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轉(zhuǎn)基因茶葉的制備方法以及由此得到的轉(zhuǎn)基因茶葉的制作方法

文檔序號(hào):350650閱讀:556來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::轉(zhuǎn)基因茶葉的制備方法以及由此得到的轉(zhuǎn)基因茶葉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及通過基因槍來(lái)制備轉(zhuǎn)基因茶葉(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)。
背景技術(shù)
:茶是一種具有抗癌活性的含有咖啡因的流行飲料(Jankim,J.,SeIman,S.H.,Swiercz,R.Whydrinkinggreenteacouldpreventcancer.Nature5:561;1997)0在世界所有的茶葉產(chǎn)區(qū),茶葉還是一種重要的職業(yè)來(lái)源,并是一種主要的外匯來(lái)源(Wilson,K.C.BotanyandPlantImprovementIn:ffilsonR.C.,ed.Coffea,CocoaandTea.CABIPublishing,Wallingford,UK:167_173;1999)。但是,茶葉的總產(chǎn)量并不能完全滿足國(guó)內(nèi)和國(guó)際市場(chǎng)的需要(Kabra,G.D.Teastatisticsfor1999In:Teatime,Vol.VIII,No.3Sep-Nov99,30-31;1999)0由于不同的生物(真菌、蟲害以及病毒)和非生物(霜凍、冰雹、寒冷、干旱、以及營(yíng)養(yǎng)缺乏等)災(zāi)害,茶葉的產(chǎn)量以及質(zhì)量進(jìn)一步降低(Wilson,K.C.BotanyandPlantImprovementIn:ffilsonR.C.,ed.Coffea,CocoaandTea.CABIPublishing,Wallingford,UK:167-173;1999)。盡管對(duì)于多數(shù)農(nóng)作物來(lái)說,單位面積的高產(chǎn)量是最為重要的,但是對(duì)于茶葉來(lái)說,其主要目的是增加產(chǎn)量同時(shí)使之具有更好的適應(yīng)性以及口感性質(zhì)。此外,世界市場(chǎng)對(duì)于來(lái)自世界不同部分的茶葉具有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),為獲取較高的商業(yè)價(jià)值,產(chǎn)品必須符合該標(biāo)準(zhǔn)。因此,具有強(qiáng)災(zāi)害抗性并同時(shí)具有高產(chǎn)量以及好口感的茶葉作物就尤其重要(Barua,D.N.TheteaplantofcommerceIn=Barua,D.N.,ed.Scienceandpracticeinteaculture,TeaResearchAssociationCalcutta;53-68;1989)0農(nóng)作物改良計(jì)劃的目的之一是后代植物的形態(tài)學(xué)一致性。常規(guī)茶樹種植計(jì)劃中的主要局限性在于,在近10年的長(zhǎng)生命周期中,伴隨著高程度的自身非親和性以及同系繁殖退化(Barua,D.N.Theteaplantofcommercehi:Barua,D.N.,ed.Scienceandpracticeinteaculture,TeaResearchAssociationCalcutta;53_68;1989)??嗽卖奚鲜鼍窒扌缘闹匾?、有效的替代方法是利用Agrobacteriumtutnefaciens或者基因槍來(lái)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,其中可將所需的基因直接引入植物基因組中。已經(jīng)成功將基因槍用于多年生木本的基因改良,尤其用于當(dāng)所述植物具有長(zhǎng)生命周期或者當(dāng)植物遺傳的基本信息缺乏時(shí)。因此,當(dāng)葉子作為初始的離體葉片時(shí),在茶葉中利用基因槍進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化具有極大的潛力。此外,盡管離體葉片對(duì)作物改良具有極大的潛力,但該離體葉片對(duì)Agrobacteriumtumefaciens-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化高度抵抗,這可能是由于某種酚的存在而造成的(BiaoXi,ToruK,JianXu,YongyanBEffectofpolyphenolcompoundsinteatransformations.Abstr.no.314.In:AmericanSocietyofPlantPhysiologists,PlantBiology1998)。盡管已經(jīng)鑒別出一些高產(chǎn)率、高質(zhì)量的茶樹克隆,但是這些茶樹可能具有皰疫病。由于諸如子葉培植體等異種組織將導(dǎo)致遺傳變異,喪失所需的高產(chǎn)率以及高質(zhì)量的特性,因此在這些克隆中需要采用諸如葉片移植等利用同種組織的生物技術(shù)手段。因此,采用葉片培植體是很重要的。但是,已知利用Agrobacteriumtumefaciens進(jìn)行葉的轉(zhuǎn)化是無(wú)效的,這是由于其中所含的某種多酚的高含量所致。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到,為了成功進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過程,主要需要如下三個(gè)因素(i)增加表面積以使最多的粒子穿過,(ii)最小程度的細(xì)胞傷害/損傷,以及(iii)最大程度的再生效率。據(jù)此,開發(fā)出一種利用葉片培植體通過基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法來(lái)生產(chǎn)茶葉(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)的方法,在該方法中,為了進(jìn)一步獲得所選優(yōu)異特性的基因改良,考慮到了上述的三種因素。