)。也參見國際專利公布 WO 97/01952、WO 98/36083、W098/53083、WO 99/32619 和 WO 01/75164 ；和美國專利公布 2003/0175965、2003/0175783、2003/0180945、2004/0214330、2005/(^44858、 2005/0277610,2007/0265220 和 2010/0058498。因此，希望分離這樣的組織特異性啟動(dòng)子，其用于控制感興趣基因在麻瘋樹、其它麻瘋樹屬物種以及其它植物物種中在特定發(fā)育時(shí)期在特定組織中的表達(dá)，以用于如這類植物的基因工程化。也希望這樣的分離的啟動(dòng)子，其可用在麻瘋樹、其它麻瘋樹屬物種以及其它植物物種的基因工程化中。也希望生產(chǎn)對人和動(dòng)物無毒的毒蛋白缺陷型麻瘋樹屬植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白基因和組織特異性啟動(dòng)子的分離，以及毒蛋白缺陷型麻瘋樹屬植物的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A的分離。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒蛋白2基因，更具體地涉及毒蛋白1和毒蛋白 2A基因的組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過使用RNAi技術(shù)抑制毒蛋白基因表達(dá)來生產(chǎn)毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物。
因此，第一方面，本發(fā)明提供了三種麻瘋樹毒蛋白基因的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。毒蛋白1的核苷酸序列如SEQID NO 1所示。毒蛋白1的編碼序列包含SEQ ID NO :1中474-1355位的核苷酸。毒蛋白1的蛋白序列如SEQ ID NO 2所示。在第二個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。毒蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。毒蛋白1的編碼序列包括SEQ ID NO :3中439-1368位的核苷酸。毒蛋白 2的蛋白序列如SEQ ID NO 4所示。在第三個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?A。毒蛋白2A的核苷酸序列如 SEQ ID NO 5所示。毒蛋白2A的編碼序列包括SEQ ID NO :5中475-1404位的核苷酸。毒蛋白2A的蛋白序列如SEQ ID NO 6所示。第二方面，本發(fā)明提供了兩種麻瘋樹毒蛋白基因的組織特異性啟動(dòng)子和第三種麻瘋樹毒蛋白基因的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子源自毒蛋白1基因。毒蛋白1 啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所述。毒蛋白1啟動(dòng)子為胚乳特異性啟動(dòng)子。此序列的片段也有組織特異性啟動(dòng)子，即胚乳特異性啟動(dòng)子的活性。這類片段包括以下(a) SEQ ID NO :7 中 H888 位的核苷酸、(b) SEQ ID NO :7 中 1142-3181 位的核苷酸、(c) SEQ ID NO :7，其中2944-3170位的核苷酸被缺失、(d) SEQ ID NO 7中1142-3181位的核苷酸， 其中2944-3170位的核苷酸被缺失、和(e) SEQ ID NO 7中2688-3181位的核苷酸，其中 2944-3170位的核苷酸被缺失。在第二個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子源自毒蛋白2A基因。毒蛋白2A啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO :8所述。毒蛋白2A啟動(dòng)子為葉特異性啟動(dòng)子。此序列的片段也有組織特異性啟動(dòng)子的活性。然而，當(dāng)將一些序列缺失時(shí)，特異性由葉特異的變?yōu)榉墙M織特異的。具有非組織特異性啟動(dòng)子的活性的此類片段包括以下(a) SEQ ID NO :8中912-2087位的核苷酸、(b)SEQ ID NO 8中1-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失、(c) SEQ ID NO 8中912-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失、和(d) SEQ ID NO 8 中1751-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失。在第三個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子源自毒蛋白2基因。毒蛋白2啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。如本文所述，此啟動(dòng)子在胚乳或葉組織中不表達(dá)，但可通過昆蟲襲擊時(shí)茉莉酸(JA)的活化和/或防御反應(yīng)或葉老化期間乙烯的活化來活化和表達(dá)。第三方面，本發(fā)明提供了毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物和毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物包括穩(wěn)定整合入其基因組中的核酸，其中所述核酸編碼靶向毒蛋白基因的雙鏈RNA(dsRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物包括穩(wěn)定整合入其基因組中的核酸，其中所述核酸編碼靶向毒蛋白基因的短干擾RNA(SiRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物包括穩(wěn)定整合入其基因組中的核酸，其中所述核酸編碼靶向毒蛋白基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?A。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白1基因的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2基因的一部分。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2A基因的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物通過轉(zhuǎn)化麻瘋樹屬植物組織生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化為農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。


圖1 包含毒蛋白基因的BAC克隆的分離以及毒蛋白基因的分離。將7個(gè)包含毒蛋白基因的BAC克隆用HindIII (左面)消化，且其DNA印跡用包含毒蛋白1編碼區(qū)的探針雜交(右面)。標(biāo)準(zhǔn)DNA標(biāo)記(New England Biolabs, #N3012L)的分子量以千堿基(Kb)表示。M表示分子量標(biāo)記。圖2 毒蛋白1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。毒蛋白1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)如核苷酸序列的1位所示。5’非翻譯區(qū)(5’UTR)中內(nèi)含子的核苷酸序列用小寫字母顯示。寡聚引物的位置用粗斜體突出顯示，箭頭表示正向或反向。編碼區(qū)中的兩個(gè)Sau3AI位點(diǎn)用粗體加下劃線表示。第二個(gè)多腺苷酸信號(hào)序列僅用粗體突出顯示。圖3 毒蛋白2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 3)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO 4)。毒蛋白2的推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)如核苷酸序列的1位所示。5’非翻譯區(qū)(5’ UTR) 中內(nèi)含子的推定的核苷酸序列用小寫字母顯示。寡聚引物的位置用粗斜體突出顯示，箭頭表示正向或反向。編碼區(qū)中的兩個(gè)Sau3AI位點(diǎn)用粗體加下劃線顯示。第二個(gè)多腺苷酸信號(hào)序列僅用粗體突出顯示。毒蛋白2的注釋基于毒蛋白1的注釋來預(yù)測。圖4 毒蛋白2A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)和其推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO :6)。毒蛋白2A的推定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)如核苷酸序列的1位所示。5’非翻譯區(qū)(5’UTR) 中內(nèi)含子的核苷酸序列用小寫字母顯示。寡聚引物的位置用粗斜體突出顯示，箭頭表示正向或反向。編碼區(qū)中的Sau3AI位點(diǎn)用粗體加下劃線顯示。第二個(gè)多腺苷酸信號(hào)序列僅用粗體突出顯示。圖5 通過酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)分析來檢測毒蛋白基因的多態(tài)性。將引物CF2和CR2擴(kuò)增的來自BAC克隆121Ε10Φ泳道)或基因組DNA(G泳道)的PCR片段用 Sau3AI消化。毒蛋白1產(chǎn)生3條帶(195bp、243bp和582bp)，毒蛋白2也產(chǎn)生3條帶(195bp、 243bp和580bp)，然而毒蛋白2A產(chǎn)生2條帶(M3bp和775bp)。BAC克隆121E10僅包含毒蛋白1和毒蛋白2，因此，消化的PCR產(chǎn)物(B泳道)具有3條帶(195-bp帶、243-bp帶以及無法在1. 2%瓊脂糖凝膠中分離的580-bp帶和582-bp帶)?；蚪MDNA包含全部3種毒蛋白基因。基因組DNA的消化的PCR產(chǎn)物(G泳道)具有B泳道所示的全部帶和775bp大小的另一條帶。M, 100-bp DNA 梯帶(New England Biolabs, #N3231L)以堿基對表示。圖6 從麻瘋樹鑒定出的毒蛋白的比對。顯示8種毒蛋白基因相同性的氨基酸殘基用黑色背景顯示。鏢狀箭頭表示N末端信號(hào)肽的切割位點(diǎn)(Lin etal.，2003a)。氨基酸序列標(biāo)識(shí)符如下所示毒蛋白 2A-SEQ ID NO 6 ；ABZ04128-SEQ ID NO 10 ；AAR08395-SEQ ID NO 11 ；ABW17545-SEQID NO 12 ；毒蛋白 I-SEQ ID NO 2 ；AAL58089-SEQ ID NO 13 ；毒蛋白 2-SEQ ID NO 4 ；禾口 AAL86778-SEQ ID NO :14。圖7 從麻瘋樹鑒定出的毒蛋白的系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹由未命名的ClustalW創(chuàng)建。圖8A-8C 麻瘋樹中毒蛋白基因的表達(dá)。圖8A 通過RT-PCR檢測麻瘋樹中毒蛋白 1和毒蛋白2A基因的表達(dá)。毒蛋白1的引物為CF和ClSR(表1)，毒蛋白2A的引物為CF 和C2ASR(表1)。L，來自葉的RNA樣品；E，來自胚乳的RNA樣品。圖8B:毒蛋白1在不同發(fā)育時(shí)期胚乳中的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄物水平通過實(shí)時(shí)PCR測定，且擴(kuò)增序列的相同性通過測序確認(rèn)。 麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)部對照，顯示出標(biāo)準(zhǔn)化為6周齡種子(6wk)的相對值。