專利名稱：Nac蛋白作為植物免疫蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的用途，尤其涉及一種初生多肽復(fù)合蛋白的具體用途。
技術(shù)背景
W^-^SXMn-M (Nascent polypeptide-associated complex) ^#-^ 純化的方法從牛腦中純化出來的，也是最早報道該蛋白可以與信號識別顆粒SRP(signal recognition particle)競爭性結(jié)合剛從核糖體上合成的多肽。通過親和純化獲得了兩個 初生多肽復(fù)合蛋白(簡稱NAC蛋白)，分別命名為α-NAC蛋白和β-NAC蛋白。此前根據(jù) SDS-PAGE電泳結(jié)果，初步確定這兩個蛋白的分子量分別為33KD和22KD，但是直到2000年 通過質(zhì)譜分析才獲得該蛋白的真實(shí)分子量分別為23. 492KD和17. 352KD。NAC類蛋白基因 的cDNA序列如SEQ ID NO 1所示，其命名為ZmNACl蛋白(GenBank登錄號為EU2M278)， 該基因序列全長為1029bp，具有完整的開放閱讀框架(0RFJ6 907bp)，推測編碼蛋白含 有293個氨基酸，分子量為32. 3KD，等電點(diǎn)為8. 65。
NAC蛋白對真核生物是非常重要的，研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中的NAC基因缺失突變可引 起水稻的早期胚胎死亡，在果蠅(Drosophila)中的NAC基因突變可造成果蠅的二尾現(xiàn)象。 因?yàn)镹AC蛋白是一個異二聚體，所以在真核生物體內(nèi)，它作為整體的功能是首要的，但是對 NAC蛋白的亞細(xì)胞定位顯示以及對亞基mRNA含量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NAC蛋白既可以發(fā)揮整體 的功能，同時作為單個功能蛋白也可以起作用。
NAC蛋白的首要作用就是與信號識別顆粒SRP在與初生多肽結(jié)合時形成競爭，避 免非正確折疊和缺少信號肽的蛋白序列被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER membrane)。SRP是一種分子 伴侶，在蛋白質(zhì)的翻譯過程中，SRP通過與新合成的多肽的信號肽序列結(jié)合而終止蛋白的翻 譯過程，并將新合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到亞細(xì)胞器上，從而使蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸以一個整 體的形式(而非以單個氨基酸的形式)進(jìn)行。盡管SRP與沒有信號肽的蛋白結(jié)合和運(yùn)輸?shù)?效率很低，但一旦SRP與沒有信號肽的蛋白結(jié)合并進(jìn)行運(yùn)輸，這對細(xì)胞來說將是毀滅性的， 因?yàn)楹芏嗟牡鞍酌笗鸭?xì)胞本身降解。此種情況下就需要NAC蛋白的參與，在NAC復(fù)合物 存在的情況下，缺少信號肽的初生多肽鏈?zhǔn)紫扰cNAC復(fù)合物結(jié)合，從而避免其與SRP結(jié)合并 發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)；而含有信號肽的初生多肽鏈既可以與NAC復(fù)合物結(jié)合又可以與SRP結(jié)合，但是與 SRP的結(jié)合能力更強(qiáng)。從這種意義上講，NAC也是一種分子伴侶。NAC復(fù)合物通過其β亞 基可以與核糖體結(jié)合，這應(yīng)該與其行使分子伴侶的功能有關(guān)。
此外，由于α-NAC在細(xì)胞體內(nèi)的表達(dá)量遠(yuǎn)超過了 β亞基，因此它可以單體形式 存在，目前已有越來越多的證據(jù)證明，α-NAC蛋白是一種新的“轉(zhuǎn)錄共激發(fā)子”。而最早從 HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的β-NAC蛋白則被命名為BTF3 (Basic Transcription Factor 3)，已有 的研究認(rèn)為該亞基具有刺激轉(zhuǎn)錄的作用，但是β-NAC蛋白本身不能結(jié)合DNA，它需要RNA聚 合酶II的參與，與o-NAC蛋白的活性相比，目前對β-NAC蛋白刺激轉(zhuǎn)錄的活性多持懷疑態(tài) 度。