首先在茶樹葉細(xì)胞中通過Agrobacteriumtumefaciens進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化(MatsumotoSandFukaiM1998Agrobacteriumtumefaciensmediatedgenetransferinteaplant(Camelliasinensis)cells.JapanAgriculturalResearchQuarterly,32287-291;MatsumotoSandFulcaiM1999EffectofacetosyringoneapplicationonAgrobacteriummediatedgenetransferinteaplant(Camelliasinensis),BulletinoftheNationalResearchInstituteofvegetables,ornamentalplantsandtea,Shizuoka,Japan,14:9_15),其中利用500uM的乙酰丁香酮來(lái)制備轉(zhuǎn)化的葉片的愈傷組織,然后用200ug/ml的卡那霉素進(jìn)行選擇。這些轉(zhuǎn)化的愈傷組織利用nptll引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最主要的缺點(diǎn)在于轉(zhuǎn)基因植物不能自這些轉(zhuǎn)化的葉片愈傷組織中進(jìn)行再生。甚至對(duì)葉片上的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)也需要高劑量的昂貴的化學(xué)物質(zhì)乙酰丁香酮。Biao也試圖通過Agrobacteriumtumefaciens來(lái)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(BiaoXi,TomIZ,JianXu,YongyanBEffectofpolyphenolcompoundsinteatransformations.Abstr.no.314.In:AmericanSocietyofPlantPhysiologists,PlantBiology1998),其對(duì)葉禾口子葉進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。該研究的缺點(diǎn)在于,由于大量的酚類(主要是兒茶酚)的存在,使得葉片培植體不能被Agrobacteriumtumefaciens有效感染,因而不能被轉(zhuǎn)化。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的在于提供一種利用葉片培植體通過基因槍來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因茶葉(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)的方法,該方法克服了上述的缺陷。本方法的新穎性在于它是第一個(gè)利用基因槍來(lái)高頻轉(zhuǎn)化茶樹葉片培植體從而成功制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明的另一目的在于其在增加表面積以使最多的粒子穿過、最小程度的細(xì)胞傷害/損傷、及最大程度的再生效率上取得了成果。本發(fā)明的又一目的在于開發(fā)影響基因槍的參數(shù)的不同組合(354),從而達(dá)到(i)增加表面積以使最多的粒子穿過,(ii)最小程度的細(xì)胞傷害/損傷,以及(iii)最大程度的再生效率的目的。本發(fā)明的另一目的在于克服了采用基因槍的某些步驟中遇到的一些問題。本發(fā)明又一目的在于制備對(duì)生物和非生物災(zāi)害具有抗性的轉(zhuǎn)基因茶葉。本發(fā)明的另一目的在于制備具有高產(chǎn)量和良好杯中質(zhì)量的茶葉植物。本發(fā)明的再又一目的在于對(duì)優(yōu)質(zhì)茶葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化從而改進(jìn)質(zhì)量和產(chǎn)率。本發(fā)明的又一目的在于制備脫咖啡因的茶葉植物。本發(fā)明的再又一目的在于利用諸如索馬甜和植物血凝素等基因來(lái)制備具有甜味茶樹葉的轉(zhuǎn)基因茶葉植物。本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明涉及利用基因槍通過用于制備轉(zhuǎn)基因茶葉(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)的360參數(shù)的新結(jié)合來(lái)制備轉(zhuǎn)基因茶葉(Camelliasinensis(L.)0.Kuntze)。本發(fā)明的方法包括(a)在將360種組合用于葉片培植體之前,將葉片培植體用選自單獨(dú)的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇組合物等不同濃度(0.25-0.75M)的不同滲透劑以及液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基進(jìn)行處理(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497;1962),其中培養(yǎng)基中添加了維生素樣的維生素Bl-HCl(0.lmg/1)、維生素B6-HC1(0.5mg/l)、以及尼克酸(0.5mg/l),并添加了氨基乙酸(2.0mg/l),處理時(shí)間在2至8小時(shí)之間變化;(b)在透明聚乙烯膜上畫直徑在2.0-9.Ocm范圍內(nèi)變化的同心圓,其中最外層圓的直徑與9.Ocm培養(yǎng)皿的直徑相同;(c)排列葉片培植體,使近軸表面在再生培養(yǎng)基上部,用于轟擊;(d)在9.Ocm培養(yǎng)皿的同心圓內(nèi)(2.0-5.0cm)的再生培養(yǎng)基上排列葉片培植體,使BioRad制造的被pRT99⑶S質(zhì)粒DNA包被的微射彈以最大速度發(fā)射;(e)分別用70%乙醇和蒸餾水洗滌3次,對(duì)金粒進