毒蛋白 1的引物為ClSF和C1SR，麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因的引物為Jcactin F2和Jc actin Rl (表 1)。圖8C:毒蛋白2在葉中的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄物水平通過實(shí)時(shí)PCR測定，且擴(kuò)增序列的相同性通過測序確認(rèn)。麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)部對照，顯示出標(biāo)準(zhǔn)化為新葉(YL)的相對值。 毒蛋白2A的引物為C2ASF和ClSR(表1)，麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因的引物為Jc actin F2 和 Jc actin Rl (表 1)。YL，新葉；FL，完全展開的葉；0L，老葉；IL，粉蚧(Pseudococcidae hirsutus)感染的完全展開的葉。圖9 麻瘋樹中毒蛋白的檢測，顯示出抗毒蛋白IN抗體探測的蛋白印跡。在葉中檢測出分子量大小為約；34至約35kDa的帶(可能為毒蛋白2A)。在全部測試目錄(accession) 的種子中檢測出分子量大小為約^kDa的另一條帶(可能為成熟毒蛋白1)。在葉、愈傷組織和種子中檢測出分子量大小為約39kDa的未知蛋白，但其在根中未檢測出。類似地，在種子中檢測出分子量大小為約16kDa的未知蛋白。標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)記(Amersham Biosciences, RPN755)的分子量以千道爾頓(kDa)顯示。L，葉；C，愈傷組織；R，根；Si，來自印尼目錄 (Indonesia accession)的種子；S2，來自印度目錄Qndia accession)的種子；S3，來自中 Hg^ (China accession)白勺禾中〒；S4，: 自目: (South America accession)白勺禾中子。圖10A-10D 毒蛋白1在發(fā)育種子胚乳細(xì)胞中的亞細(xì)胞免疫金定位。圖IOA 6周齡種子的胚乳細(xì)胞。標(biāo)尺=5μπι。圖IOB 免疫前血清對照(Preimmune serum control) 未顯示出蛋白體的免疫標(biāo)記。標(biāo)尺=0.2μπι。圖IOC 免疫定位至蛋白體的毒蛋白1。標(biāo)尺=0.2μπι。圖IOD 用抗毒蛋白IC抗體免疫標(biāo)記后，胚乳細(xì)胞的油體和細(xì)胞壁。標(biāo)尺= 0.5μπι。箭頭表示具有白色淀粉體的質(zhì)體。鏢狀箭頭表示用抗毒蛋白IC抗體免疫標(biāo)記的毒蛋白。cw，細(xì)胞壁；ob，油體；pb，蛋白體。圖11A-11D 毒蛋白2A在葉肉細(xì)胞液泡內(nèi)容物中的亞細(xì)胞免疫金定位。圖IlA 用免疫前血清進(jìn)行免疫標(biāo)記后的葉肉細(xì)胞。標(biāo)尺=2μπι。圖IlB 免疫前血清對照未顯示出液泡內(nèi)容物的免疫標(biāo)記(圖IlA中用框標(biāo)出的高放大率區(qū)域)。標(biāo)尺=0.2μπι。圖11C: 用抗毒蛋白IC抗體免疫標(biāo)記后的葉肉細(xì)胞。標(biāo)尺=2μπι。圖IlD 免疫定位至液泡內(nèi)容物的毒蛋白2Α(圖IlC中用框標(biāo)出的高放大率區(qū)域)。標(biāo)尺=0.2μπι。鏢狀箭頭表示用抗毒蛋白IC抗體免疫標(biāo)記的毒蛋白。C，葉綠體；cw，細(xì)胞壁；ν，液泡。圖12A-12D 毒蛋白2Α在葉管狀分子次生細(xì)胞壁(secondary cell walls)中的亞細(xì)胞免疫金定位。圖12A:用抗毒蛋白IC抗體免疫標(biāo)記后葉的切片。兩個(gè)相鄰的管狀分子，包括不成熟的管狀分子(I)和成熟的管狀分子(M)被葉肉細(xì)胞圍繞。標(biāo)尺=5μπι。圖 12Β 免疫前血清對照未顯示出管狀分子次生細(xì)胞壁中的免疫標(biāo)記。標(biāo)尺=0. 2 μ m。圖12C 免疫定位至不成熟管狀分子的次生細(xì)胞壁的毒蛋白2A(圖12A左下側(cè)用框標(biāo)出的高放大率區(qū)域)。標(biāo)尺=0.2 μ m。圖12D:免疫定位至成熟管狀分子的次生細(xì)胞壁的毒蛋白2A(圖 12A右上側(cè)用框標(biāo)出的高放大率區(qū)域)。標(biāo)尺=0.2 μ m。箭頭表示管狀分子壁上的坑區(qū)域。 鏢狀箭頭表示用抗毒蛋白IC抗體免疫標(biāo)記的毒蛋白。mc，葉肉細(xì)胞；pew，初生細(xì)胞壁；scw， 次生細(xì)胞壁；V，液泡。圖13A和13B 毒蛋白1和毒蛋白2A啟動(dòng)子的表征。圖13A 在用空載體pC1300 (左面)、Pubi:GFPTnos(中間)和PC1P3:GFP:Tnos(右面)基因轟擊后，GFP在麻瘋樹發(fā)育胚乳中的瞬時(shí)表達(dá)。GFP，熒光通道；Ph2，相差通道；疊加，GFP和Ph2通道的疊加。標(biāo)尺=10μπι。 圖13Β 在用空載體pC1300(左面)、P35s⑶S:TN。s(中間)和Pc2ap3⑶S:TN。s(右面)基因轟擊后，GUS活性在麻瘋樹葉組織中的瞬時(shí)表達(dá)。在用X-Gluc溶液染色后，顯示GUS活性的細(xì)胞為藍(lán)色(用鏢狀箭頭表示)。圖14 二元質(zhì)粒pANDA;35HKCl的T-DNA區(qū)域(未按比例繪制)。NPTII，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；HPT，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；35S pro.，35S啟動(dòng)子；毒蛋白1，毒蛋白1的部分序列；連接子，Gus連接子；T，胭脂氨酸合酶基因的終止子；RB，右邊界；LB，左邊界。圖15:毒蛋白基因表達(dá)敲減的Ttl轉(zhuǎn)基因麻瘋樹植物。顯示了二元載體 PANDA35HKC1轉(zhuǎn)化的8月齡Ttl轉(zhuǎn)基因植物，所述二元載體pANDA35HKCl攜帶設(shè)計(jì)用于毒蛋白基因的RNAi盒。圖16顯示出轉(zhuǎn)基因麻瘋樹植物的DNA印跡分析的結(jié)果。圖16 轉(zhuǎn)基因麻瘋樹植物的DNA印跡分析。DNA印跡用Gus連接子(上面)或Hpt (下面)探針探測。箭頭表示當(dāng)用限制性酶KpnI和SpeI消化轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA時(shí)，RNAi盒的位置。Gus連接子用的引物為Gus F和Gus R(表1)。M，分子標(biāo)記；Wt，野生型麻瘋樹植物；L3至L26，單獨(dú)的Ttl 轉(zhuǎn)基因麻瘋樹植物。圖17A至17B 來自RNAi盒的雙鏈RNA(dsRNA)和毒蛋白2A的表達(dá)。圖17A 毒蛋白1的dsRNA在新葉中的表達(dá)。毒蛋白1的dsRNA的轉(zhuǎn)錄物水平通過用于Gus連接子的實(shí)時(shí)PCR測定，且擴(kuò)增序列的相同性通過測序確認(rèn)。麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)部對照， 顯示出標(biāo)準(zhǔn)化為轉(zhuǎn)基因系17 (L17)的相對值。Gus連接子的引物為Gus RT Fl和Gus RT R1，麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因的引物為Jc actin F2和Jc actin Rl (表1)。Wt，野生型植物； L17至L46，單獨(dú)的Ttl植物。圖17B 毒蛋白2A在新葉中的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄物水平通過實(shí)時(shí)PCR 測定，且擴(kuò)增序列的相同性通過測序確認(rèn)。麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)部對照，顯示出標(biāo)準(zhǔn)化為用空載體PC1300轉(zhuǎn)化的對照轉(zhuǎn)基因植物的相對值。毒蛋白2A的引物為C2ASF和 C2ASR(表1)，麻瘋樹屬肌動(dòng)蛋白基因的引物為Jc actin F2和Jc actin Rl (表l)。Wt，野生型植物；L17至L46，單獨(dú)的Ttl植物。圖18顯示出毒蛋白2A在轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物新葉中的表達(dá)。圖18:毒蛋白2A 在轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物新葉中的表達(dá)。毒蛋白2A(用箭頭標(biāo)出)用抗毒蛋白1抗體檢測。 Wt，野生型植物；L17至L46為單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因植物。圖19A-19D 轉(zhuǎn)基因向T1代的遺傳。圖19A和19B 在含10mg/L潮霉素的半強(qiáng)度 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽和生長12天的野生型麻瘋樹幼苗的枝(A)和根(B)。圖19C和19D 在含 10mg/L潮霉素的半強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上發(fā)芽和生長12天的轉(zhuǎn)基因系L26的T1幼苗的枝(C) 和根(D)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白基因和組織特異性啟動(dòng)子的分離，以及毒蛋白缺陷型麻瘋樹屬植物的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A的分離。 本發(fā)明進(jìn)一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒蛋白2基因，更具體地涉及毒蛋白1和毒蛋白 2A基因的組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過使用RNAi技術(shù)抑制毒蛋白基因表達(dá)來生產(chǎn)毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物。因此，第一方面，本發(fā)明提供了三種麻瘋樹毒蛋白基因的序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。毒蛋白1的核苷酸序列如SEQID NO 1所示。毒蛋白1的編碼序列包括SEQ ID NO :1中474-1355位的核苷酸。毒蛋白1的蛋白序列如SEQ ID NO 2所示。如本文所示，毒蛋白1在發(fā)育的種子的胚乳中特異地表達(dá)。毒蛋白1位于胚乳的蛋白體。在第二個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。毒蛋白2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。毒蛋白2的編碼序列包括SEQ ID NO :3中439-1368位的核苷酸。毒蛋白 2的蛋白序列如SEQ ID N0:4所示。如本文所示，毒蛋白2在發(fā)育的種子或葉中不表達(dá)。在第三個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?A。毒蛋白2A的核苷酸序列如 SEQ ID NO 5所示。毒蛋白2A的編碼序列包括SEQ ID NO :5中475-1404位的核苷酸。毒蛋白2A的蛋白序列如SEQ ID N0:6所示。如本文所示，毒蛋白2A在葉中特異地表達(dá)。毒蛋白2A在葉肉細(xì)胞的液泡和葉管狀分子的次生細(xì)胞壁中被檢測到。第二方面，本發(fā)明提供了兩種麻瘋樹毒蛋白基因的組織特異性啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子源自毒蛋白1基因。毒蛋白1啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO 7 所示。啟動(dòng)子缺失研究表明觀88個(gè)堿基對的毒蛋白1啟動(dòng)子足以用于其在種子胚乳中的組織特異性表達(dá)。因此，毒蛋白1啟動(dòng)子為胚乳特異性啟動(dòng)子。此序列的片段也有如組織特異性啟動(dòng)子，即胚乳特異性啟動(dòng)子的活性。