專利名稱：四倍體半滑舌鰨魚苗高效誘導方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水產遺傳育種技術領域，具體涉及一種四倍體半滑舌鰨魚苗高效誘導 方法，即采用生物技術方法誘導半滑舌鰨四倍體。
背景技術：
半滑舌鰨(Cynoglossussemiliaevis)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科 (Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus)，俗名鰨米、龍利、舌頭魚等，是我國特有的名貴經 濟海水魚類。由于其味道鮮美、肉質細嫩、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者歡迎，其市場價值極 高。半滑舌鰨養(yǎng)殖已在我國沿海地區(qū)普遍開展起來，其養(yǎng)殖業(yè)年產值達15-20億元人民幣。 但是，由于半滑舌鰨雌雄大小差異懸殊，雄性個體生長速度緩慢降低了養(yǎng)殖產量，大規(guī)格雌 魚性腺發(fā)育過大，腹部凸起明顯，影響商品魚質量和美觀，從而嚴重影響了漁民養(yǎng)殖的積極 性以及半滑舌鰨養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展。三倍體魚因染色體組成不平衡，性腺不能發(fā)育成熟，避免 了雌魚腹部凸起的問題，因而較二倍體魚生長更快、商品價值更高，更受消費者歡迎。因此， 采用現(xiàn)代生物技術手段，研究半滑舌鰨多倍體誘導技術，研制出四倍體魚，然后與二倍體魚 交配大量生產不育的三倍體魚，可以達到抑制性腺發(fā)育，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于生 長，克服性腺發(fā)育時期的生長停滯和魚肉質量下降等諸多問題，這對于縮短半滑舌鰨養(yǎng)殖 周期，提高養(yǎng)殖產量和經濟效益，推動半滑舌鰨養(yǎng)殖產業(yè)的發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實意義和重 大的應用價值。 鑒于魚類多倍體誘導技術在遺傳育種、漁業(yè)生產、水環(huán)境保護和水生生物遺傳多 樣性保護上的重要意義和應用價值，國際上也非常重視魚類等水產養(yǎng)殖動物不育技術的研 究。而制作魚類不育的主要途徑是生產三倍體。因為三倍體魚類具有控制過度繁殖、抑制 性腺發(fā)育、促進生長以及提高魚肉品質等優(yōu)點，因而受到普遍的重視。魚類多倍體的絕大多 數研究工作是在淡水魚類上開展的。迄今已先后獲得了草魚、斑點叉尾鮰、羅非魚、虹鱒，銀 大馬哈魚、大鱗大馬哈魚、大西洋鮭、白鰱和鯉等魚類三倍體；另外，在英國和日本，三倍體 虹鱒也進入了商業(yè)化養(yǎng)殖。除虹鱒外，日本還開展了誘導三倍體香魚的研究與開發(fā)，發(fā)現(xiàn)三 倍體香魚的生長速率和抗寒能力都明顯優(yōu)于二倍體香魚，很受消費者和養(yǎng)殖家的歡迎，具 有很大的商業(yè)價值和開發(fā)潛力。不過，上述研究都是采用冷休克方法通過抑制第二極體排 出使染色體加倍，直接誘導三倍體。由于三倍體誘導率較低，生產的三倍體魚苗數量有限， 達不到商業(yè)化生產的目的，因此，直接誘導三倍體的方法難以達到大規(guī)模產業(yè)化的要求。而 通過誘導四倍體，然后與二倍體交配，即可大量生產不育的三倍體魚苗，這一點在半滑舌鰨 上顯得格外重要。不過，迄今為止，有關半滑舌鰨四倍體魚苗的批量化誘導，通過四倍體和 二倍體交配大量生產三倍體不育魚苗等，國內外尚未見報道。