(jìn)行消毒;(f)用0.5-1.5ml蒸餾水懸浮60ug金粒;(g)在1.5ml的Eppendorf管中分散25_60ul的上述懸浮液,用于每次的轟擊;(h)將50ul的金懸浮液與IOul不同濃度的pRT99⑶S質(zhì)粒DNA(0.5_5ug/ul)、40-50ul的1.5-3.5MCaCl2和10_50ul的0.5-2.OM不含亞精胺的磷酸鹽進(jìn)行混合,并不時(shí)震蕩攪拌,然后在500-1100rpm離心5_20秒,接下來(lái)移去上清,用70%乙醇洗滌,最后用50-100ul的100%乙醇懸??;(i)在無(wú)菌大載體(BioRad)上通過迅速震蕩使IOul金粒懸浮液和DNA進(jìn)行包被;(j)360種組合的形成,其包含間隔距離或在破裂盤和大載體之間的距離(單獨(dú)為1/4-3/8英寸,及其組合)、大載體飛行距離或大載體和停止屏之間的距離(6-16mm)、以及靶距離或微射彈停止屏和靶組織之間的距離(6-12cm),所述距離用于增加最大粒子穿透的表面積,從而達(dá)到最小細(xì)胞損傷/傷害以及最大再生效率;(k)用基因槍對(duì)葉片培植體進(jìn)行轟擊,所述基因槍諸如DuPont、Genebooster,但尤其是Helium動(dòng)力粒子傳輸系統(tǒng),PDS-1000/He(Bio-Rad)在小室壓力為22-28英寸汞柱下,具有金粒(0.6-1.6um),還具有1、2和4ug/ul濃度的DNA以及上述的360種組合,其中通過增加靶距離來(lái)優(yōu)化粒子分散從而避免由于氣體震蕩和高度的粒子分散導(dǎo)致的組織損傷,同時(shí)通過降低間隔距離來(lái)克服由于微射彈飛行距離的中心錯(cuò)位飛行而導(dǎo)致的組織損傷;(1)通過將培養(yǎng)盤旋轉(zhuǎn)180°C而改變其方向后,對(duì)每一圓盤轟擊兩次;(m)在再生培養(yǎng)基上旋轉(zhuǎn)轟擊后的培植體,其包括葉、細(xì)胞胚芽、合子胚、以及胚胎發(fā)育形成的愈傷組織,使之上下倒轉(zhuǎn),背軸面向上,從而使轟擊表面與再生培養(yǎng)基相接觸;(η)在培養(yǎng)室中在25士2°C的條件下,于暗處培養(yǎng)兩天;(ο)對(duì)轟擊的葉片進(jìn)行GUS表達(dá)的檢測(cè),該檢測(cè)是按照J(rèn)efferson的方法進(jìn)行的,在該方法中,GUS(5-溴,4-氯,3-吲哚,β-D葡萄糖苷酸)化學(xué)物質(zhì)與轉(zhuǎn)化的葉片培植體反應(yīng)生成藍(lán)色的“反應(yīng)產(chǎn)物”,顯示BioRad的pRT99⑶S質(zhì)粒DNA包被的微射彈進(jìn)入到了移植組織的細(xì)胞內(nèi)(JeffersonRA1987,Assayingchimericgenesinplants:TheGUSgenefusionsystem,PlantMolBiolRep5:389_405);(ρ)按照SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S于2001年提交的專禾[I·‘Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants'中的方法,兩天后在培養(yǎng)室中52umolπΓ、—1的冷熒光條件下于正常的16h光周期將轟擊后的葉片培植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基;(q)最后,每15天后,在含有卡那霉素(250_1lOOug/ml)的選擇培養(yǎng)基中選擇假定的轉(zhuǎn)化株;(r)按照SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S于2001年提交的專禾[I‘Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants'中公布的方法,使3_5月大的完全卷曲、半開放或完全伸展的葉片培植體的體外培養(yǎng)物出芽;(s)^MSandalI,BhattacharyaA,AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1)=75-80(2001)中的方法在液態(tài)介質(zhì)中使轉(zhuǎn)基因的芽進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖(t)按照常規(guī)的PCR和Southern雜交方法對(duì)采用250_1100ug/ml卡那霉素選擇出的轉(zhuǎn)基因植物的GUS陽(yáng)性組織進(jìn)行分子鑒定。在一個(gè)實(shí)施方案中,利用上述的基因槍方法對(duì)不同培育植物(Chinary,Cambod以及Assamica)的諸如葉、細(xì)胞胚芽、合子胚、以及胚胎發(fā)育形成的愈傷組織等不同的培植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在另一個(gè)實(shí)施方案中,利用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基和不同的滲透劑來(lái)處理體外培養(yǎng)植物的葉片培植體,其中,在用基因槍轟擊前,最簡(jiǎn)單和最便宜的MS培養(yǎng)基是最有效的。在另一個(gè)實(shí)施方案中,利用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基和諸如單獨(dú)的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的組合等不同范圍的滲透劑來(lái)處理體外培養(yǎng)的植物的葉片培植體,其中不含激素的全濃度MS培養(yǎng)基是最有效的。在又一個(gè)實(shí)施方案中,利用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基和不同的滲透劑來(lái)對(duì)葉片培植體處理2-8小時(shí)的不同時(shí)間,其中利用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基處理4小時(shí)是最有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中,用無(wú)菌水配制50_70ug的金粒,直接使用并儲(chǔ)藏,從而克服當(dāng)DNA上樣到大載體時(shí)產(chǎn)生殘留甘油的抑制作用。