這類片段包括以下(a) SEQ ID NO :7中14888 位的核苷酸、(b)SEQ ID NO 7 中 1142-3181 位的核苷酸、(c) SEQ ID NO :7，其中 2944-3170 位的核苷酸被缺失、(d)SEQ ID NO 7中1142-3181位的核苷酸，其中2944-3170位的核苷酸被缺失、和(e)SEQ ID NO :7中2688-3181位的核苷酸，其中2944-3170位的核苷酸被缺失。毒蛋白1啟動(dòng)子或其片段可用于在轉(zhuǎn)基因植物的種子胚乳中特異地表達(dá)感興趣的下游 DNA0在一些實(shí)施方式中，胚乳特異性毒蛋白1啟動(dòng)子可用于在麻瘋樹種子的胚乳以及其它作物種子中表達(dá)感興趣的DNA，如靶基因，如編碼酶或蛋白的基因。在第二個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子源自毒蛋白2A基因。毒蛋白2A啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。啟動(dòng)子缺失研究表明1793個(gè)堿基對的毒蛋白2A啟動(dòng)子足以用于其在葉組織中的組織特異性表達(dá)。因此，毒蛋白2A啟動(dòng)子為葉特異性啟動(dòng)子。此序列的片段也有組織特異性啟動(dòng)子的活性。然而，當(dāng)將一些序列缺失時(shí)，特異性由葉特異的變?yōu)榉墙M織特異的。具有非組織特異性啟動(dòng)子的活性的此類片段包括以下(a)SEQ ID N0:8中 912-2087位的核苷酸、(b)SEQ ID NO 8中1-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失、(c)SEQ ID NO :8中912-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失、和 (d)SEQ ID NO 8中1751-2087位的核苷酸，其中1853-2076位的核苷酸被缺失。毒蛋白2A啟動(dòng)子可用于在轉(zhuǎn)基因植物的葉組織中特異地表達(dá)感興趣的下游DNA。 在一些實(shí)施方式中，葉特異性毒蛋白2A啟動(dòng)子可用于在麻瘋樹屬以及其它作物的葉或其它綠色組織中表達(dá)感興趣的DNA，如靶基因，如編碼酶或蛋白的基因。在其它實(shí)施方式中，毒蛋白2A啟動(dòng)子的非組織特異性片段可用于指導(dǎo)諸如酶或蛋白等感興趣的DNA在麻瘋樹屬以及其它作物種子中的非組織特異性表達(dá)。在第三個(gè)實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子源自毒蛋白2基因。毒蛋白2啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示。如本文所述，此啟動(dòng)子在胚乳或葉組織中不表達(dá)，但可通過昆蟲襲擊時(shí)茉莉酸(JA)的活化和/或防御反應(yīng)或葉老化期間乙烯的活化來活化和表達(dá)。本發(fā)明的啟動(dòng)子特別適用于制備包括麻瘋樹屬在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物，以包含感興趣的DNA。其它植物物種包括但不限于蓖麻、棕櫚油、椰子、花生、油菜籽、大豆、向日葵、木薯、 番茄、豆、棉花、黃瓜、卷心菜、大麥、燕麥、小麥、玉米和稻。在一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白1啟動(dòng)子或其片段可用于指導(dǎo)諸如感興趣的基因等感興趣的DNA在麻瘋樹屬種子或其它植物種子的胚乳中表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白2A啟動(dòng)子可用于指導(dǎo)諸如感興趣的基因等感興趣的DNA在麻瘋樹或其它植物物種的葉或其它綠色組織中表達(dá)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白2啟動(dòng)子可用于指導(dǎo)諸如感興趣的基因等感興趣的DNA在誘導(dǎo)性條件下表達(dá)，所述條件例如昆蟲襲擊時(shí)JA的活化和/或防御反應(yīng)或葉老化期間乙烯的活化。插入麻瘋樹屬植物或其它植物物種的DNA (感興趣的DNA)對轉(zhuǎn)化過程不重要。通常，被引入植物的DNA是構(gòu)建體的一部分。DNA可為感興趣的基因，如蛋白的編碼序列，或其可為能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列，如反義序列、有義抑制序列、轉(zhuǎn)錄后基因沉默序列(RNAi序列，如siRNA、shRNA或dsRNA)或微小RNA(miRNA)序列。構(gòu)建體通常包括與感興趣DNA的 5’端和/或感興趣DNA的3’端可操縱連接的調(diào)節(jié)區(qū)域。本文中也將包含全部這些元件的盒稱為表達(dá)盒。在表達(dá)盒構(gòu)建體中，表達(dá)盒可額外地包含5’前導(dǎo)序列(leader sequence) 0 調(diào)節(jié)區(qū)域(即啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域和翻譯終止區(qū)域)和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸與宿主細(xì)胞之間或彼此之間是天然/同源的。本文鑒定的啟動(dòng)子和植物特異性啟動(dòng)子特別適用于制備用于麻瘋樹屬轉(zhuǎn)化以及其它植物物種轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體。或者，調(diào)節(jié)區(qū)域和/或編碼信號(hào)錨的多核苷酸與宿主細(xì)胞之間或彼此之間是異源的。參見美國專利7，205，453以及美國專利申請公布2006/0218670、2006/0248616和2009/0100536，以及本文所引用文獻(xiàn)。在表達(dá)盒構(gòu)建體中，表達(dá)盒可額外地包含5’前導(dǎo)序列。這類前導(dǎo)序列可起到增強(qiáng)翻譯的作用。 翻譯前導(dǎo)物是本領(lǐng)域已知的，且包括國際公布WO 2008/094127和本文所引用文獻(xiàn)中描述的那些。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本文鑒定的啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子用在本發(fā)明的實(shí)施中?？苫谒杞Y(jié)果選擇啟動(dòng)子。也就是說，核酸可與用于在感興趣的特定宿主細(xì)胞或宿主組織中表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子組合。在諸如本文所述的啟動(dòng)子等啟動(dòng)子控制下的感興趣的DNA可為本文定義的任何 DNA，且可用于改變其所引入的植物物種的任何特性或性狀，所述植物物種包括作為優(yōu)選實(shí)施方式的麻瘋樹屬。在一個(gè)實(shí)施方式中，將感興趣的DNA引入植物以提高植物的性狀。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提高的農(nóng)藝學(xué)性狀可表征為提高的植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長和發(fā)育、 產(chǎn)率、營養(yǎng)提高、疾病或害蟲抗性、或環(huán)境或化學(xué)耐性。在一些方面，提高的性狀選自由以下提高的性狀組成的組提高的水利用率、提高的溫度耐性、提高的產(chǎn)率、提高的氮利用率、提高的種子蛋白、提高的種子油和提高的生物量。提高的產(chǎn)率包括在無脅迫條件下提高的產(chǎn)率，和在環(huán)境脅迫條件下提高的產(chǎn)率。脅迫條件包括，例如，干旱、背光、真菌性疾病、病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、昆蟲侵?jǐn)_、線蟲侵?jǐn)_、極端溫度暴露(冷或熱)、滲透脅迫、降低的氮營養(yǎng)利用率、降低的磷營養(yǎng)利用率和高植物密度。在一些實(shí)施方式中，感興趣的DNA可用于修改代謝途徑，如種子中的脂肪酸生物合成或脂類生物合成途徑，或修改麻瘋樹屬或其它植物物種中的病原菌抗性。通常，表達(dá)盒可另外包括用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可選擇的標(biāo)記基因。使用可選擇的標(biāo)記基因來選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。通常，植物可選擇的標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素抗性，適合的基因包括以下至少一組編碼抗生素大觀霉素的基因、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(SPt)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptll)基因、編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因?；蛘?， 植物可選擇的標(biāo)記基因?qū)⒕幋a除草劑抗性，如對磺酰脲類除草劑、草銨膦、草甘膦、銨、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4_ 二氯苯氧乙酸鹽Q，4-D)的抗性，包括編碼有此除草劑抗性的基因， 所述除草劑對谷氨酰胺合酶起抑制作用，如草胺膦或basta (如bar基因)。參見國際公布 WO 02/36782、美國專利 7，205，453 以及美國專利申請公布 2006/0218670,2006/0248616, 2007/0143880和20090100536，以及本文所引用的文獻(xiàn)。可選擇的標(biāo)記基因的此列表不意在限制?？墒褂萌魏慰蛇x擇的標(biāo)記基因?？蛇x擇的標(biāo)記基因葉也受待轉(zhuǎn)化的植物物種中可操縱啟動(dòng)子的控制。這類啟動(dòng)子包括國際公布W02008/094127和本文所引用文獻(xiàn)中所述的那些。適合時(shí)，可最佳化感興趣的DNA以提高在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)。也就是說，可使用植物優(yōu)選的密碼子來合成編碼序列以改進(jìn)表達(dá)。本領(lǐng)域中可獲得合成植物優(yōu)選的基因的方法。參見，如美國專利5, 380,831,5,436, 391和7，205，453，以及美國專利申請公布 2006/0218670 和 2006/0248616。在表達(dá)盒的制備中，可操作各種DNA片段，以為所述DNA片段提供正確的方向，以及在適合時(shí)提供正確的可讀框。因此，可使用適配子或連接子來連接DNA片段，或可包括其它操作來提供方便的限制性位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制性位點(diǎn)等。為此，可包括體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、再替換，如翻譯和顛換。一旦將核酸克隆入表達(dá)載體中，可使用常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟將其引入植物細(xì)胞。術(shù)語“植物細(xì)胞”意在包括源自以下植物的任何細(xì)胞，所述植物包括未分化的組織如愈傷組織和懸浮培養(yǎng)物、以及植物種子、花粉或植物胚。適用于轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織、原生質(zhì)體、胚軸、子葉、盾片、枝條尖、根、未成熟的胚、花粉和花粉囊?！稗D(zhuǎn)化”是指通過外部應(yīng)用來自不同基因型的另一種細(xì)胞的重組DNA，使其被吸收并整合進(jìn)入對象細(xì)胞的基因組，以直接修改細(xì)胞基因組。在此方式中，可獲得遺傳修飾的植物、植物細(xì)胞、植物組織、 種子等。包含本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化任何植物，特別是麻瘋樹屬植物。