特別是在半滑舌鰨卵受精后 多長時間進行靜水壓處理、采用多大的壓力、處理多長時間才能獲得四倍體魚苗等關鍵技 術上一直以來都沒有得到突破。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種四倍體半滑舌鰨魚苗高效誘導方法，即通過抑制半滑舌 鰨受精卵第一次卵裂，使染色體加倍大量誘導產生四倍體魚苗。本發(fā)明建立了采用靜水壓 誘導半滑舌鰨四倍體的技術方法，突破了長期以來半滑舌鰨四倍體育種中存在的技術難 題，從而填補了半滑舌鰨四倍體誘導的空白。本發(fā)明內容包括二個方面(一)四倍體半滑舌鰨魚苗的誘導；(二)四倍體半滑 舌鰨魚苗的鑒定。(一 )四倍體半滑舌鰨魚苗的誘導步驟如下1)半滑舌鰨精、卵采集與授精選擇性成熟的半滑舌鰨親魚，將卵采入干燥的燒杯中，將采集的魚卵置于 19-23°C保存；采集新鮮半滑舌鰨精液，將采集的精液加入魚卵中，精液和魚卵的體積比為 1 100-1000，輕輕搖動混勻后，加入2倍于魚卵體積的溫度為19-23°C的海水完成受精過 程，授精后將卵放在19-23°C海水中孵化；2)染色體加倍操作在授精后19-28min內，將受精卵置于靜水壓機的水壓缸中，在36-44ΜΙ^靜水壓下 進行壓力休克處理，休克處理時間為3. 5-6min，休克處理完畢后將受精卵移入19_23°C的 海水中培養(yǎng)孵化；其中染色體加倍起始時間的確定在授精后19. 0,21. 5，23. 5，25. 5和28. 0分鐘的不同時間，將受精卵置于日本生產 的型號為陽06靜水壓機的水壓缸中，在36-44MPa靜水壓下進行壓力休克處理，休克處理時 間為3. 5-6min，休克處理完畢后將受精卵移入19_23°C的海水中培養(yǎng)孵化；在原腸中期計 算受精率，在魚苗孵化出膜后，計算魚苗的孵化率和四倍體率。根據各組魚苗的孵化率和四 倍體比例，確定了半滑舌鰨四倍體魚苗誘導的有效起始時間為授精后21. 5-25. 5min。靜水壓誘導半滑舌鰨四倍體休克壓力和處理時間的確定確定靜水壓休克起始時間后，設定靜水壓壓力梯度為36，38，40，42和44MPa，持續(xù) 處理3. 5-4. 5分鐘，休克處理完畢后將卵移入23-24°C海水中培養(yǎng)。在原腸中期計算受精 率，在魚苗孵化出膜后，計算四倍體魚苗的孵化率，實驗結果表面，受精卵在38，40和42MPa 壓力都能獲得一定比例的四倍體魚苗，而在靜水壓壓力40和42MPa時誘導四倍體魚苗的比 例最高，因此確定半滑舌鰨四倍體誘導適宜的靜水壓壓力為40-42MPa。最后根據上兩個實驗結果篩選靜水壓處理持續(xù)時間，將梯度范圍設在4-6 分鐘，進行靜水壓休克處理。計數后代中四倍體產生情況，實驗結果表明，在授精后 21. 5-25. 5min,將半滑舌鰨受精卵在40MPa壓力下休克處理4-5. 5分鐘，魚苗都能孵化出 膜。而在休克處理4. 5-5. 5分鐘時，四倍體魚苗的比例最高。因此確定半滑舌鰨四倍體誘 導適宜的靜水壓處理時間為4. 5-5. 5分鐘。( 二 )四倍體半滑舌鰨魚苗的鑒定1)用倍性測定儀鑒定半滑舌鰨四倍體魚苗采用PARTEC公司的倍性測定儀和一步法染色試劑，測量四倍體魚苗DNA含量，用 正常二倍體魚苗作對照。如果某條魚苗的細胞DNA含量為二倍體對照魚苗細胞DNA含量的 二倍左右，則表明這尾魚為四倍體。
