專利名稱：：太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種生物工程領(lǐng)域的方法，具體是一種太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：太子參是我國的一味珍貴的滋補類中草藥，以根入藥，具有補氣健脾，增強人體免疫力的作用，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品。素有"老食人參，中食黨參，少食太子參"的說法。由于用量巨大，目前面臨著兩個危機:一是野生植物資源蘊藏量和產(chǎn)量普遍存在著下降趨勢；二是太子參需求量不斷增加，造成了對該藥用植物資源的超量采挖。傳統(tǒng)的太子參大田栽培一方面受"天時地利"的影響，產(chǎn)量質(zhì)量波動大；另一方面不可避免地帶來農(nóng)藥殘留污染和植物病毒病等問題。另外，組織、細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)具有生長迅速，易于控制的特點，從而可以逐漸取代大田栽培滿足市場的需要。MS培養(yǎng)基為Murashige和Skoog(1962)公開的培養(yǎng)基，其中1/2MS培養(yǎng)基為大量元素減半MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基在現(xiàn)有的生物以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，謝燕等在《資源與環(huán)境學(xué)報》上發(fā)表的"太子參快繁技術(shù)的優(yōu)化及同源四倍誘導(dǎo)"，該文章中以生長點為外植體誘導(dǎo)四倍體，用這種方式誘導(dǎo)出來的四倍體多為嵌合體。該文中雖然給出了太子參組織培養(yǎng)方法的介紹，但四倍體來源的太子參不定根誘導(dǎo)和連續(xù)培養(yǎng)并沒有進(jìn)行研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，本發(fā)明以太子參愈傷組織為材料，獲得純合四倍體個體，再從純合四倍體愈傷組織上誘導(dǎo)獲得不定根。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟-步驟一，用氯化汞溶液對太子參種子表面進(jìn)行消毒，然后接種到種子萌發(fā)培4養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)；步驟二，切取下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；步驟三，將步驟二生成的愈傷組織繼代2-4次，并將繼代后的愈傷組織在秋水仙堿中浸泡，然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)出再生植株；步驟四，對再生植株根尖的染色體進(jìn)行檢測，根據(jù)染色體檢測結(jié)果選取四倍體植株，并用流式細(xì)胞儀篩選純合四倍體株系；步驟五，將純合四倍體株系的莖段接種到生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；步驟六，將步驟五生成的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根；步驟七，將步驟六誘導(dǎo)出的四倍體不定根接種到搖瓶中，然后放置在搖床上振蕩培養(yǎng)；步驟八，將振蕩培養(yǎng)后的不定根接種到反應(yīng)器中進(jìn)行間歇噴霧式培養(yǎng)。所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基，為添加lmg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基。所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激動素的MS培養(yǎng)基。所述繼代，在不含激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行，每次20-40天。所述分化培養(yǎng)基，為添加3%血紅素、0.2mg/L毒莠錠、1.0mg/L赤霉素、大量元素減半且不含硝酸銨的MS培養(yǎng)基。所述生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為添加2mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基。所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為添加3.0mg/L吲哚丁酸、0.lmg/L6-芐氮基嘌呤、50克每升蔗糖且大量元素減半的MS培養(yǎng)基。所述放置在搖床上振蕩培養(yǎng)，其時間為5天-10天。所述間歇噴霧式培養(yǎng)，其使用的反應(yīng)器為噴霧式反應(yīng)器，反應(yīng)器中使用的培養(yǎng)基為添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素減半的MS培養(yǎng)基。具體條件為通氣速率為0.3vvm，灌注速率為每天50%(體積百分比)，噴霧持續(xù)時間為一次5分鐘，噴霧周期為4次每小時，培養(yǎng)溫度為25°C，暗培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明以太子參愈傷組織為材料，獲得純合四倍體個體，再從純合四倍體愈傷組織上誘導(dǎo)獲得不定根。本發(fā)明5獲得的太子參四倍體不定根不但生長速率快，其化學(xué)成份的含量高于大田種植生產(chǎn)的根。具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。本實施例的太子參種子來自中國藥科大學(xué)。本實施例所述MS培養(yǎng)基采用Murashige和Skoog(1962)公開的培養(yǎng)基，具體成分如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所述1/2MS培養(yǎng)基為大量元素減半MS培養(yǎng)基。本實施例包括如下步驟步驟一，用質(zhì)量百分比0.1%的升汞溶液對太子參種子表面消毒12分鐘后，接種到添加lmg/L赤霉素到MS培養(yǎng)基的種子萌發(fā)培養(yǎng)基(即MS+1.0mg/LGA3)中，獲得無菌材料，并于黑暗中培養(yǎng)一周；步驟二，切取1.Ocm長的下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激動素的MS培養(yǎng)基(即MS+2.Omg/LNAA+O.2mg/L2，4-D+0.lmg/LKT);步驟三，將步驟二生成的愈傷組織在不含激素的MS培養(yǎng)基上繼代2-4次，每次20天-40天，并將繼代后的愈傷組織在0.1%秋水仙堿中浸泡5分鐘-30分鐘，然后無菌清洗3-6次，并轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中，兩個月后培養(yǎng)出再生植株，分化培養(yǎng)基為添加3%血紅素、0.2mg/L毒莠錠、1.0mg/L赤霉素、大量元素減半且不含硝酸銨的MS培養(yǎng)基(即不含硝酸銨的1/2MS+3。/。