構(gòu)建體可通過各種常規(guī)技術(shù)引入所需植物宿主的基因組內(nèi)。用于轉(zhuǎn)化各種高等植物物種的技術(shù)是熟知的，且描述在技術(shù)和科技文獻(xiàn)中。轉(zhuǎn)化方法可根據(jù)轉(zhuǎn)化所針對的植物或植物細(xì)胞的類型，即單子葉或雙子葉來改變，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，DNA構(gòu)建體可使用諸如植物細(xì)胞原生質(zhì)體電穿孔和微注射等技術(shù)直接引入植物細(xì)胞的基因組DNA中，或 DNA構(gòu)建體可使用諸如DNA微粒轟擊等沖擊方法直接引入植物組織中?；蛘?，DNA構(gòu)建體可與適合的T-DNA旁側(cè)區(qū)域結(jié)合，并引入常規(guī)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主載體中。當(dāng)細(xì)胞被細(xì)菌感染時(shí)，根癌農(nóng)桿菌宿主的毒力功能將引導(dǎo)構(gòu)建體和相鄰的標(biāo)記插入植物細(xì)胞DNA中。因此，可應(yīng)用提供有效轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的任何方法。參見，例如美國專利 7，241，937,7, 273，966 和 7，291，765，和美國專利申請公布 2007/0231905 和 2008/0010704, 以及本文所引用的文獻(xiàn)。還參見國際公布的申請WO 2005/103271和W02008/094127以及本文所引用的文獻(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，將外植體組織與包括含感興趣的基因或核酸的DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌株共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化的組織可使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)來選擇。在另一實(shí)施方式中，可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，將胚胎發(fā)生液體懸浮培養(yǎng)物與包括含感興趣的基因或核酸的DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌株共培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化的組織可使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)來選擇。在另一實(shí)施方式中，DNA可使用諸如微粒轟擊等常規(guī)方法引入胚胎發(fā)生液體懸浮培養(yǎng)物的外植體組織或細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化的組織可使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)技術(shù)來選擇。 轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)基因植物可使用本文所述的方法來再生。在另一實(shí)施方式中，如2009年1月7 日遞交的國際專利申請PCT/SG2009/000015所述，麻瘋樹屬可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，此文獻(xiàn)在此援引加入。可培養(yǎng)通過任何以上轉(zhuǎn)化方法得到的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以再生為具有轉(zhuǎn)化的基因型和因此所希望的表型的整株植物，如轉(zhuǎn)基因植物?！稗D(zhuǎn)基因植物”為已引入外源DNA的植物。無論是有性或無性繁殖，“轉(zhuǎn)基因植物”均包括繼續(xù)含有外源DNA的全部子代、雜種和它們的雜交體。再生技術(shù)依賴于在組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中操作某些植物激素，通常依賴于已與所需核苷酸序列一起被引入的殺生物劑和/或除草劑標(biāo)記。參見，例如國際公布的申請 WO 2008/094127以及本文所引用的文獻(xiàn)。前述用于轉(zhuǎn)化的方法通常被用于生產(chǎn)表達(dá)盒被穩(wěn)定并入其中的轉(zhuǎn)基因變體。在表達(dá)盒被穩(wěn)定地并入轉(zhuǎn)基因植物中后，其可通過有性雜交來轉(zhuǎn)移至其它植物中。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因變體可隨后與另一種變體(未轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)化的)雜交，以產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因變體。或者，可使用植物育種領(lǐng)域熟知的傳統(tǒng)回交技術(shù)將遺傳性狀轉(zhuǎn)移入另一種棉花系中，所述遺傳性狀已使用前述轉(zhuǎn)化技術(shù)通過工程化進(jìn)入特定棉花系。例如，可使用回交方法將來自共有的，非原種變體的工程化性狀轉(zhuǎn)移入原種變體，或?qū)碜栽谄浠蚪M中包含外源基因的變體的工程化性狀轉(zhuǎn)移入不包含此基因的一種或多種變體。如本文所用，根據(jù)上下文， “雜交”是指簡單的X與Y雜交，或回交的方法。根據(jù)待雜交的物種，可使用大量標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任一種。一旦產(chǎn)生這種類型的轉(zhuǎn)基因植物，植物本身可根據(jù)常規(guī)方法來培育。當(dāng)然，轉(zhuǎn)基因種子可從轉(zhuǎn)基因植物中獲得。這些種子可隨后被植入土壤中，并使用常規(guī)方法培育以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。第三方面，本發(fā)明提供了毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物和毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物包括穩(wěn)定整合入其基因組中的核酸，其中所述核酸編碼靶向毒蛋白基因的雙鏈RNA(dsRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物包括穩(wěn)定整合入其基因組中的核酸，其中所述核酸編碼靶向毒蛋白基因的短干擾RNA(SiRNA)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物包括穩(wěn)定整合入其基因組中的核酸，其中所述核酸編碼靶向毒蛋白基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?A。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白1基因的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2基因的一部分。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸包括所述毒蛋白2A基因的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物通過轉(zhuǎn)化麻瘋樹屬植物組織生產(chǎn)。編碼dsRNA、siRNA 或shRNA的核酸通常被包括在構(gòu)建體中，如本文所述的構(gòu)建體。核酸處于啟動(dòng)子的可操縱的控制下。可使用的適合的啟動(dòng)子包括本文所述的那些。構(gòu)建體可進(jìn)一步包括其它調(diào)節(jié)序列，如本文所述的那些。例如，可制備包括這樣序列的構(gòu)建體，所述序列被轉(zhuǎn)錄為可自身退火的RNA，如具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA。在一些實(shí)施方式中，雙鏈RNA莖部分的一條鏈包括這樣的序列或其片段，所述序列與感興趣多肽的有義編碼序列相似或相同，且長度為約10個(gè)核苷酸至約 2，500個(gè)核苷酸。與有義編碼序列相似或相同的序列的長度可為10個(gè)核苷酸至500個(gè)核苷酸、15個(gè)核苷酸至300個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸至100個(gè)核苷酸或25個(gè)核苷酸至100個(gè)核苷酸。雙鏈RNA莖部分的另一條鏈包括這樣的序列或其片段，所述序列與感興趣多肽的編碼序列的反義鏈相似或相同，且可具有與有義序列對應(yīng)長度相比更短、相同或更長的長度。在一些情況中，雙鏈RNA莖部分的一條鏈包括這樣的序列或其片段，所述序列與編碼感興趣多肽的mRNA的3'或5'非翻譯區(qū)相似或相同，且雙鏈RNA莖部分的另一條鏈包括這樣的序列或其片段，所述序列與分別互補(bǔ)于編碼感興趣多肽的mRNA的3'或5'非翻譯區(qū)的序列相似或相同。在其它實(shí)施方式中，雙鏈RNA莖部分的一條鏈包括這樣的序列或其片段，所述序列與編碼感興趣多肽的前mRNA中的內(nèi)含子的序列相似或相同，且莖部分的另一條鏈包括這樣的序列或其片段，所述序列與互補(bǔ)于前mRNA中的內(nèi)含子序列的序列相似或相同。雙鏈RNA的環(huán)部分可為3個(gè)核苷酸至5，000個(gè)核苷酸，如3個(gè)核苷酸至25個(gè)核苷酸、15個(gè)核苷酸至1，000個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸至500個(gè)核苷酸或25個(gè)核苷酸至200個(gè)核苷酸。RNA的環(huán)部分可包括內(nèi)含子或其片段。雙鏈1 ^可具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在本文所述的一個(gè)實(shí)施方式中，制備這樣的構(gòu)建體，其包括組成型啟動(dòng)子，如CaMV 35S啟動(dòng)子、本文所述的其中一種毒蛋白基因的部分序列(有義方向)、連接子、相同毒蛋白基因的部分序列(反義方向)和終止子，如NOS終止子。在一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?基因，且毒蛋白1的部分序列包括862個(gè)核苷酸且如SEQ ID N0:53所示。在另一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍譏cDNA，且毒蛋白IcDNA的序列包括1161個(gè)核苷酸且如SEQ ID NO 54所示。在又一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?A cDNA，且毒蛋白2A cDNA的序列包括1176個(gè)核苷酸且如SEQ ID N0:55所示。在再一個(gè)實(shí)施方式中，毒蛋白基因?yàn)橥贫ǖ亩镜鞍?cDNA，且推定的毒蛋白2cDNA的序列包括1140個(gè)核苷酸且如SEQ ID N0:56所示。除了 SEQ ID NO :53-56所示的序列，也可以使用這些序列的部分序列。部分序列可包括50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、150個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、250個(gè)核苷酸、300個(gè)核苷酸、350個(gè)核苷酸、400個(gè)核苷酸、450個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、550個(gè)核苷酸、600個(gè)核苷酸、650個(gè)核苷酸、700個(gè)核苷酸、750個(gè)核苷酸、800個(gè)核苷酸、850個(gè)核苷酸或最多為少于全長序列中核苷酸數(shù)量的核苷酸。應(yīng)理解，部分序列可包括在所示例的核苷酸數(shù)量之間的任意數(shù)量的核苷酸，如60個(gè)核苷酸、175個(gè)核苷酸等。