2)染色體分析鑒定半滑舌鰨四倍體魚苗采集四倍體誘導魚苗，按照常規(guī)方法進行染色體分析，計數染色體數量，半滑舌鰨 二倍體魚苗的染色體數為42條，如果某條魚苗的染色體數量為84條左右，則證明這條魚為 四倍體魚苗。本發(fā)明建立了能有效誘導半滑舌鰨受精卵染色體加倍產生四倍體魚苗的技術方 法；首次確定了抑制半滑舌鰨卵子第一次卵裂的技術參數。和以往的多倍體誘導方法相比 較，本發(fā)明建立的四倍體魚苗誘導方法可以大量誘導四倍體魚苗。本發(fā)明的方法操作簡單、 實用性強、易行、安全可靠；四倍體魚苗的誘導效率較高。本方法誘導出的四倍體魚苗誘導 率高、倍性整齊、誘導率穩(wěn)定，因此，本方法非常有效和可靠；為半滑舌鰨性別控制和多倍體 育種開辟了新的技術途徑。


圖1 二倍體魚苗細胞DNA含量。圖2 四倍體魚苗細胞DNA含量。圖3 正常二倍體魚苗染色體分裂相。圖4 本發(fā)明的四倍體魚苗染色體分裂相。
具體實施例方式本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術手段，建立了半滑舌鰨四倍體誘導技術、研制出四倍體魚苗。采用同源精子與半滑舌鰨卵子受精，在授精后一定時間，對受精卵進行靜水壓休 克處理，抑制第一次卵裂，使染色體加倍，可以成功誘導半滑舌鰨四倍體魚苗的產生。建立 半滑舌鰨四倍體魚苗高效誘導技術，對于半滑舌鰨性別控制、不育三倍體苗種生產，進行不 育苗種養(yǎng)殖，提高這半滑舌鰨的養(yǎng)殖產量、產品質量和經濟效益，具有重要的現(xiàn)實意義和巨 大的推廣應用潛力。下面對本發(fā)明的技術內容進行詳細說明本發(fā)明其技術內容包括二個方面一、半滑舌鰨四倍體魚苗的誘導；二、半滑舌鰨 四倍體魚苗的鑒定。一、半滑舌鰨四倍體魚苗的誘導1)半滑舌鰨精、卵采集與授精選擇性成熟的半滑舌鰨親魚，或采用人工催產法誘導雌魚排卵，在人工催產 后30-38小時內，人工擠壓雌魚腹部采卵，將卵采入干燥的燒杯中，將采集的魚卵置于 19-23°C保存；通過擠壓性成熟雄魚腹部采集新鮮半滑舌鰨精液，將采集的精液加入未受精 卵中，干法授精，輕輕搖動混勻，精液和卵的體積比為500 μ L :50-100ml，然后再加入2倍于 卵量體積的溫度為19-23°C的海水100或200ml完成受精過程。受精在IOOOml燒杯中進 行。受精后將卵放在19-23°C海水中孵化；2)染色體加倍操作首先是染色體加倍起始時間的確定在授精后19. 5，21. 5，23. 5，25. 5和27. 5分鐘的不同時間，將授精卵置于日本生產 的型號為陽06靜水壓機的水壓缸中，在38-40MPa靜水壓下進行壓力休克處理，休克處理時間為3. 5-4. 5min，休克處理完畢后將卵移入19_23°C海水中培養(yǎng)。在原腸中期計算受精率， 在魚苗孵化出膜后，計算四倍體魚苗的孵化率。在受精后19. 5-27. 5分鐘進行靜水壓處理， 各組均有50-68%的四倍體魚苗產生，其中在21. 5-25. 5分鐘時，魚苗孵化率最高，且獲得 四倍體魚苗的比例也最高，達到60-68%，因此確定半滑舌鰨四倍體魚苗誘導的有效起始時 間為授精后21. 5-25. 5min (見表1)。表1 靜水壓誘導半滑舌鰨四倍體起始時間的確定(海水溫度為23°C左右，靜水壓 力40MPa，休克處理時間4. 5min)
授精后時間(min)孵化率(IMF后算受精卵，％ )四倍體率(％ )19. 54. 4±1. 051. 3±4. 721. 516. 7±1. 268. 3±4. 423. 510. 8±1. 761. 7±6. 025. 59. 4±0. 960. 7±5. 227. 53. 6±0. 552. 0±4. 6對照組56. 1±7. 20. 0±0. 0 靜水壓誘導半滑舌鰨四倍體休克壓力和處理時間的確定確定靜水壓休克起始時間后，設定靜水壓壓力梯度為36，38，40，42和44MPa，持續(xù) 處理3. 5-4. 5分鐘，休克處理完畢后將卵移入23-24°C海水中培養(yǎng)。