專利名稱：利用pRC/CMV-EGFP質粒創(chuàng)制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用pRC/CMV-EGFP質粒創(chuàng)制轉基因叉尾斗魚方法。
背景技術：
pRC/CMV是一種具有CMV強啟動子的真核表達載體，也是一種功能強大的轉基因 載體，具有CMV啟動子，源于BGH的轉錄終止信號，SV40復制原點。以pRC/CMV為載體的 轉基因研究在人類醫(yī)學和畜禽上的研究報道較多，在水產動物中也有過研究報道(如斑馬 魚)，但在叉尾斗魚上未見相關報道。叉尾斗魚Macropodus opercularis (Linnaeus)屬于 鱸形目Perciformes攀鱸科Anabantidae，是一種廣泛分布于我國南方及東南亞各國的內 陸小型淡水觀賞魚，具有來源廣、易于傳代和飼養(yǎng)容易等優(yōu)勢。本發(fā)明將pRC/CMV真核表達 載體及EGFP引入到叉尾斗魚轉基因技術中，利用pRC/CMV為載體，將綠色熒光蛋白基因整 合到叉尾斗魚基因組內，這一技術不僅能夠提升叉尾斗魚的觀賞價值，達到育成具有特異 性功能叉尾斗魚新品種，而且還是首次將pRC/CMV-EGFP質粒導入叉尾斗魚中，開辟和豐富 了轉基因水產動物的種類和方法，具有重要理論意義和應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用pRC/CMV為載體，將綠色熒光蛋白基因整合到叉尾 斗魚基因組內，創(chuàng)制轉基因叉尾斗魚方法，是先構建含Amp抗性基因、PCMV啟動子、綠色熒 光蛋白標志基因和SV40的多聚腺苷酸識別序列的pRC/CMV-EGFP質粒，利用顯微注射的轉 基因技術將這種質粒導入叉尾斗魚基因組內，借助綠色熒光蛋白基因的作用篩選、創(chuàng)制成 一種轉基因叉尾斗魚，這一轉基因技術的建立不僅能夠提升叉尾斗魚的觀賞價值，達到育 成具有特異性功能的叉尾斗魚新品種，而且還是首次以叉尾斗魚作為實驗材料進行轉基因 研究，拓寬了轉基因水產動物的研究空間。為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案的步驟如下(1)采用分子克隆技術和基因重組的方法，將具有CMV強啟動子的PRC/CMV真核表 達載體與EGFP連接構建獲得帶有綠色熒光標記基因的pRC/CMV-EGFP真核表達質粒，pRC/ CMV-EGFP質粒包含Amp抗性基因、PCMV啟動子、綠色熒光蛋白標志基因和SV40的多聚腺苷 酸識別序列。(2)采用顯微注射轉基因方法，將pRC/CMV-EGFP質粒導入叉尾斗魚受精卵代， 飼養(yǎng)至成魚以交配續(xù)代G1代，在G1代的胚胎發(fā)育至仔魚時期，通過選擇熒光標志基因獲得 穩(wěn)定遺傳的轉基因叉尾斗魚。所述的采用顯微注射轉基因方法的注射時間是產卵后1小時以內、處于單細胞時 期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的pRC/CMV-EGFP質?？倽舛仍?0ng/ μ 1 250ng/ μ 1之 間，質粒溶解在0. ImM 2mM含有ImM 8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中；每粒受精卵注射質粒 的總體積在0. 5nl 5nl之間。
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轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗證方法為通過熒光體視顯微鏡篩選表 達綠色熒光蛋白標志的轉基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā) 射波長為5IOnm 550nm。本發(fā)明具有的有益效果是可以借助熒光標記基因篩選轉基因叉尾斗魚個體，這種轉綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚能夠提升叉尾斗魚的觀賞價值，達到育成具有特異性功能的叉尾斗魚新品種。另外，開 拓了叉尾斗魚轉基因技術研究，為拓寬轉基因水產動物的研究空間打下基礎。