也應(yīng)理解，部分序列可包括以下范圍的核苷酸，所述范圍在所示例的編號(hào)或所示例的那些編號(hào)內(nèi)的任何編號(hào)與全長序列中的核苷酸數(shù)量之間，如 SEQ ID NO 53 的 50-100、50_800、100-800、175-862 等。siRNA也可指核苷酸的RNA雙鏈體，或在一些其它方面，其可指靶向諸如感興趣的基因等核酸的單個(gè)RNA分子(在一些實(shí)施方式中，此單個(gè)RNA分子可具有諸如環(huán)的二級結(jié)構(gòu)以形成shRNA)?！癛NA雙鏈體”是指通過RNA分子至少兩個(gè)區(qū)域之間的互補(bǔ)配對形成的結(jié)構(gòu)。因此，“RNA雙鏈體”可包括1、2、3或更多個(gè)RNA分子。siRNA “靶向”這樣的基因，其中siRNA雙鏈體部分的核苷酸序列與所靶向基因的核苷酸序列互補(bǔ)。因此，通過使用靶基因的序列，可常規(guī)地設(shè)計(jì)和制備任何siRNA。在一些實(shí)施方式中，siRNA雙鏈體的長度小于30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，siRNA雙鏈體的長度大于30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，雙鏈體的長度可為 40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、四、28、27、26、25、24、23、 22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個(gè)或更少個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，雙鏈體的長度為19-25個(gè)核苷酸。siRNA的RNA雙鏈體部分可為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一部分。一方面， 在本發(fā)明的siRNA中無發(fā)夾結(jié)構(gòu)。除了雙鏈體部分，發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可包含位于形成雙鏈體的兩個(gè)序列之間的環(huán)部分。環(huán)的長度可以改變。在一些實(shí)施方式中，環(huán)的長度為2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12或13或更多個(gè)核苷酸。發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可包含3'或5'突出部分。在一些實(shí)施方式中，突出部分為0、1、2、3、4或5個(gè)核苷酸長度的3'或5'突出部分。siRNA可由核酸序列編碼，且核酸序列也可包括啟動(dòng)子。核酸序列也可包括聚腺苷酸化信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，聚腺苷酸化信號(hào)為合成的最小聚腺苷酸化信號(hào)。siRNA可整體或部分地由合成的核苷酸、天然堿基或修改的堿基組成。靶向感興趣的毒蛋白基因的siRNA分子，如本文所述的毒蛋白1基因、毒蛋白2基因或毒蛋白2A基因可使用本領(lǐng)域熟知的算法來設(shè)計(jì)。對于RNAi技術(shù)的進(jìn)一步描述，參見例如美國專利5，034, 323 ；6, 326，527 ； 6，452，067 ；6，573，099 ；6，753，139 ；和 6，777，588。也參見國際專利公布 WO 97/01952、WO 98/36083、WO 98/53083、WO 99/3洸19 和 WO 01/75164 ；和美國專利公布 2003/0175965、 2003/0175783,2003/0180945,2004/0214330,2005/0244858,2005/0277610, 2007/0265220,2009/0215860,2009/0308041 和 2010/0058498。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因植物通過轉(zhuǎn)化麻瘋樹屬植物組織生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在另一實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化為諸如DNA微粒轟擊等沖擊方法。在另一實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化為諸如電穿孔和微注射等直接引入。在一個(gè)實(shí)施方式中，如本文所述進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在另一實(shí)施方式中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化如 2009年1月7日遞交的國際專利申請PCT/SG2009/000015所述來進(jìn)行，此文獻(xiàn)在此援引加入。如本文所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。如本文所述選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。如本文所述，轉(zhuǎn)基因植物從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。如本文所述，對穩(wěn)定并入RNAi構(gòu)建體和毒蛋白缺陷的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選。除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)。參見，例如 Maniatis et al. , 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning,2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning,3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ；Ausubel et al. ,1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates)； Glover,1985, DNA Cloning(IRL Press, Oxford) ；Russell,1984，Molecular biology of plants :a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y) ；Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York,1992) ；Guthrie and Fink, Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology (Academic Press, New York,1991) ；Harlow and Lane,1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York)； Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984) ；Transcription And Translation(B. D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984) ；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss,Inc. ,1987) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press, 1986) ；B. Perbal, APractical Guide To Molecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc. , N.Y.) ；Methods In Enzymology, Vols.154and 155 (Wu et al.eds. ), Immunochemical Methods In Cgll And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. , Academic Press, London,1987) ；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwel1, eds. ,1986)； Riott, Essential Immunology,6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988 ；Fire et al. , RNA Interference Technology :From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge,2005 ；Schepers, RNA Interference in Practice, ffiley-VCH, 2005 ；Engelke, RNA Interference (RNAi) :The Nuts & Bolts of siRNA Technology,DNA Press, 2003 ；Gott，RNA Interference,Editing, and Modification :Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology), Human Press,Totowa, NJ, 2004 ；Sohai1,Gene Silencing by RNA Interference :Technology and Application, CRC，2004。實(shí)施例本發(fā)明通過參考以下實(shí)施例來描述，這些實(shí)施例以說明的方式提供且不意在以任何方式限制本發(fā)明。使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或以下具體描述的技術(shù)。實(shí)施例1 材料和方法植物材料和生長條件除特別說明外，實(shí)驗(yàn)使用麻風(fēng)樹(印尼目錄(JC-MD))。植物在新加坡的試驗(yàn)田中生長，白天的溫度為32°C，夜晚溫度為^°C，平均相對濕度為85%， 且光周期為12-13小時(shí)。構(gòu)建體為了構(gòu)建使用GFP作為報(bào)告基因的表達(dá)載體，我們使用引物對GFPI^tIF 和GFPKpnIR(表1)從質(zhì)粒pSSZ41擴(kuò)增出包含GFP編碼序列的I3StI-KpnI片段(Kolesnik et al.，2004)。將PCR產(chǎn)物用限制性酶I3StI和KpnI消化，并隨后插入pCAMBIA1300載體以產(chǎn)生pCGFP。將毒蛋白1終止子克隆入pCGFP的KpnI和EcoRI位點(diǎn)之間的區(qū)域，以產(chǎn)生 pCGFPTl。將毒蛋白基因的啟動(dòng)子克隆入pCGFPT中HindIII和I^stI位點(diǎn)之間的區(qū)域，以產(chǎn)生最終的表達(dá)構(gòu)建體。將pC1305. 1中的CaMV35S啟動(dòng)子通過用HindIII和NcoI消化來去除，并將載體片段在末端補(bǔ)齊并自連接以產(chǎn)生PC1305. 1 (-35S)。將毒蛋白基因的啟動(dòng)子克隆入PC1305. 1 (-35S)中KpnI和I^stI之間的區(qū)域，以驅(qū)動(dòng)構(gòu)建體中的⑶S報(bào)告基因。用于毒蛋白基因的RNAi構(gòu)建體基于pANDA載體pANDA;35HK來制備(Miki and Shimamoto 2004)。 簡而言之，毒蛋白1的部分編碼序列使用引物Curcin 1T0P0-F and JCG-R來擴(kuò)增(表1)。 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列如SEQ ID N0:53所示。將PCR產(chǎn)物克隆入pENTR D-TOPO(Invitrogen), 并使用Gateway. 技術(shù)最終轉(zhuǎn)移入pANDA35HK載體以產(chǎn)生pANDA35HKCl (Hartley et al.， 2000)。表1:DNA寡核苷酸引物