在又一個(gè)實(shí)施方案中,在一透明的聚乙烯膜上畫直徑在2.0-9.Ocm變化的同心圓,其中最外圈圓的直徑與9.Ocm培養(yǎng)皿的直徑相同。在一個(gè)實(shí)施方案中,排列培植體,使近軸表面在再生培養(yǎng)基上部,用于轟擊。在另一個(gè)實(shí)施方案中,為了優(yōu)化pRT99⑶S質(zhì)粒DNA包被的微射彈,(BioRad)將培植體排列在再生培養(yǎng)基上9cm培養(yǎng)皿的2.0-5.Ocm的不同同心圓內(nèi),并采用Jefferson(JeffersonRA1987,Assayingchimericgenesinplants:TheGUSgenefusionsystem,PlantMolBiolRep5:389-405)的GUS檢測(cè)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,分別用70%乙醇和無(wú)菌水洗滌0.5-1.5ml的金粒3次,用于消在另一個(gè)實(shí)施方案中,將25_60ul的懸浮液分散于1.5ml的Eppendorf管中,用于每次轟擊。在另一個(gè)實(shí)施方案中,將40-60ul的金懸浮液與5-15ul不同濃度的pRT99⑶S質(zhì)粒DNA(0.5-5ug/ul)、40_60ul的1.5-3.5MCaCl2以及10_50ul的0.5-2.OM不含亞精胺的磷酸鹽混合。在又一個(gè)實(shí)施方案中,不時(shí)震蕩攪拌懸浮液,然后在500-1IOOrpm離心5_20秒,接下來(lái)移去上清,用70%乙醇洗滌,最后用50-100ul的100%乙醇懸浮。在又一個(gè)實(shí)施方案中,在無(wú)菌大載體(BioRad)上通過迅速震蕩使5_15ul金粒懸浮液和DNA進(jìn)行包被。在又一個(gè)實(shí)施方案中,用基因槍對(duì)葉片培植體進(jìn)行轟擊,所述基因槍諸如DuPont、Genebooster,和Helium動(dòng)力粒子傳輸系統(tǒng),PDS-1000/He(Bio-Rad)但優(yōu)選Helium動(dòng)力粒子傳輸系統(tǒng),小室壓力為22-28英寸汞柱的PDS-1000/He(Bio-Rad)。在另一個(gè)實(shí)施方案中,形成360種組合,其包含間隔距離或在破裂盤和大載體之間的距離(單獨(dú)為1/4-3/8英寸,及其組合)、大載體飛行距離或大載體和停止屏之間的距離(6-16mm)、以及靶距離或微射彈停止屏和靶組織之間的距離(6-12cm),所述距離用于增加最大粒子穿透的表面積,從而達(dá)到最小細(xì)胞損傷/傷害以及最大再生效率;在另一個(gè)實(shí)施方案中,采用上述的360種組合,與0.6-1.6um粒度范圍內(nèi)的金粒,以及1、2和4ug/ul濃度的DNA,其中優(yōu)選1.Oum金粒的組合,脈沖壓1IOOpsi,靶距離(9cm),間隔距離(3/8"+1/4"和1/4"),大載體飛行距離(16mm),以及l(fā)ug/ml的DNA具有最佳轉(zhuǎn)化頻率。在另一個(gè)實(shí)施方案中,通過將培養(yǎng)盤旋轉(zhuǎn)180°C而改變其方向后,對(duì)每一圓盤轟擊兩次。在另一實(shí)施方案中,將轟擊后的培植體在再生培養(yǎng)基上上下倒轉(zhuǎn),背軸面向上。在另一實(shí)施方案中,優(yōu)選將轟擊后的培植體在25士2°C的條件下,在培養(yǎng)室中于暗處培養(yǎng)兩天,然后利用SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S.于2001年提交的專禾[I'Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants'中描述的再生培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在另一實(shí)施方案中,轟擊6天后,利用JeffersonRA(1987)Assayingchimericgenesinplants:TheGUSgenefusionsystem,PlantMolBiolRep5:389_405中的GUS檢測(cè)方法,檢測(cè)轟擊后的培植體中的瞬時(shí)表達(dá)。在另一實(shí)施方案中,每15天后,在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基中選擇來(lái)源于葉片的愈傷組織。在另一實(shí)施方案中,采用250-1100ug/ml范圍內(nèi)的卡那霉素來(lái)選擇轉(zhuǎn)化株,幾乎沒有“野生”機(jī)會(huì)的轉(zhuǎn)化株。在另一實(shí)施方案中,種植1.Ocm長(zhǎng)的健康轉(zhuǎn)基因植株,并在Sandall,BhattacharyaA,AhujaP.S.的不含卡那霉素的液態(tài)繁殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖。用于茶葉芽繁殖的一種有效的液體培養(yǎng)系統(tǒng)如PlantCellTissueOrganCulture65(1)75-80(2001)中所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中,按照常規(guī)的PCR和Southern雜交方法對(duì)采用250-1IOOug/ml卡那霉素選擇出的轉(zhuǎn)基因植物的⑶S陽(yáng)性組織進(jìn)行分子鑒定。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)不同的培植體,諸如細(xì)胞胚芽以及胚胎發(fā)育形成的愈傷組織采用上述參數(shù)進(jìn)行轟擊。在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中,利用來(lái)源于離體植株(invitro)和植株外(exvitro)的植物的葉片培植體的不同的栽培變種來(lái)進(jìn)行轟擊。(i)用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497;1962)以及不同濃度的滲透劑,諸如單獨(dú)的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的組合等的處理不同的時(shí)間(2-8小時(shí))。