圖1是pRC/CMV-EGFP質粒結構圖。圖2是&代魚綠色熒光蛋白基因PCR檢測結果一。圖3是&代魚綠色熒光蛋白基因PCR檢測結果二。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1 采用顯微注射方法，將攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)標記基因的pRC/CMV-EGFP質 粒(圖1)的濃度調節(jié)為40ng/y 1，質粒溶解在0. ImM含有SmM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然 后在叉尾斗魚產卵1小時內采用顯微注射方法導入受精卵中，導入部位為受精卵動物極， 導入總體積為5nl。從轉基因實驗WG1代叉尾斗魚的胚胎發(fā)育時期開始，通過熒光顯微 鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選獲得穩(wěn)定表達EGFP標志基因的轉基因斗魚，激發(fā)波長為 460nm 490nm，發(fā)射波長為 5 IOnm 550nm。一共注射了 1338粒受精卵，代獲得了 215尾叉尾斗魚，G1代中有14尾叉尾斗魚 為轉基因魚。在檢出的G1代轉基因叉尾斗魚個體中，EGFP分別在尾部(3尾)、眼部(9尾) 和腹部0尾)表達。將上述轉基因魚中的4尾魚(尾部1尾、眼部2尾和腹部1尾)，采用 PCR技術進行實驗，結果證實了 EGFP標記基因已成功導入了叉尾斗魚中(圖2)。PCR上下 游引物分別為5 ‘ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 '和 5 ‘ -ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG-3 ‘。 在圖2中，泳道4至7為為G1代轉基因叉尾斗魚陽性魚，其中泳道4為尾部表達EGFP的轉基 因魚、泳道5和6為眼部表達EGFP的轉基因魚、泳道7為腹部表達EGFP的轉基因魚；泳道2 和3為非轉基因叉尾斗魚的陰性對照；泳道1為pRC/CMV-EGFP質粒陽性對照；Marker為分 子標記，單位為bp,從上而下條帶分子量為:2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp, IOObp0 另外，對PCR擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用膠回收試劑盒(上 海生工)純化，與PMD18-T載體(TaKaRa)連接，16°C過夜，轉化到HBlOl感受態(tài)細胞中，采 用藍白斑挑選陽性克隆，使用EcoR I.Hind III(TaKaRa)雙酶切驗證，陽性克隆送上海生物 工程有限公司測序，測得序列長度為968bp，所得序列經Blast同源搜索確定為EGFP序列。實施例2:采用顯微注射方法，將攜帶EGFP標志基因的pRC/CMV-EGFP質粒的濃度為250ng/ μ 1，質粒溶解在2mM含有ImM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后在叉尾斗魚產卵1小時內導入 受精卵中，導入總體積為0.5nl。從轉基因實驗G1代叉尾斗魚的胚胎發(fā)育時期開始，通過
4熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選表達EGFP標志基因的轉基因斗魚，激發(fā)波長為 460nm 490nm，發(fā)射波長為 5 IOnm 550nm。轉基因實驗一共注射了 1188粒受精卵，獲得了 220尾叉尾斗魚，G1代中有13 尾叉尾斗魚為轉基因魚。在檢出的&代轉基因叉尾斗魚個體中，分別在尾部0尾)、眼 部(8尾)和腸道(3尾)具有綠色熒光表達。將上述轉基因魚中的4尾魚(尾部1尾、 眼部2尾和腹部1尾)，采用PCR技術進行實驗，結果證實了 EGFP標記基因已成功導 入了叉尾斗魚中(圖3)。PCR上下游引物分別為5 ‘ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ‘和 5 ‘ -ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG-3 ‘。在圖3中，泳道1為非轉基因的陰性對照。泳道2 和3表示pRC/CMV-EGFP質粒陽性對照；泳道4至7為G1代4尾轉基因叉尾斗魚，其中泳道 4為尾部表達EGFP的轉基因魚、泳道5和6為眼部表達EGFP的轉基因魚、泳道7為腸道表 達EGFP的轉基因魚；Marker為分子標記，單位為bp，從上而下條帶分子量為2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp, IOObp。另外，對 PCR 擴增產物經 0. 8 % 的 瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用膠回收試劑盒(上海生工)純化，與PMD18-T載 體(TaKaRa)連接，16°C過夜，轉化到HBlOl感受態(tài)細胞中，采用藍白斑挑選陽性克隆，使用 EcoR I.Hind III(TaKaRa)雙酶切驗證，陽性克隆送上海生物工程有限公司測序，測得序列 長度為968bp，所得序列經Blast同源搜索確定為EGFP序列。