引物名稱核苷酸序列(5'至3') (SEQ ID NO=)
GFPPstIFAACTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG (15)
GFPKpnIRGGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGT (16)
CantigenFlGCTGGTTCCACTCCAA.CTTTAAC (17)
CantigenF2CGGGATCCGGTACTTCCTATTTCTTTAACG (18)
CantigenRlTCAGACTTTGTATTTGACTGCATTC (19)
CantigenR2CCCAAGCTTAATTATCTAATGCCTGCACCCC (20)
Cant igenR3CCCAAGCTTCACTAGGATATTGGTATAGTTTTC (21)
GS P1GTCTGCTGGCTTTGAACTTT (22)
GSPlACACCCCTAAATCCACATCCT (23)
AAPGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG (24)
AUAPGGCCACGCGTCGACTAGTAC (25)
C2RTF2GGGCATCGGCTAGGGAAATA (26)
3'RACEF4TCTCATCAAACCAAAACTACAAA (27)
C2RTR2AGAGGTCTCCCCAGTTGTTC (28)
5‘RACEG4TGAATCTTGCTGCCTCTG (29)
CTRTF2GGGCATCGGCTAGGGAAATA (30)
3‘RACEFlGAGAGGATGTGGATTTAGG (31)
C2PF4CTTCAAGACACTAGTTCAAAAA (32)
ClCDSRTGATGAGAATGGACAAACTAT (33)
C2AFAR3CCATAACCAATGTATGATTTGGTA (34)
AD 2NGTCGASWGANAWGAA (35)
C2ACDSFCCCAAGTAAAAGGTCTCA (36)
C2TR2ECORICGGAATTCGTATTATTTGGATGGTAGAAAA.TT (37)
CF2GATATTTGTGTTTCTTCAT (38)
CR2TTTGTTGTCCTTTATTTATGCT (39)
CFTTTACTTCCCCGTTTGCTCA (40)
ClSRTATAGCATTAGCAACAATAATAAT (41)
C2ASRCATTAGCAACATGTTTGGACAAC (42)
Curcin 1 TOPO-F CACCCCATTACTTATGACGCTACTAC (43)
JCG-RGTAGGATTAAAGCCATGGCAGC (44)
Gus FGTCAGTGGCAGTGAAGGGCGAAC (45)
Gus RTTCCATACCTGTTCACCGACGAC (46)
Gus RT FlGTGGCAGTGAAGGGCGAAC (47)
Gus RT RlAGGTACGGTAGGAGTTGGC (48)
ClSFTGCAGTCAATTACAAAGTCTG (49)
C2ASFAGTAAAAGGTCTCATGGGAGTC (50)
Jc actin F2TAATGGTCCCTCTGGATGTG (51)
Jc actin RlAGAAAAGAAAAGAAAAAAGCAGC (52)麻風(fēng)樹屬轉(zhuǎn)化將5-7天齡幼苗的子葉切割為0. 5X0. 5cm2圓片，并與懸浮在農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基(液體MS鹽、B5維生素、1.5mg/L BA (6-芐基氨基嘌呤)、0. lmg/L ΝΑΑ(α-萘乙酸)、20mg/L AS (乙酰丁香酮)、0. 5g/L MES (2-(N-嗎啉代)乙磺酸)、30g/L蔗糖、IOg/ L葡萄糖，pH 5. 0-5. 2)中的農(nóng)桿菌(OD595 = 0. 25-0. 35)在22°C黑暗中共培養(yǎng)2_3天。之后，將共培養(yǎng)的子夜圓片用無菌水清洗若干次，隨后用300mg/L頭孢噻肟清洗一次。之后，將子葉圓片在愈傷組織形成培養(yǎng)基(MS鹽、B5維生素、1. 5mg/L 6_BA、0. 05mg/LNAA、3. 5mg/ L潮霉素、lOOmg/L頭孢噻肟、10mg/L檸檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、 0. 5g/L MgCl2、30g/L 蔗糖、2. 5g/L 植物凝膠(phytagel)，pH 5. 8-6. 0)中在 25°C黑暗下培養(yǎng)3周。將新生的潮霉素抗性愈傷組織在枝條再生培養(yǎng)基I (MS鹽、B5維生素、10mg/L檸檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、0. 5g/L MgCl2、30g/L蔗糖、1. 5mg/L 6-BA、
0.05mg/L IBA (吲哚-3- 丁酸)、2mg/L 腺嘌呤、3. 5mg/L 潮霉素、100mg/L 頭孢噻肟、2. 5g/L 植物凝膠，PH 5.8-6.0)中在25°C、16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗的光周期下繼代培養(yǎng)3周。在此期間，任何從愈傷組織再生出的枝條均需要繼代培養(yǎng)在枝條再生培養(yǎng)基II (MS鹽、B5維生素、10mg/L檸檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、30g/L蔗糖、pH 5. 8-6. O、
1.5mg/L 6-ΒΑ,Ο. 05mg/L IBA、0. 5mg/L GA (赤霉酸)、％ig/L 潮霉素、lOOmg/L 頭孢噻肟、7g/ L瓊脂)上。將未再生出枝條的愈傷組織繼代培養(yǎng)在用于進(jìn)一步再生枝條的枝條再生培養(yǎng)基III (MS鹽、B5維生素、10mg/L檸檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、 0. 5g/LMgCl2、30g/L 蔗糖、1. 5mg/L 6_ΒΑ、0· 05mg/L ΙΒΑ、3· 5mg/L 潮霉素、100mg/L 頭孢噻肟、2.5g/L植物凝膠，pH 5.8-6.0)上。將再生的枝條在枝條伸長培養(yǎng)基(MS鹽、B5維生素、 10mg/L檸檬酸、150mg/L谷氨酰胺、100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物、30g/L蔗糖、0. 3mg/L 6-BA, 0. lmg/L GA、7g/L瓊脂，pH 5. 8-6. 0)中在25°C ,16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗的光周期下繼代培養(yǎng)3周。使約2. 5cm長度的伸長的枝條在根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS鹽、B5維生素、0.07mg/l IBA、 0. 5g/L MES、30g/L蔗糖、2.2g/L植物凝膠，PH 5.8)中生根。通常，生根要經(jīng)過大于1個(gè)月的時(shí)間。BAC文庫構(gòu)建如Peterson et al (2000)所述，麻風(fēng)樹的BAC文庫使用BAC載體 PhdigoBAC-S來制備。簡而言之，根據(jù)此方案中所述的方法OPTION X，從新鮮葉中分離高分子量(HMW)DNA。將HMW DNA用HindIII消化，并選擇100-1501Λ大小的片段連接入 pIndigoBAC-5載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移入大腸桿菌DHlO感受態(tài)細(xì)胞，并在384孔板中分析轉(zhuǎn)化體。制備高密度雜交膜，并用于BAC克隆篩選。DNA印跡和RNA印跡分析DNA凝膠印跡分析根據(jù)前述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook et al. ,1989) ο如前所述，植物基因組DNA從葉中分離(Dellaporta et al. 1983)。在DNA 印跡分析的每條泳道中使用約2 μ g DNA。將用引物對CantigenFl和CantigenRl (表1)擴(kuò)增的毒蛋白1編碼序列用作BAC文庫篩選和DNA印跡分析的探針。通過Rediprime II隨機(jī)引物標(biāo)記系統(tǒng)，用[32P]_dCTP 標(biāo)記探針(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)根據(jù)生產(chǎn)商說明書，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)從不同組織中分離總RNA。將總RNA樣品用DNase I處理。 根據(jù)生產(chǎn)商說明書，使用SMART MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Clontech) Wlyg總RNA中合成第一鏈 cDNA。cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)和熱不對稱交錯(cuò)(TAIL)PCR 根據(jù)生產(chǎn)商說明書進(jìn)行 5，RACE 禾口 3，RACE(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 用于毒蛋白 15，RACE 的引物為引物對GSPl和AAP，以及引物對GSPlA和AUAP(表1)。用于毒蛋白13’ RACE的引物為引物對 C2RTF2和AUAP，以及引物對3，RACEF4和AUAP (表1)。用于毒蛋白2A 5，RACE的引物為引物對C2RTR2和AAP，以及引物對5，RACEG4和AUAP(表1)。用于毒蛋白2A 3，RACE的引物為引物對CTRTF2和AUAP，以及引物對3，RACEFl和AUAP (表1)。TAIL-PCR根據(jù)前述公布的步驟進(jìn)行(Liu et al. 1995)。用于TAIL-PCR的任意簡并(AD)引物為AD2 (表1)。實(shí)時(shí)RT-PCR 實(shí)時(shí)定量RT-PCR根據(jù)Chen et al ^)07)所述的方法進(jìn)行，并在 Bio-Rad iCycler iQ5實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行?？俁NA從麻瘋樹種子或發(fā)育時(shí)期的葉中提取。 總RNA樣品首先用DNase I處理，隨后根據(jù)生產(chǎn)商說明書使用iScript cDNA合成試劑盒 (Bio-Rad)逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。用于實(shí)時(shí)RT-PCR的寡聚引物根據(jù)每個(gè)基因的3，UTR來設(shè)計(jì)。為了確保定量PCR期間最大的特異性和效率，通過建立5或6個(gè)系列的10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)一步測試寡聚引物對應(yīng)答的線性。標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)混合物(15μ1)由2μ IcDNA 模板、Ix SsoFast EvaGreen Supermix以及500ηΜ正向和反向引物組成。PCR反應(yīng)由95°C 下持續(xù)30秒的初始變性步驟、隨后95°C下持續(xù)5秒共計(jì)40個(gè)循環(huán)和60°C下持續(xù)10秒組成。解鏈曲線反應(yīng)緊隨擴(kuò)增后，其持續(xù)加熱10秒，起始于65°C且以0.5°C增加。PCR產(chǎn)物特異性通過解鏈曲線分析和2%的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，以確保PCR反應(yīng)中沒有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增子。麻瘋樹肌動(dòng)蛋白基因用作內(nèi)標(biāo)，以對全部樣品的總RNA的相對量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對于每個(gè)所選基因，在96孔板上將PCR反應(yīng)一式三份(包括激動(dòng)蛋白對照和一式兩份的陰性對照(無cDNA模板的反應(yīng)樣品))準(zhǔn)備并進(jìn)行。