在原腸中期計算受精 率，在魚苗孵化出膜后，計算四倍體魚苗的孵化率，實驗結果表面，受精卵在38，40和42MPa 壓力都能獲得一定比例的四倍體魚苗，而只有在靜水壓壓力40-42MPa時四倍體魚苗比例 最高，因此確定半滑舌鰨四倍體誘導適宜的靜水壓壓力為40-42MPa。(見表2)最后根據上兩個實驗結果篩選靜水壓處理持續(xù)時間，將梯度范圍設在4-6 分鐘，進行靜水壓休克處理。計數后代中四倍體產生情況，實驗結果表明，在授精后 21. 5-25. 5min,將半滑舌鰨受精卵在40_42MPa壓力下休克處理4-5. 5分鐘，魚苗都能孵化 出膜。而在休克處理4. 5-5. 5分鐘時，誘導四倍體魚苗的比例最高。(見表3)表2 靜水壓誘導半滑舌鰨四倍體休克壓力的確定(海水溫度23°C左右，壓力持續(xù) 時間為4. 5min)
權利要求
1.一種四倍體半滑舌鰨魚苗高效誘導方法，包括如下步驟1)半滑舌鰨精、卵采集與授精選擇性成熟的半滑舌鰨親魚，將卵采入干燥的燒杯中，將采集的魚卵置于19-23°C 保存；采集新鮮半滑舌鰨精液，將采集的精液加入魚卵中，精液和魚卵的體積比為 1 100-1000，輕輕搖動混勻后，加入2倍于魚卵體積的、溫度為19-23°C的海水完成受精過 程，授精后將卵放在19-23°C海水中孵化；2)染色體加倍操作在授精后19-28min內，將步驟1)的受精卵置于靜水壓機的水壓缸中，在38_44MPa 靜水壓下進行壓力休克處理，休克處理時間為3. 5-6min，休克處理完畢后將受精卵移入 19-23 °C的海水中培養(yǎng)孵化；3)半滑舌鰨四倍體魚苗的鑒定將孵化出的魚苗進行染色體倍性鑒定，篩選出四倍體半滑舌鰨魚苗。
2.如權利要求1所述的誘導方法，其特征在于上述的壓力休克處理是在授精后 21. 5-25. 5min 進行的。
3.如權利要求1所述的誘導方法，其特征在于上述的靜水壓力為40-42MPa。
4.如權利要求1所述的誘導方法，其特征在于上述的休克處理時間為4.5-5. 5min。
5.如權利要求1所述的誘導方法，其特征在于上述的染色體倍性鑒定是采用倍性測定 儀分析細胞DNA含量或采用染色體分析方法計數染色體數量。
6.如權利要求5所述的誘導方法，其特征在于上述用倍性測定儀分析的四倍體半滑舌 鰨魚苗的細胞DNA含量為二倍體半滑舌鰨魚苗細胞DNA含量的二倍。
7.如權利要求5所述的誘導方法，其特征在于用染色體分析方法確定的四倍體半滑舌 鰨魚苗的染色體數量為84條。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種四倍體半滑舌鰨魚苗高效誘導方法，包括四倍體半滑舌鰨魚苗的誘導和四倍體半滑舌鰨魚苗的鑒定步驟，其特征是在授精后19-28min內，在38-44MPa靜水壓下進行壓力休克處理，處理時間為3.5-6min，休克處理完畢后將受精卵移入19-23℃的海水中培養(yǎng)孵化。本發(fā)明建立了能有效誘導半滑舌鰨受精卵染色體加倍產生四倍體魚苗的技術方法；首次確定了抑制半滑舌鰨卵子第一次卵裂的技術參數。本發(fā)明的方法操作簡單、實用性強、易行、安全可靠；四倍體魚苗的誘導效率高。本發(fā)明為半滑舌鰨性別控制和多倍體育種開辟了新的技術途徑。
文檔編號A01K61/00GK102090360SQ20101059435
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權日2010年12月17日
發(fā)明者季相山, 徐營, 李文龍, 謝明樹, 陳松林 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所