實施例3 攜帶EGFP標記基因的pRC/CMV-EGFP質粒(圖1)的濃度為150ng/ μ 1，質粒溶解 在0. 6mM含有4mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，在叉尾斗魚產卵1小時內顯微注射導入受精卵 中，導入部位為受精卵動物極，導入總體積為2nl。從轉基因實驗的G1叉尾斗魚的胚胎發(fā)育 時期開始，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選表達EGFP標志基因的轉基因斗魚， 激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā)射波長為5IOnm 550nm。一共注射了 971粒受精卵，獲得了 219尾叉尾斗魚，G1代中有14尾叉尾斗魚為轉 基因魚。在檢出的G1代轉基因叉尾斗魚個體中，EGFP有在尾部0尾)、眼部(11尾)和腸 道(1尾)表達的個體。采用PCR技術也證實了 EGFP標記基因的成功轉入。轉基因叉尾斗 魚飼養(yǎng)再至成魚交配產卵續(xù)代。綜上所述，利用pRC/CMV-EGFP質粒已獲得能夠穩(wěn)定遺傳和表達EGFP熒光標記基 因的轉基因叉尾斗魚，證明具有CMV強啟動子的PRC/CMV真核表達載體可以作為叉尾斗魚 的一個轉基因載體。
權利要求
1.一種利用PRC/CMV-EGFP質粒創(chuàng)制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法，該方法的步 驟如下(1)采用分子克隆技術和基因重組的方法，將具有CMV強啟動子的PRC/CMV真核表達 載體與EGFP連接構建獲得帶有綠色熒光標記基因的pRC/CMV-EGFP真核表達質粒，pRC/ CMV-EGFP質粒包含Amp抗性基因、PCMV啟動子、綠色熒光蛋白標志基因和SV40的多聚腺苷 酸識別序列；(2)采用顯微注射轉基因方法，將pRC/CMV-EGFP質粒導入叉尾斗魚受精卵代，飼養(yǎng) 至成魚以交配續(xù)代G1代，在G1代的胚胎發(fā)育至仔魚時期，通過選擇熒光標志基因獲得穩(wěn)定 遺傳的轉基因叉尾斗魚。
2.根據權利要求1所述的一種利用pRC/CMV-EGFP質粒創(chuàng)制轉綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚方法，其特征在于所述的采用顯微注射轉基因方法的注射時間是產卵后1小時以內、 處于單細胞時期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的pRC/CMV-EGFP質?？倽舛仍?0ng/μ 1 250ng/ μ 1之間，質粒溶解在0. ImM 2mM含有ImM 8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中；每粒受 精卵注射質粒的總體積在0. 5nl 5nl之間。
3.根據權利要求1所述的一種利用pRC/CMV-EGFP質粒創(chuàng)制轉綠色熒光蛋白基因叉 尾斗魚方法，其特征在于轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗證方法為通過熒光 體視顯微鏡篩選表達綠色熒光蛋白標志的轉基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發(fā)波長為 460nm 490nm，發(fā)射波長為 5 IOnm 550nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用pRC/CMV-EGFP創(chuàng)制轉綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法。是先構建帶有綠色熒光蛋白基因的pRC/CMV-EGFP質粒，利用顯微注射技術將這種質粒導入到叉尾斗魚受精卵內，使綠色熒光蛋白基因導入到叉尾斗魚基因組內，并得到穩(wěn)定遺傳和表達，從而創(chuàng)制成一種轉基因叉尾斗魚，這種轉基因叉尾斗魚既能夠用于基因功能研究又提升了其觀賞價值。
文檔編號A01K67/027GK102121032SQ20101057743
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權日2010年12月3日
發(fā)明者危浩, 葉少群, 莊蘭芳, 楊國梁, 王軍毅, 鐘伯雄, 高強, 龍勇 申請人:浙江大學, 浙江省淡水水產研究所