對每個(gè)板重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，以確?？色@得相似的結(jié)果。微粒轟擊和GFP或⑶S的瞬時(shí)表達(dá)根據(jù)生產(chǎn)商說明書(Bio-Rad，CA, USA)，將 l.Oyg的金粒子用質(zhì)粒DNA包被。將來自6周齡發(fā)育時(shí)期的未成熟麻瘋樹種子的胚乳手工切割為約0. 5mm厚度的薄片。對于每次轟擊，使用PDS-1000/He系統(tǒng)(Bio-Rad)，以IlOOpsi 和15cm的飛行距離轟擊5至6片切片。將轟擊的樣品在培養(yǎng)皿中的濕過濾紙上，在22-25°C 下過夜培養(yǎng)。用熒光立體顯微鏡(Model SZX12,Olympus, Japan)篩選轟擊樣品中的GFP表達(dá)，并在 LSM510META 倒置共焦顯微鏡(Zeiss，Jena，Germany)上，在 488nm 下和 505_530nm 的通過頻帶下拍照。將PSSZ41中的玉米泛素啟動(dòng)子和其融合GFP基因(Kolesnik et al.， 2004)用作GFP分析的陽性對照。對于瞬時(shí)GUS表達(dá)，將大小為&2皿2的葉圓片用于微粒轟擊。⑶S活性根據(jù)前述方法檢測(Hiei et al，1994)。⑶S活性的X-Gluc染色通過 Nikon SMZ 1500立體顯微鏡觀察，并通過相連的Nikon DIGITAL SIGHT DS-SMC相機(jī)拍照。 將pC1305. 1中的CaMV35S啟動(dòng)子和其融合基因⑶S用作⑶S活性分析的陽性對照。空載體pC1300用作GFP和GUS瞬時(shí)表達(dá)分析的陰性對照。毒蛋白抗體的產(chǎn)生毒蛋白1的N和C末端編碼序列分別用引物對Cantigen Fl 和Cantigen R2 (用于毒蛋白1N)，以及引物對Cantigen F2和Cantigen R3(用于毒蛋白 1C)(表1)擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆入載體pQE3(KQiagen)以產(chǎn)生pQCFlR2和pQCF2R3。將構(gòu)建體隨后引入大腸桿菌BL21株以用于抗原表達(dá)?？乖鞍子枚鄠€(gè)組氨酸標(biāo)記的蛋白純化試劑盒(MACHEREY-NAGEL，Duren, Germany)來提取并純化。抗毒蛋白IN或抗毒蛋白IC 抗體根據(jù)兔多克隆抗體生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)步驟來產(chǎn)生。蛋白印跡分析使用來自植物不同組織的20μ g總蛋白進(jìn)行蛋白印跡分析。蛋白在12% SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，隨后印跡在硝酸纖維素膜上。根據(jù)產(chǎn)品手冊，毒蛋白通過抗毒蛋白IN或抗毒蛋白IC的抗體以及辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(Bio-Rad)來檢測。免疫金電鏡免疫金電鏡根據(jù)前述的步驟進(jìn)行(Chye et al.，1999)。將種子或葉切片在真空以及在0. 5%戊二醛和2%多聚甲醛的0. IM磷酸鹽緩沖液的溶液中固定4小時(shí)。將樣品用50mM磷酸鹽緩沖液清洗45分鐘。在梯度乙醇中脫水后，將樣品浸入LR白樹月旨(EMS, Hatfield, PA19440, USA)并在明膠膠囊中包埋。樣品使用Leica Ultracut切片機(jī)以SOnm切片，并置于R)rmVar包被的狹縫載網(wǎng)上。毒蛋白通過用抗毒蛋白的多克隆抗體以及隨后用15nm金綴合的羊抗兔IgG抗體來檢測(EMQ。兔的免疫前血清用于對照實(shí)驗(yàn)。 將載網(wǎng)上的樣品用2%乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛來進(jìn)一步染色。樣品用在120kv下運(yùn)行的透射電鏡(JE0L JEM-1230, JEO LTD, Tokyo 196-8558，Japan)觀察，并用數(shù)字顯微照相系統(tǒng)(Gatan Inc.，Pleasanton, CA94588, USA)拍照。實(shí)施例2 毒蛋白1和毒蛋白2的分離為了從麻瘋樹中分離毒蛋白基因，構(gòu)建麻瘋樹BAC文庫，并從此BAC文庫中鑒定出 7個(gè)BAC克隆以包含毒蛋白基因中的1至2個(gè)成員(圖1)。BAC克隆121E10攜帶兩個(gè)毒蛋白基因拷貝(圖1)。BAC 121E10通過鳥槍法測序，顯示BAC中的插入物為64，841bp。BAC 插入物中的兩個(gè)毒蛋白基因緊密連接并以串聯(lián)方式排列。一個(gè)毒蛋白基因編碼293個(gè)氨基酸的毒蛋白，而另一個(gè)編碼309個(gè)氨基酸的毒蛋白2樣蛋白。隨后將兩個(gè)毒蛋白基因分別命名為毒蛋白1 093個(gè)氨基酸)和毒蛋白2 (309個(gè)氨基酸)。毒蛋白1和毒蛋白2彼此相距8-1Λ，且毒蛋白1位于毒蛋白2的3’端。將剩余6個(gè)BAC克隆中的毒蛋白基因亞克隆并測序。BAC克隆127F22、147I10和176118中的毒蛋白基因包含毒蛋白1和毒蛋白2，而 213H9和221F16中的毒蛋白基因分別攜帶毒蛋白1。BAC克隆187G09也攜帶毒蛋白1，但其序列顯示出在毒蛋白1編碼序列下游_2463bp處有突變。我們進(jìn)行了 cDNA文庫篩選以及5，RACE和3，RACE RT-PCR，以分離毒蛋白1和毒蛋白2的全長cDNA克隆。將毒蛋白1對應(yīng)的cDNA從未成熟麻瘋樹種子的胚乳中分離(圖 2)。毒蛋白IcDNA由1388個(gè)核苷酸組成，不包括3，多腺苷序列(圖2)。其包含66bp的 5，非翻譯區(qū)(5，UTR)和213bp的3，UTR(圖2)。比較毒蛋白IcDNA和其基因組序列，在 5'UTR中鑒定出227bp的內(nèi)含子(圖2)。內(nèi)含子位于起始密碼子上游12bp處(圖2)。在 RIP基因典型的毒蛋白1基因的3’非翻譯區(qū)中有2個(gè)規(guī)范的多腺苷化信號(hào)(AATAAA) (Lin et al. ,2003 ；Chow et al.，1999)。第一個(gè)多腺苷化信號(hào)位于終止密碼子下游80bp處，而第二個(gè)多腺苷化信號(hào)位于多腺苷化位點(diǎn)上游20bp處(圖幻。雖然毒蛋白2的基因組序列與毒蛋白1的基因組序列顯示出高相同性，我們通過上述技術(shù)仍未從未成熟種子或葉組織中分離處毒蛋白2的cDNA。原因是毒蛋白2基因在正常發(fā)育條件下可能不表達(dá)。圖3顯示出用毒蛋白2的基因組序列、5’ UTR中的推定的內(nèi)含子和其推導(dǎo)的氨基酸殘基來注釋毒蛋白2。實(shí)施例3 毒蛋白2A的分離在我們嘗試從麻瘋樹中分離毒蛋白2cDNA期間，我們獲得了與毒蛋白2cDNA顯示出同源性的cDNA克隆。在cDNA和毒蛋白2之間的ORF區(qū)域有59個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。 cDNA克隆的開放閱讀框(ORF)編碼具有309個(gè)氨基酸殘基的毒蛋白，其與GenBank中的2 類毒蛋白(Acc.No. :ABZ04128)相同。我們將此毒蛋白基因命名為毒蛋白2A。毒蛋白2A的基因組克隆通過PCR分離。初始，毒蛋白2A的1216bp基因組區(qū)域通過PCR，使用源自毒蛋白2基因組克隆的引物C2PF4和源自毒蛋白2A cDNA的Cl⑶SR(表1)分離。此1216bp的片段包含881bp毒蛋白2A啟動(dòng)子。其次，對應(yīng)于此881bp區(qū)域上游處的毒蛋白2A啟動(dòng)子 5，調(diào)節(jié)區(qū)的982bp片段通過TAIL-PCR，使用引物對C2AFAR3和AD2(表1)分離。毒蛋白2A 的832bp 3，基因組區(qū)域使用源自毒蛋白2A cDNA的C2A⑶SF和基于毒蛋白2基因組序列的C2TR2EcoRI (表1)擴(kuò)增。我們共計(jì)獲得3774bp的毒蛋白2A的基因組克隆，包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游處得1793bp啟動(dòng)子和在終止密碼子下游處的758bp 3’調(diào)節(jié)區(qū)。毒蛋白2A的基因結(jié)構(gòu)與毒蛋白1的那些基因結(jié)構(gòu)類似。圖4顯示出用毒蛋白2A的基因組序列、5’ UTR 中的內(nèi)含子和其推導(dǎo)的氨基酸殘基來注釋毒蛋白2A。至此，我們已從麻瘋樹中分離出3種毒蛋白基因。之前，我們從麻瘋樹BAC文庫中獲得了 7個(gè)BAC克隆。然而，DNA測序表明7個(gè)BAC克隆均不包含毒蛋白2A。BAC克隆 121E10、127F22、147I10和176118攜帶毒蛋白1和毒蛋白2，BAC克隆187G09包含毒蛋白1， 且BAC克隆213H9和221F16包含毒蛋白2。為了進(jìn)一步確認(rèn)毒蛋白2A在麻瘋樹基因組中的存在，我們設(shè)計(jì)了一對通用引物CF2和CR2(表1)，以從基因組DNA中擴(kuò)增3種毒蛋白基因，以及從BAC 121E10中擴(kuò)增毒蛋白1和毒蛋白2。將PCR產(chǎn)物用Sau3AI消化并在2%瓊脂糖凝膠上分離。毒蛋白1和毒蛋白2均產(chǎn)生3個(gè)片段(對于毒蛋白1為l%bp、M3bp和 582bp ；對于毒蛋白2為195bp、243bp和580bp)，然而毒蛋白2A產(chǎn)生2個(gè)片段(243bp and 775bp)，這是因?yàn)樵诖嘶虻木幋a序列中僅存在一個(gè)Sau3AI位點(diǎn)(圖4)。如圖5所示，從 BAC 121E10擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在用Sau3AI消化后產(chǎn)生3條帶(582bp和580bp片段無法在 1.2%瓊脂糖凝膠上分離)，而來自麻瘋樹基因組的產(chǎn)物具有4條帶，其中包括來自毒蛋白 2A的另外的775bp帶。此結(jié)果說明麻瘋樹基因組中存在毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A。實(shí)施例4:毒蛋白毒蛋白已通過與ABZ04U8相同的毒蛋白2A鑒定。總共有7種不同類型的毒蛋白 (圖6)。毒蛋白AAL58089的最初42個(gè)氨基酸殘基編碼信號(hào)肽，此信號(hào)肽在成熟蛋白中被切割(Lin et al.，2003a)。此N末端的42個(gè)氨基酸信號(hào)肽在全部毒蛋白中是保守的(圖 6)。在這些毒蛋白中，本研究中鑒定的毒蛋白1與AAL58089更接近，且二者均屬于具有四3 個(gè)氨基酸的1類毒蛋白(圖7)。毒蛋白2A(ABZ04128)，AAR083395和ABW17545屬于具有 309個(gè)氨基酸的2類毒蛋白。這3種2類毒蛋白在進(jìn)化上彼此密切相關(guān)(圖7)。有趣地， 毒蛋白2比2類毒蛋白更接近于1類毒蛋白，如毒蛋白1和AAL58089(圖7)。實(shí)施例5 麻瘋樹中毒蛋白1和毒蛋白2A的表達(dá)之前的RT-PCR分析表明毒蛋白2在正常發(fā)育條件下在麻瘋樹種子和葉中不表達(dá)。 我們隨后使用共同的正向引物CF和兩個(gè)特異反向引物中的任一種(對于毒蛋白1為C1SR， 對于毒蛋白2A為C2ASR)(表1)，通過RT-PCR在2個(gè)組織中確定了毒蛋白1或毒蛋白2A的表達(dá)。引物CF覆蓋了毒蛋白1或毒蛋白2A的外顯子1和外顯子2之間的剪接連接區(qū)域。 如圖8A所示，毒蛋白1轉(zhuǎn)錄物在胚乳中檢測到。相反，毒蛋白2A轉(zhuǎn)錄物僅存在于葉中。我們進(jìn)一步確定毒蛋白1在發(fā)育種子的胚乳(圖8B)以及不同發(fā)育時(shí)期或受昆蟲侵?jǐn)_的葉 (圖8C)中臨時(shí)表達(dá)。在授粉后第6周(WAP)檢測到高水平的毒蛋白1轉(zhuǎn)錄物(圖8B)。在 2、4和6WAP時(shí)未檢測到或檢測到極低水平的毒蛋白1轉(zhuǎn)錄物(圖8B)。毒蛋白2A轉(zhuǎn)錄物僅在新葉(YL)中檢測到，而未在完全展開的葉(FL)、老葉(OL)和受粉蚧感染的葉中檢測到 (圖 8C)。實(shí)施例6 檢測麻瘋樹中的毒蛋白制備抗毒蛋白IC末端區(qū)域的多克隆抗體。蛋白印跡分析表明毒蛋白1僅在胚乳中檢測到，而毒蛋白2A僅在葉中檢測到(圖9)。