(ii)在透明聚乙烯膜上畫出直徑同心圓,其中最外層圓的直徑與9.Ocm培養(yǎng)皿的直徑相同。(iii)在9.Ocm培養(yǎng)皿的不同同心圓內(nèi)(2.0-5.0cm)的再生培養(yǎng)基上排列葉片培植體,使DNA包被的微射彈以最大速度發(fā)射。(iv)分別用70%乙醇和蒸餾水洗滌3次對(duì)金粒進(jìn)行消毒后,將0.5-1.5ml的金粒懸浮于無(wú)菌蒸餾水中。(ν)在1.5ml的Eppendorf管中分散上述懸浮液(25_60ul),用于每次的轟擊。(vi)將50ul的金懸浮液與IOul不同濃度的質(zhì)粒DNA(0.5_5ug/ul)、40_50ul的1.5-3.5MCaCl2和10_50ul的0.5-2.OM不含亞精胺的磷酸鹽進(jìn)行混合。(vii)不時(shí)震蕩攪拌上述懸浮液,在500-1IOOrpm離心5_20秒,接下來(lái)移去上清,用70%乙醇洗滌,最后用50-100ul的100%乙醇懸浮。(viii)在無(wú)菌大載體(BioRad)上通過迅速震蕩使IOul金粒懸浮液和DNA進(jìn)行包被。(ix)形成354組合,其包含(a)間隔距離或在破裂盤和大載體之間的距離(單獨(dú)為1/4-3/8英寸,及其組合),(b)大載體飛行距離或大載體和停止屏之間的距離(6-16mm),(c)靶距離或微射彈停止屏和靶組織之間的距離(6-12cm),破裂圓盤的脈沖壓(650-1350psi)用于增加最大粒子穿透的表面積,從而達(dá)到最小細(xì)胞損傷/傷害以及最大再生效率。(χ)用Helium動(dòng)力粒子傳輸系統(tǒng)PDS-1000/He(Bio-Rad)對(duì)葉片培植體進(jìn)行轟擊,小室壓力為25英寸汞柱,具有金粒(0.6-1.6um),以及1、2和4ug/ul濃度的DNA以及上述的354組合。(xi)通過將培養(yǎng)盤旋轉(zhuǎn)180°C而改變其方向后,對(duì)每一圓盤轟擊兩次。(xii)將轟擊后的培植體在再生培養(yǎng)基上上下倒轉(zhuǎn),背軸面向上,從而使轟擊后的表面與再生培養(yǎng)基接觸,快速愈合。(xiii)在培養(yǎng)室的條件下將轟擊后的葉片培植體于暗處培養(yǎng)兩天。(xiv)禾IjMJeffersonRA(1987)Assayingchimericgenesinplants:TheGUSgenefusionsystem,PlantMolBiolRep5:389_405中的GUS檢測(cè)方法,檢測(cè)轟擊后的培植體中的瞬時(shí)表達(dá),籍此檢測(cè)粒子穿透的最大傳播。(XV)按照SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S于2001年提交的專禾[I.‘Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants'中的方法,兩天后在正常光周期的培養(yǎng)室條件下將轟擊后的葉片培植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基。(xvi)按照SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S于2001年提交的專禾[I'Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants'中公布的方法,使轟擊后的葉片培植體中出現(xiàn)了萌芽再生。(xvii)每15天后,在含有卡那霉素(250-1lOOug/ml)的選擇培養(yǎng)基中選擇假定的轉(zhuǎn)化株。(xviii)利用SandalI,BhattacharyaA,AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1):75-80(2001)SandalI,BhattacharyaA,AhujaP.S.2001中的液態(tài)培養(yǎng)基使假定的轉(zhuǎn)化株的萌芽生長(zhǎng)和繁殖。(xix)按照常規(guī)的PCR和Southern雜交方法對(duì)采用250-1100ug/ml卡那霉素選擇出的轉(zhuǎn)基因植物的GUS陽(yáng)性組織進(jìn)行鑒定。茶葉培植體的最大瞬時(shí)表達(dá)的參數(shù)的優(yōu)化如表1所示。為了通過基因槍來(lái)成功制備轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,有必要使影響基因槍的所有不同參數(shù)最佳組合,從而(a)增加最大粒子穿透的表面積,(b)達(dá)到最小細(xì)胞損傷/傷害,以及(iii)使再生效率最大化。已經(jīng)在幾種農(nóng)作物中報(bào)道了根據(jù)組織的質(zhì)地(堅(jiān)硬或柔軟)以及物質(zhì)來(lái)源(屬或種)采用一種或兩種參數(shù)來(lái)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。但是,本發(fā)明的新穎性在于開發(fā)出了一種能影響基因槍成功的包含所有參數(shù)的檢測(cè)臺(tái),它能被廣泛應(yīng)用。在檢測(cè)臺(tái)的這些354種組合的幫助下(包含破裂盤的脈沖壓、大載體飛行距離、靶距離和間隔距離的組合),可成功進(jìn)行任何的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)而無(wú)需考慮種、作物、或者組織。采用滲壓劑(osmoticum)預(yù)處理以及濃縮DNA能夠進(jìn)一步增加轉(zhuǎn)化效率。以不含激素的液態(tài)基石出MS(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497;1962)培養(yǎng)基或者0.25M山梨糖醇預(yù)處理4小時(shí)不僅能使茶葉培植體的質(zhì)地堅(jiān)韌,因而能夠使它們?cè)谠偕囵B(yǎng)基上平展從而能夠?yàn)檗Z擊提供更大的表面積同時(shí)具有最小的損傷,而且還能夠使由于粒子穿透造成的損傷愈合。一般地,由于在轟擊前用滲透劑進(jìn)行處理能夠使靶細(xì)胞胞漿溶解,因此能夠明顯增加瞬時(shí)表達(dá)。