約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院Kimmel癌癥中心的研究人員在對比338個卵巢癌患者的原發(fā)和次發(fā)性腫瘤樣本后發(fā)現(xiàn)，次發(fā)性腫瘤樣本中NACl的含量比同一患者來源的原發(fā)性腫 瘤樣本中的含量明顯高出許多；且原發(fā)性癌癥患者如果NACl含量高的話，接受手術(shù)一年后 更易發(fā)生次發(fā)性癌癥。換句話說，如果接受卵巢癌治療的婦女其腫瘤細(xì)胞內(nèi)含有大量的引 發(fā)畸型生長、降低細(xì)胞死亡的結(jié)合蛋白——NAC1，則腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險會增加。研究人員還 表示，可以通過在手術(shù)摘除的癌癥組織中檢測NACl蛋白的含量，來判斷這些接受手術(shù)的婦 女癌癥復(fù)發(fā)的可能性，以提高醫(yī)生和患者的可預(yù)見性，提高治療效果。研究人員還強(qiáng)調(diào)，阻 斷NACl的活性是預(yù)防、治療卵巢癌復(fù)發(fā)的一種治療方法。此外，通過應(yīng)用免疫共沉淀、GST pu 11-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證人Nanog基因與NACl的相互作用，結(jié)果表明人Nanog基因與NACl在體 內(nèi)、體外均能形成復(fù)合物，二者的相互作用對于人胚胎干細(xì)胞的自我更新及腫瘤的發(fā)生可 能具有重要的影響。
目前還有研究發(fā)現(xiàn)，多個NAC蛋白可參與植物對逆境的響應(yīng)。例如，利用鹽溶液處 理擬南芥，僅在其根中就發(fā)現(xiàn)有33個NAC基因的表達(dá)受到顯著影響(Jiang and Deyholos, 2006)，其中部分基因已經(jīng)過功能鑒定。此外，過量表達(dá)0sNAC6基因的水稻雖然生長慢、產(chǎn) 量低，但卻顯示出對干旱、高鹽等逆境的較強(qiáng)抗性(Nakashima et al.，2007)。來自水稻的 SNAC2 (stress-responsive NAC 2)基因受到干旱、高鹽、低溫以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，其過表 達(dá)使植株耐冷、抗鹽并能抵御干旱。基因表達(dá)分析揭示，SNAC2蛋白誘導(dǎo)了許多脅迫相關(guān)基 因的表達(dá)，包括過氧化物酶、熱激蛋白和鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因等(Hu et al，2008)。
綜上所述，對NAC蛋白已有的研究表明，除了其在生物遺傳領(lǐng)域所具有的基本蛋 白功能以外，NAC蛋白還可在人體中引發(fā)腫瘤細(xì)胞畸型生長、降低細(xì)胞死亡，其還可參與植 物對逆境的響應(yīng)，但從未有相關(guān)報道記載或表明NAC蛋白具有誘導(dǎo)或激活植物免疫反應(yīng)的 功能。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、成本低、效 果好的NAC蛋白作為植物免疫蛋白的應(yīng)用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種NAC蛋白作為植物免疫蛋白 的應(yīng)用。
作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，上述的應(yīng)用具體是指NAC蛋白對提高番茄抗 灰霉病免疫力的應(yīng)用。上述的應(yīng)用還可以具體是指NAC蛋白對提高番茄抗煙草花葉病毒免 疫力的應(yīng)用。
以上針對番茄應(yīng)用的具體操作優(yōu)選為先將所述NAC蛋白以清水稀釋至5ppm 40ppm，然后用稀釋后的蛋白液對番茄進(jìn)行噴施處理，噴施時間至少提前于疫病高發(fā)期 7d 30d。噴施處理可以是在番茄的全生育期施用，但經(jīng)過我們的觀察和長期研究，對番茄 幼苗苗株進(jìn)行噴施處理的效果更好，所述番茄幼苗苗株優(yōu)選為長成至3 6片葉的幼苗。
作為對本發(fā)明上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述應(yīng)用還可具體是指NAC蛋白對提高辣椒 抗疫霉菌病免疫力的應(yīng)用。所述應(yīng)用的具體操作優(yōu)選為先將所述NAC蛋白以清水稀釋至 5ppm 40ppm，然后用稀釋后的蛋白液對辣椒進(jìn)行噴施處理，噴施時間至少提前于疫病高 發(fā)期7d 30d。該噴施處理同樣可以是在辣椒的全生育期施用，但經(jīng)過我們的觀察和長期 研究，對辣椒幼苗苗株進(jìn)行噴施處理的效果更好，所述辣椒幼苗苗株優(yōu)選為長成至8 9片葉的幼苗。
雖然上述技術(shù)方案主要列舉了番茄、辣椒在抗灰霉病、抗煙草花葉病毒等疫病上 的應(yīng)用，但經(jīng)過我們在其他植物上實(shí)驗(yàn)和觀察，NAC蛋白對提高白菜抗軟腐病的免疫力、提 高黃瓜抗煙草花葉病毒的免疫力以及提高水稻抗稻瘟病的免疫力上均有很好的技術(shù)效果， 因此，我們認(rèn)為NAC蛋白在提高植物免疫力上具有普適性，是一種極具應(yīng)用潛力和研究價 值的植物免疫蛋白。