血紅素+毒莠錠0.2mg/L+GA3l.0，g/L);步驟四，對再生植株根尖的染色體進(jìn)行檢測，根據(jù)染色體檢測結(jié)果選取染色體檢測結(jié)果為2n=4X=64的植株，即選取出四倍體植株，并用流式細(xì)胞儀篩選純合四倍體株系；步驟五，將純合四倍體植株的莖段接種到生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織一個月，生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基(即MS+NAA2.0mg/L);步驟六，將步驟五生成的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根，不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加3.Omg/L吲哚丁酸、0.lmg/L6-芐氨基嘌呤、50克每升蔗糖且大量元素減半的MS培養(yǎng)基(即1/2MS+3.Omg/LIBA+O.1mg/L6-BA+50g/L蔗糖)；步驟七，將步驟六生長出的不定根接種到搖瓶中，接種量為5%-12%(每100ml體積接種的鮮克數(shù))，然后放置在搖床上于lOOrpm，25匸下振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)一周時間；步驟八，將振蕩培養(yǎng)后的不定根按8%-15%(每100ml體積接種的鮮克數(shù))接種到4.8升的噴霧式反應(yīng)器中培養(yǎng)，反應(yīng)器中的培養(yǎng)基為添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素減半的MS培養(yǎng)基(即1/2MS+1.5mg/LIBA+O.05呢/L6-BA+30g/L蔗糖)，通氣速率為0.3vvm，灌注速率為50%(體積百分比)每天，噴霧時間為一次5分鐘，噴霧周期為4次每小時，培養(yǎng)溫度為25°C，暗培養(yǎng)。本實施例分別進(jìn)行了太子參胚性愈傷組織誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚植物再生、四倍體誘導(dǎo)與純合體篩選、純合四倍體植株不定根誘導(dǎo)與噴霧式生物反應(yīng)器培養(yǎng)等實驗。結(jié)果太子參胚性愈組織誘導(dǎo)率這到100%，體細(xì)胞胚植物再生率達(dá)到30%，得到四倍體50株，得到12個純合體株系。用純合體株系的莖段誘導(dǎo)生根用愈傷組織時，誘導(dǎo)率達(dá)了100%。將該愈傷組織(平均直徑為lcm)轉(zhuǎn)移到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，l個月后每塊愈傷組織上平均分化了22條不定根。本實施例中將太子參純合四倍體不定根接種到噴霧式反應(yīng)器中進(jìn)行了培養(yǎng)，結(jié)果表明，在該培養(yǎng)條件下，最大平均生長率達(dá)到0.25±0.08每天，高于用氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)時的0.22±0.12每天。權(quán)利要求1、一種太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，用氯化汞溶液對太子參種子表面進(jìn)行消毒，然后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)；所述種子萌發(fā)培養(yǎng)基為添加1mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基；步驟二，切取下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，所述胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激動素的MS培養(yǎng)基；步驟三，將步驟二生成的愈傷組織繼代2-4次，并將繼代后的愈傷組織在秋水仙堿中浸泡，然后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)出再生植株；所述分化培養(yǎng)基為添加質(zhì)量百分比為3％的血紅素、0.2mg/L的毒莠錠、1.0mg/L的赤霉素、大量元素減半且不含硝酸銨的MS培養(yǎng)基；步驟四，對再生植株根尖的染色體進(jìn)行檢測，根據(jù)染色體檢測結(jié)果選取四倍體植株，并用流式細(xì)胞儀篩選純合四倍體株系；步驟五，將純合四倍體株系的莖段接種到生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；所述生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2mg/L的萘乙酸的MS培養(yǎng)基；步驟六，將步驟五生成的愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根；所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加3.0mg/L的吲哚丁酸、0.1mg/L的6-芐氨基嘌呤、50g/L的蔗糖且大量元素減半的MS培養(yǎng)基；步驟七，將步驟六誘導(dǎo)出的四倍體不定根接種到搖瓶中，然后放置在搖床上振蕩培養(yǎng)；步驟八，將振蕩培養(yǎng)后的不定根接種到反應(yīng)器中進(jìn)行間歇噴霧式培養(yǎng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征是，所述繼代在不含激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行，每次20-40天。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征是，所述放置在搖床上振蕩培養(yǎng)，其時間為5天-10天。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征是，所述間歇噴霧式培養(yǎng)，其使用的反應(yīng)器為噴霧式反應(yīng)器，反應(yīng)器中使用的培養(yǎng)基為添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素減半的MS培養(yǎng)基。5、根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征是，所述間歇噴霧式培養(yǎng)，其具體條件為通氣速率為0.3vvm，灌注速率為每天50%，噴霧持續(xù)時間為一次5分鐘，噴霧周期為4次每小時，培養(yǎng)溫度為25'C，暗培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域的太子參四倍體不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，用氯化汞對太子參種子表面進(jìn)行消毒，然后接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；切取下胚軸接種到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；將愈傷組織繼代，并在秋水仙堿中浸泡后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)出再生植株；對再生植株根尖的染色體進(jìn)行檢測，用流式細(xì)胞儀篩選純合四倍體植株；將純合四倍體株系的莖段接種到生根用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；將愈傷組織接種到不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定根；將不定根接種到搖瓶中，放置在搖床上振蕩培養(yǎng)；將振蕩培養(yǎng)的不定根接種到反應(yīng)器中。本發(fā)明培養(yǎng)的太子參四倍體不定根具有生長快、有效成份含量高的特點。文檔編號A01H1/08GK101473788SQ20081020508公開日2009年7月8日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者王貴榮,齊念民申請人:上海交通大學(xué)