胞漿溶解阻止了原生質(zhì)從細(xì)胞中的擠出,進(jìn)一步降低了接下來(lái)轟擊過程中粒子穿透造成的細(xì)胞傷害VainP,McMullenM.D.,FinerJ.J,1993Osmotictreatmentenhancesparticlebombardmentmediatedtransientandstabletransformationofmaize.PlantCellRep12,84_880組織預(yù)處理增加了DNA復(fù)制,結(jié)果使DNA高水平插入至基因組中。金粒從停止屏來(lái)回移動(dòng)至靶組織的路徑通常為圓錐形。因此,為使金粒最大分散,需要使該圓錐體的基底表面積與排列待轟擊的培植體的再生培養(yǎng)基上的同心圓相重合。因此設(shè)計(jì)了一種在透明聚乙烯膜上畫具有不同直徑(2.0-9.0cm)的同心圓的方法,其中最外層圓的直徑與9.Ocm的培養(yǎng)皿的直徑相同。通過將含有靶組織的培養(yǎng)皿放置于這些圓上并通過在轟擊后通過GUS檢測(cè)瞬時(shí)表達(dá),發(fā)現(xiàn)直徑2.Ocm的同心圓具有最佳效果。這就是為什么當(dāng)茶葉培植體置于該區(qū)域內(nèi)能夠達(dá)到最大粒子穿透的原因。當(dāng)增加了破裂盤的脈沖壓時(shí),由于氣體震動(dòng)以及高粒子分散,因而使得微射彈速度增加了組織損傷,從而得到低瞬時(shí)基因表達(dá)。該缺陷可通過增加靶距離或者在粒子分散時(shí)使組織與停止屏保持較遠(yuǎn)距離來(lái)避免。在說明書的附圖中圖la.b.c.代表茶葉植物的葉片培植體;圖ld-r代表不同的轉(zhuǎn)化葉片培植體表現(xiàn)的gus表達(dá)。下面提供的實(shí)施例用于解釋本發(fā)明,而并非對(duì)本發(fā)明做出限制。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1體外培養(yǎng)植物的葉片培植體用基礎(chǔ)MS(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497;1962)培養(yǎng)基和諸如單獨(dú)的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇、甘露醇和山梨糖醇的組合等不同濃度的滲透劑處理不同時(shí)間(2-8小時(shí))。排列處理后的培植體,使近軸表面在9.Ocm培養(yǎng)皿不同同心圓(2.0-5.0cm)內(nèi)的再生培養(yǎng)基的上部,從而優(yōu)化DNA包被的微射彈的傳播模式。為了轟擊,將0.5-1.5ml金粒分別用70%乙醇和無(wú)菌水洗滌3次后,取0.5-1.5ml金粒懸浮于無(wú)菌蒸餾水中,然后將25_60ul的懸浮液分散于1.5ml的Eppendorf管中。為制備DNA混合物取50ul金懸浮液,與IOul不同濃度的質(zhì)粒DNA(0.5-5ug/ul)、40_50ul的1.5-3.5MCaCl2以及10_50ul的0.5-2.OM不含亞精胺的磷酸鹽混合。不時(shí)震蕩攪拌懸浮液,然后在500-1100rpm離心5_20秒,接下來(lái)移去上清,用70%乙醇洗滌,最后用50-100ul的100%乙醇懸浮。在無(wú)菌大載體(BioRad)上通過迅速震蕩使IOul金粒懸浮液和DNA進(jìn)行包被。然后用Helium動(dòng)力粒子傳輸系統(tǒng)PDS-1000/He(Bio-Rad)對(duì)葉片培植體進(jìn)行轟擊,小室壓力為25英寸汞柱,具有354種組合、0.6-1.6um的金粒以及1、2和4ug/ul濃度的DNA,通過將培養(yǎng)盤旋轉(zhuǎn)180°C而改變其方向后,對(duì)每一圓盤轟擊兩次。將轟擊后的培植體在再生培養(yǎng)基上上下倒轉(zhuǎn),背軸面向上。在培養(yǎng)室的條件下將轟擊后的葉片培植體于暗處培養(yǎng)兩天,按照J(rèn)effersonRA(1987)Assayingchimericgenesinplants:TheGUSgenefusionsystem,PlantMolBiolRep5:389_405.中的方法檢測(cè)GUS的表達(dá),然后在SandalI,BhattacharyaA,SharmaΜ,AhujaP.S.于2001年提交的專利‘Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants'所公開的再生培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。最后,每15天后,在含有卡那霉素(250-1lOOug/ml)的選擇培養(yǎng)基中選擇源于愈傷組織的葉。按照常規(guī)的PCR和Southern雜交方法對(duì)采用250-1100ug/ml卡那霉素選擇出的轉(zhuǎn)基因植物的⑶S陽(yáng)性組織進(jìn)行鑒定。實(shí)施例2體外培養(yǎng)植物的葉片培植體用不同濃度的滲透劑處理,然后按照上述方法利用基因槍進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)施例3不同栽培變種(Clzinary,CambodandAssamica)植物的葉片培植體用不同濃度的滲透劑處理,然后按照上述方法利用基因槍進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。實(shí)施例4按照上述方法利用基因槍對(duì)諸如細(xì)胞胚芽、合子胚、以及胚胎發(fā)育形成的愈傷組織等不同的培植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。本方法的新穎性在于發(fā)展出了含有354種組合的檢測(cè)板,其保證了基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的成功,而無(wú)需考慮組織、培植體、或者物種的不同。本發(fā)明方法所具有的一些新特性如下所述1.本發(fā)明首次使用不含激素的基礎(chǔ)MS(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473-497;1962)來(lái)代替滲壓劑(osmoticum),這避免了已知在滲透劑中需要的繁重、昂貴的預(yù)處理步驟。