經(jīng)過我們的反復(fù)實(shí)驗(yàn)和研究發(fā)現(xiàn)，NAC蛋白之所以具有提高植物免疫能力的效果， 其原因在于NAC蛋白通過增加植物的葉綠素，能夠促進(jìn)植物的生長、代謝，使用NAC蛋白后 可以促進(jìn)植物產(chǎn)生水楊酸、茉莉酸和乙烯等物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)植保素、抗病相關(guān)蛋白和酚類有 機(jī)物等抗菌、抗病毒物質(zhì)的合成，最終達(dá)到提高植物抗多種病害免疫能力的技術(shù)效果。與現(xiàn) 有植物抗病蟲害的相關(guān)技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于首先，本發(fā)明的適用范圍廣，普適性 強(qiáng)，可廣泛用于各種蔬菜(例如白菜、番茄)、瓜果(例如黃瓜、果樹等)、糧食作物(例如水 稻、小麥等)等各種植物；第二，本發(fā)明的應(yīng)用效果穩(wěn)定，由于是從提高植物自身免疫力的 角度出發(fā)，相比普通的殺蟲劑、殺菌劑等抗病蟲害的處理方法，本發(fā)明的應(yīng)用不存在耐藥性 問題，應(yīng)用效果更加穩(wěn)定；第三，相比農(nóng)藥噴施、生態(tài)處理等方法，由于本發(fā)明是內(nèi)源性的抗 病蟲害機(jī)制，不會造成對生態(tài)環(huán)境的污染和破壞，不存在農(nóng)藥殘留問題，更加的環(huán)保安全。 此外，本發(fā)明的應(yīng)用方法操作簡單，成本低，更加有利于產(chǎn)業(yè)化推廣和應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中的雙子葉植物灰霉病分級圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例中NAC蛋白制備工藝的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1 :NAC蛋白對提高番茄抗灰霉病免疫力的應(yīng)用
將NAC蛋白以清水稀釋至30ppm，用稀釋后的蛋白液對番茄幼苗葉片(5 6片葉) 進(jìn)行噴霧處理，以清水作對照，每個處理用30株苗。處理7d、14d后，分別用噴霧法將番茄 灰霉病菌孢子懸浮液(IO5個/ml)接種到番茄幼苗上，4 保濕，一周后進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查， 計算防治效果，各處理均重復(fù)三次，處理后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。
表1 :NAC蛋白對番茄誘導(dǎo)抗病性的實(shí)驗(yàn)對照結(jié)果
誘抗效果 處理樣本 ^^^^7d14d病情指數(shù) Pt誘抗效果 (%)病情指數(shù) Pt誘抗效果 (%)清水(CK對照)8.9811.02NAC蛋白稀釋液2.2767.1%6.2148.1%
上表1中
權(quán)利要求
1.NAC蛋白作為植物免疫蛋白的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體是指NAC蛋白對提高番茄抗 灰霉病免疫力的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體是指NAC蛋白對提高番茄抗 煙草花葉病毒免疫力的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體操作為先將所述 NAC蛋白以清水稀釋至5ppm 40ppm，然后用稀釋后的蛋白液對番茄進(jìn)行噴施處理，噴施時 間至少提前于疫病高發(fā)期7d 30d。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述進(jìn)行噴施處理的番茄為番茄幼苗苗 株，所述番茄幼苗苗株為長成至3 6片葉的幼苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體是指NAC蛋白對提高辣椒抗 疫霉菌病免疫力的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的具體操作為先將所述NAC蛋白 以清水稀釋至5ppm 40ppm，然后用稀釋后的蛋白液對辣椒進(jìn)行噴施處理，噴施時間至少 提前于疫病高發(fā)期7d 30d。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述進(jìn)行噴施處理的辣椒為辣椒幼苗苗 株，所述辣椒幼苗苗株為長成至8 9片葉的幼苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種初生多肽復(fù)合蛋白的具體用途，具體公開了一種NAC蛋白作為植物免疫蛋白的應(yīng)用，其具體可以是指NAC蛋白對提高番茄抗灰霉病免疫力的應(yīng)用，對提高番茄抗煙草花葉病毒免疫力的應(yīng)用或者對提高辣椒抗疫霉菌病免疫力的應(yīng)用，該應(yīng)用過程的操作簡單、成本低、效果好。
文檔編號A01G7/06GK102028000SQ20101052806
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者符江華 申請人:北京豐原康泰生物科技有限公司