檢測到的毒蛋白1應(yīng)為分子量約^kDa(MW =27. 8kD)的成熟毒蛋白1(圖9) (Lin et al.，2003a，2003b)。然而，檢測到的毒蛋白2A具有約34至35kDa的分子量，且它們似乎為完整的毒蛋白2A或毒蛋白2A的前體(MW = 34.9kD)(圖9)。應(yīng)提及的是，通過抗毒蛋白1抗體檢測出2種未知的蛋白。一種蛋白具有約39kDa的分子量大小，且在葉、愈傷組織和種子中檢測到，但根中未檢測到(圖9)。另一種蛋白具有16kDa的分子量大小，且在種子中檢測到(圖9)。實(shí)施例7 毒蛋白1和毒蛋白2A的亞細(xì)胞定位毒蛋白的亞細(xì)胞定位通過免疫金電鏡確定。因?yàn)槎镜鞍?僅在發(fā)育后期的胚乳中表達(dá)，我們采集了 6周齡的胚乳組織以用于毒蛋白1的亞細(xì)胞免疫金定位分析。油體和蛋白體是6周齡的胚乳細(xì)胞中的兩種主要細(xì)胞器(圖10A)。在此時(shí)期的胚乳細(xì)胞內(nèi)也觀察到少數(shù)具有淀粉體的質(zhì)體(圖10A)。通過免疫金電鏡中的金粒子表明毒蛋白1僅定位于蛋白體(圖10C)。胚乳細(xì)胞之間的細(xì)胞壁為初生細(xì)胞壁，在此初生細(xì)胞壁中未檢測到毒蛋白 1或僅檢測到背景標(biāo)記(圖10D)。當(dāng)使用免疫前抗體對照時(shí)，未檢測到蛋白體的免疫標(biāo)記 (圖10B)。由于抗毒蛋白1抗體也識(shí)別麻瘋樹種子中的16kDa非特異性蛋白(圖9)，所以在此研究中由免疫金電鏡檢測到得信號(hào)應(yīng)包括此非特異性識(shí)別。雖然抗毒蛋白1抗體識(shí)別來自麻瘋樹葉的毒蛋白2A和39kDa非特異性蛋白(圖 9)，但將其用于通過免疫金電鏡分析來檢測兩種蛋白在麻瘋樹葉中的亞細(xì)胞定位。免疫金電鏡分析表明金粒子免疫定位于葉肉細(xì)胞的液泡內(nèi)容物(圖11D)和葉管狀分子的次生細(xì)胞壁中(圖12C和12D)。毒蛋白2A和/或39kDa非特異性蛋白在葉管狀分子的次生細(xì)胞壁中的定位于未成熟的管狀分子中，在此未成熟的管狀分子中細(xì)胞經(jīng)歷了程序性細(xì)胞死亡 (圖12A和12C)。在對照實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)使用免疫前血清時(shí)，在葉肉細(xì)胞的液泡內(nèi)容物(圖IlA 和11B)或葉管狀分子的次生細(xì)胞壁(圖12B)中未檢測到免疫標(biāo)記信號(hào)或僅檢測到背景信號(hào)。實(shí)施例8 毒蛋白1和毒蛋白2A啟動(dòng)子的表征毒蛋白1在發(fā)育晚期的胚乳中特異地表達(dá)。我們對毒蛋白1啟動(dòng)子中的植物順式作用調(diào)節(jié) DNA 元件進(jìn)行了 PLACE 分析(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html)。鑒定出參與胚乳特異性或儲(chǔ)存蛋白基因表達(dá)的DNA元件。在_1388bp位鑒定出被稱為"RY重復(fù)(CATGCAY)"或"豆球蛋白盒"的DNA元件(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被指定為+1位)。 豆球蛋白盒發(fā)現(xiàn)于諸如大豆(Glycine max)等豆類的種子儲(chǔ)存蛋白基因中(Fujiwara and Beachy，1994)。在_15;34bp處鑒定出被稱為AACA元件的另一種DNA元件。AACA元件的核心發(fā)現(xiàn)于水稻(Oryza sativa)谷蛋白基因中，并參與控制胚乳特異性表達(dá)(Wu et al., 2000)。在AACA元件的上游，有若干E盒元件位于_2649bp至_2273bp處。位于_2649bp 的其中一個(gè)E盒也發(fā)現(xiàn)于油菜籽(Brassica napus)的napA儲(chǔ)存蛋白基因中(Stalberg et al.，1996)。包含全部這些順式元件(C1P3和C1P4)的毒蛋白1啟動(dòng)子足以驅(qū)動(dòng)胚乳特異性基因表達(dá)(表2，圖13A)。E盒元件(C1P2)或E盒元件、豆球蛋白盒和AACA元件O^lPl) 的缺失減弱或消除了胚乳特異性基因表達(dá)(表幻。在葉組織中未檢測到毒蛋白1啟動(dòng)子的活性(表2)。表2 毒蛋白基因啟動(dòng)子的表征
權(quán)利要求
1.在植物中具有啟動(dòng)子活性的分離的核酸，其選自以下一組(a)包含SEQID NO :7中1至3181位核苷酸的核酸；(b)包含SEQID NO :7中1至觀88位核苷酸的核酸；(c)包含SEQID NO 7中1142至3181位核苷酸的核酸；(d)包含SEQID NO :7中1至3181位核苷酸的核酸，其中四44至3170位核苷酸被缺失；(e)包含SEQID NO 7中1142至3181位核苷酸的核酸，其中四44至3170位核苷酸被缺失；(f)包含SEQID NO 7中沈88至3181位核苷酸的核酸，其中四44至3170位核苷酸被缺失；(g)包含SEQID NO :8中1至2087位核苷酸的核酸；(h)包含SEQID NO 8中912至2087位核苷酸的核酸；(i)包含SEQID NO :8中1至2087位核苷酸的核酸，其中1853至2076位核苷酸被缺失；(j)包含SEQ ID NO 8中912至2087位核苷酸的核酸，其中1853至2076位核苷酸被缺失；(k)包含SEQ ID NO 8中1751至2087位核苷酸的核酸，其中1853至2076位核苷酸被缺失；和(1)包含SEQ ID NO :9中1至3465位核苷酸的核酸。
2.核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1的具有啟動(dòng)子活性的核酸，所述核酸與編碼感興趣DNA 的第二核酸可操縱連接。
3.轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞在其基因組內(nèi)包含權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物選自以下一組麻瘋樹屬物種、蓖麻、 棕櫚油、椰子、花生、油菜籽、大豆、向日葵、木薯、番茄、豆、棉花、黃瓜、卷心菜、大麥、燕麥、 小麥、玉米和稻。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述麻瘋樹屬物種為麻瘋樹(Jatropha curcas)0
6.轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組內(nèi)包含權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自以下一組麻瘋樹屬物種、蓖麻、棕櫚油、椰子、花生、油菜籽、大豆、向日葵、木薯、番茄、豆、棉花、黃瓜、卷心菜、大麥、燕麥、小麥、 玉米和稻。
8.權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述麻瘋樹屬物種為麻瘋樹。
9.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述植物選自以下一組麻瘋樹屬物種、蓖麻、棕櫚油、椰子、花生、油菜籽、大豆、向日葵、木薯、番茄、豆、棉花、黃瓜、卷心菜、大麥、燕麥、小麥、玉米和稻。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述麻瘋樹屬物種為麻瘋樹。
12.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用權(quán)利要求2的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞，和從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述植物選自以下一組麻瘋樹屬物種、蓖麻、棕櫚油、椰子、花生、油菜籽、大豆、向日葵、木薯、番茄、豆、棉花、黃瓜、卷心菜、大麥、燕麥、小麥、玉米和稻。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述麻瘋樹屬物種為麻瘋樹。
15.核酸構(gòu)建體，包含與編碼雙鏈RNA(dsRNA)分子的核酸可操縱連接的啟動(dòng)子，所述雙鏈RNA分子靶向毒蛋白基因且能夠通過RNAi降低麻瘋樹屬植物中毒蛋白基因的表達(dá)，其中所述毒蛋白基因選自由毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A組成的組中。
16.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。
17.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?。
18.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述毒蛋白基因?yàn)槎镜鞍?A。
19.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述dsRNA分子為siRNA分子。
20.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中所述dsRNA分子為shRNA分子。
21.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述麻瘋樹屬植物為麻瘋樹。
23.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物的方法，包括用權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物的細(xì)胞，并從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述核酸構(gòu)建體穩(wěn)定地整合入所述轉(zhuǎn)基因植物的基因組內(nèi)，且其中所述轉(zhuǎn)基因植物是毒蛋白型的。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述麻瘋樹屬植物為麻瘋樹。
25.轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞在其基因組內(nèi)包含權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體。
26.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述麻瘋樹屬植物為麻瘋樹。
27.轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物，其中所述轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物在其基因組內(nèi)包含權(quán)利要求 2的核酸構(gòu)建體，且所述轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物是毒蛋白型的。
28.權(quán)利要求27的轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物，其中所述麻瘋樹屬植物為麻瘋樹。
全文摘要
本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白基因(Jatropha curcas curcin genes)和組織特異性啟動(dòng)子的分離，以及毒蛋白缺陷型麻瘋樹屬植物的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明涉及麻瘋樹毒蛋白1、毒蛋白2和毒蛋白2A的分離。本發(fā)明進(jìn)一步涉及毒蛋白1、毒蛋白2A和毒蛋白2基因，更具體地涉及毒蛋白1和毒蛋白2A基因的組織特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過使用RNAi技術(shù)抑制毒蛋白基因表達(dá)來生產(chǎn)毒蛋白缺陷型轉(zhuǎn)基因麻瘋樹屬植物。
文檔編號(hào)A01H1/00GK102459606SQ201080034727
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者C·X·邱, H·Z·毛, L·F·吳, Z·C·尹 申請人:淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司