2.在一透明的聚乙烯膜上畫不同直徑(2.0-9.Ocm)的同心圓,其中最外圈圓的直徑與9.Ocm培養(yǎng)皿的直徑相同,這樣使得在轟擊前放置靶組織的精確面積就是已知的。而且,這使得粒子穿透的面積最大化。3.首次用水而不是用甘油來(lái)懸浮金粒,從而克服了將DNA上樣到大載體上時(shí)殘留甘油的抑制作用。4.由于轟擊后通過將葉上下翻轉(zhuǎn),因此粒子穿透造成的損傷能夠快速愈合。這使得損傷位點(diǎn)與培養(yǎng)基相接觸,并導(dǎo)致快速的再生反應(yīng)。5.反應(yīng)性葉片培植體,即,所形成的葉愈傷組織采用高濃度的、即500或IOOOug/ml的卡那霉素進(jìn)行選擇,以避免任何的“野生”并保證高比率的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株(95-100%)。本發(fā)明首次報(bào)道了采用高至lOOOug/ml的卡那霉素來(lái)選擇轉(zhuǎn)化株。6.本方法還保證了健康轉(zhuǎn)化茶葉萌芽的產(chǎn)生。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物對(duì)諸如皰疫病等真菌疾病具有抗性,從而避免了50%的作物損失。2)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物對(duì)諸如細(xì)菌芽病(bacterialshoot)等細(xì)菌性疾病具有抗性。3)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物對(duì)病毒性疾病具有抗性。4)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物對(duì)諸如昆蟲、牧草蟲以及螨蟲等茶葉抗性害蟲具有抗性。5)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物對(duì)諸如草柑膦、2,4-D百草枯以及敵草隆等除草劑和諸如阿特拉津及oxyflurfon等出土前施用的除草劑具有抗性。6)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物通過(i)過度表達(dá)能增加氧自由基捕捉的酶的基因,(ii)增加諸如甘露醇、脯氨酸、果聚糖、糖膠_甜菜堿(gycine-betaine)等(Bonhertetal.,1996;Hayashietal.,1997)滲透劑的成分,(iii)增加細(xì)胞膜的彈性,以及(iv)對(duì)諸如LEA蛋白、脫水蛋白、防凍蛋白(AFPs)、熱休克蛋白(HSPs)等應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白以及諸如VHb蛋白等低氧和缺氧誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)進(jìn)行操縱,從而對(duì)不同的應(yīng)力具有抗性。7)產(chǎn)生對(duì)諸如青草以及闊葉草等雜草具有抗性的轉(zhuǎn)基因茶葉。8)產(chǎn)生很少或沒有冬眠的轉(zhuǎn)基因茶葉。9)在特定啟動(dòng)子的控制下生成表達(dá)APETALA或者LEAFY等基因的轉(zhuǎn)基因植物,從而使之產(chǎn)生更多的具有生長(zhǎng)力的萌芽。10)在適宜啟動(dòng)子的作用下生成編碼RUBPcase的轉(zhuǎn)基因茶葉基因,從而促進(jìn)光合作用的速率。11)通過表達(dá)光敏色素基因生成轉(zhuǎn)基因茶葉使之能夠密集種植并具有易于采摘的良好茶葉平臺(tái)。11)生成具有更高產(chǎn)率和好的杯中品質(zhì)的茶葉植物。12)利用基因槍產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因優(yōu)化植物在提高質(zhì)量和產(chǎn)率方面的改進(jìn)。13)脫咖啡因轉(zhuǎn)基因茶葉植物的生成。14)利用諸如索馬甜以及植物血凝素等基因來(lái)制備具有甜味茶樹葉的轉(zhuǎn)基因茶葉植物。15)提供了一種基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,該方法具有高比率的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物,而無(wú)需考慮種屬、作物種類、組織、以及培植體等等。16)克服了基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟中的一些問題。表1茶葉葉片移植物中最大瞬間時(shí)表達(dá)的參數(shù)優(yōu)化權(quán)利要求轉(zhuǎn)基因茶葉的制備方法,所述方法包括以下步驟(i)用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基(MurashigeT.andSkoogF.Arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.Physiol.Plant.15473497;1962)以及不同濃度的滲透劑處理葉片培植體,處理時(shí)間在2至8小時(shí)之間;(ii)在透明聚乙烯膜上畫出多個(gè)同心圓,其中最外層圓的直徑與9.0cm培養(yǎng)皿的直徑相同;(iii)在9.0cm培養(yǎng)皿的直徑為2.05.0cm的不同同心圓內(nèi)的再生培養(yǎng)基上排列葉片培植體使其近軸面向上,從而使DNA包被的微射彈以最大速度發(fā)射;(iv)分別用70%乙醇和蒸餾水洗滌3次對(duì)金粒進(jìn)行消毒后,將0.51.5ml的金粒懸浮于無(wú)菌蒸餾水中;(v)對(duì)于每次的轟擊,使用分散在1.5ml的Eppendorf管中的2560ul上述懸浮液;(vi)將50ul的金懸浮液與10ul不同濃度的質(zhì)粒DNA(0.55ug/ul)、4050ul的1.53.5MCaCl2和1050ul的0.52.0M不含亞精胺的磷酸鹽進(jìn)行混合;(vii)不時(shí)震蕩攪拌上述懸浮液,在5001100rpm離心520秒,接下來(lái)移去上清,用70%乙醇洗滌,最后用50100ul的100%乙醇懸??;(viii)在無(wú)菌大載體(BioRad)上通過迅速震蕩使10ul金粒懸浮液和DNA進(jìn)行包被;(ix)形成354組合,其包含(a)間隔距離或在破裂盤和大載體之間的距離(單獨(dú)為1/43/8英寸,及其組合),(b)大載體飛行距離或大載體和停止屏之間的距離(616mm),(c)靶距離或微射彈停止屏和靶組織之間的距離(612cm),破裂圓盤的脈沖壓(6501350psi)用于增加最大粒子穿透的表面積,從而達(dá)到最小細(xì)胞損傷/傷害以及最大再生效率;(x)由小室壓力為25英寸汞柱的Helium動(dòng)力粒子傳輸系統(tǒng)PDS1000/He(BioRad),使用0.61.6um的金粒,以及1、2和4ug/ul濃度的DNA以及上述的354組合對(duì)葉片培植體進(jìn)行轟擊;(xi)通過將培養(yǎng)盤旋轉(zhuǎn)180°而改變其方向后,對(duì)每一圓盤轟擊兩次;(xii)將轟擊后的培植體在再生培養(yǎng)基上上下倒轉(zhuǎn),背軸面向上,使受到轟擊后的表面與再生培養(yǎng)基接觸,從而使其快速愈合;(xiii)在培養(yǎng)室的條件下將轟擊后的葉片培植體于暗處培養(yǎng)兩天;(xiv)利用JeffersonRA(1987)AssayingchimericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem,PlantMolBiolRep5389405中的GUS檢測(cè)方法,檢測(cè)轟擊后的培植體中的瞬時(shí)表達(dá),籍此檢測(cè)粒子穿透的最大傳播;(xv)按照SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S于2001年提交的專利.′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中的方法,兩天后在正常光周期的培養(yǎng)室條件下將轟擊后的葉片培植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基;(xvi)按照SandalI,BhattacharyaA,SharmaM,AhujaP.S于2001年提交的專利′Anefficientmethodformicropropagationoftea(Camelliasinensis)plantsusingleafexplants′中公布的方法,使受到轟擊后的葉片培植體中產(chǎn)生萌芽再生;(xvii)每15天后,在含有2501100ug/ml卡那霉素的選擇培養(yǎng)基中選擇假定的轉(zhuǎn)化株;(xviii)利用SandalI,BhattacharyaA,AhujaP.S.AnefficientliquidculturesystemforteashootproliferationPlantCellTissueOrganCulture65(1)7580(2001)SandalI,BhattacharyaA,AhujaP.S.2001中的液態(tài)培養(yǎng)基使假定轉(zhuǎn)化株的萌芽生長(zhǎng)和繁殖;(xix)按照常規(guī)的PCR和Southern雜交方法對(duì)采用2501100ug/ml卡那霉素選擇出的轉(zhuǎn)基因植物的GUS陽(yáng)性組織進(jìn)行鑒定。2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中步驟⑴中使用的所述滲透劑為單獨(dú)的蔗糖、肌醇、山梨糖醇、甘露醇或甘露醇和山梨糖醇的組合。3.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述步驟(i)中的葉片培植體選自Chinary,Cambod以及Assamica的栽培變種。4.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在所述步驟⑴中利用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基和不同的滲透劑來(lái)處理體外培養(yǎng)植物的葉片培植體。5.如權(quán)利要求4所述的方法,其中所述不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基是不含激素的全濃度MS培養(yǎng)基。6.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在所述步驟⑴中利用不含激素的液態(tài)基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基處理葉片培植體4小時(shí)。7.如權(quán)利要求1所述的方法,其中將培植體排列在再生培養(yǎng)基上9cm培養(yǎng)皿的2.0的同心圓內(nèi)。8.如權(quán)利要求1所述的方法,其中在所述步驟(vi)中的質(zhì)粒DNA是pRT99GUS。9.如權(quán)利要求1所述的方法,其中種植約1.Ocm長(zhǎng)的健康轉(zhuǎn)基因植株,并在不含卡那霉素的液態(tài)繁殖培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)。10.由上述權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因茶葉外植體。全文摘要本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因茶葉的制備方法以及由此制備的轉(zhuǎn)基因茶葉(camelliasinensis(L.)O.Kuntze)。更具體地,本發(fā)明公開了影響基因槍的參數(shù)的354種不同組合,從而達(dá)到(i)增加表面積以使最多的粒子穿過,(ii)最小程度的細(xì)胞傷害/損傷,以及(iii)最大程度的再生效率的目的。文檔編號(hào)A01H1/00GK101974564SQ20101015691公開日2011年2月16日申請(qǐng)日期2003年1月21日優(yōu)先權(quán)日2002年1月22日發(fā)明者因德拉·桑達(dá)爾,帕拉姆維爾·辛格·阿胡賈,阿米塔·巴塔查里亞申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)
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