專利名稱：一種水溞顯微玻片標本的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物標本制作，具體涉及一種永久性水潘顯微玻片標本的制作方法。
背景技術(shù)：
目前所用顯微玻片標本的整體制片法有1、暫時和半永久性制片法，包括甘油法、甘油膠凍法和乳酸_苯酚法；2、永久性整體制片法，包括威尼斯松節(jié)油法、叔丁醇樹膠法和二氧六環(huán)樹膠法等；3、對較大昆蟲的琥珀標本制作法等。但對于大型潘、劍水潘等水潘材料作為整體標本，可不需脫水，直接用甘油膠封片，這樣操作過程簡單，但存在一些問題，甘油膠干燥時間長、且易滑動，造成標本的移位。同時對于水潘來說身體透明，通過顯微鏡能直接觀察到身體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但一般情況下觀察不清楚，需二甲苯進行透明后再進行封片。封片常采用加拿大樹膠或中性樹脂，雖然它們的透光度、阻斷紫外線、折射等技術(shù)參數(shù)符合生物顯微玻片標本封固的要求，但是其體內(nèi)的腸道、卵巢、動眼肌等細微結(jié)構(gòu)難以分辨。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種既能保持標本的形態(tài)，又能清楚的觀察到體內(nèi)細微結(jié)構(gòu)的水潘顯微玻片標本的制作方法。
本發(fā)明提供的一種水潘顯微玻片標本的制作方法，包括如下步驟
1)將水潘用固定液固定、單染、分色、乙醇逐級脫水； 2)將脫水后水潘體內(nèi)的乙醇用丙酮逐級置換，即將水潘體內(nèi)的乙醇經(jīng)35%丙酮—50%丙酮一75%丙酮一85%丙酮一95%丙酮一無水丙酮一無水丙酮一無水丙酮置換，每個梯度15-20分鐘； 3)將丙酮置換后的水潘用吸管吸出滴在載玻片上，滴加聚甲基丙烯酸酯進行封
片；所述的聚甲基丙烯酸酯的配比為 甲基丙烯酸甲酯5-10ml 甲基丙烯酸丁酯90-95ml 硬脂酸 0.5-lml 過氧化丙酮甲酰0. 5-lg 偶氮異丁腈 0.5-lg。 由于聚甲基丙烯酸酯在聚合前后體積變化較大，對細胞結(jié)構(gòu)有一定損傷，需要進行預(yù)聚合。在使用前將原料按上述的比例混合后，在70-8(TC水浴中邊加熱邊搖動，使其聚合成甘油樣的粘稠狀，氣泡逐漸減少，待冷卻后，粘度可稍增加，即可用于封片。封好片后放在50-60。C烘箱里24-36小時即可。 所述的固定是將活的水潘置于固定液中1-2小時。所述的固定液為Bouin's固定
液、70 %乙醇溶液或4 %中性甲醛溶液。 所述的單染為硼砂洋紅染色，染色1天。 所述的分色，是將染色后的水潘用鹽酸-酒精進行分色。也可以在乙醇逐級脫水
3過程中，從35% _75%乙醇中滴加l-2滴鹽酸即可。 所述的乙醇逐級脫水，是將固定后的水潘經(jīng)過35%乙醇一45%乙醇一55%乙醇—75%乙醇一85%乙醇一95%乙醇一無水乙醇(無水乙醇3次)(每個梯度15-20分鐘)，這樣可使水潘體內(nèi)的水分逐漸被乙醇所替換。 所述的步驟1)可以是將水潘用固定液固定、鉻礬氰寧染色、分色、橙黃G染色、乙醇逐級脫水；所述的鉻礬氰寧染色，染色時間為l-4小時，鉻礬氰寧配比為氰寧O. 1-0. 4g，鉻砜3-5g，45X冰醋酸100ml ;橙黃G染色，用95 %乙醇配置飽和橙黃G染液，染色時間為1-2小時。 在固定、染色、脫水、置換過程中，可用真空泵進行抽真空，可加快反應(yīng)的速度，縮短時間。 本發(fā)明顯微玻片標本的制作方法也可用于魚卵、小型浮游生物等的顯微玻片標本制作。 本發(fā)明與已有的技術(shù)相比具有以下特點(1)、對水潘整體進行單染(硼砂洋紅)和復(fù)染(鉻礬氰寧-橙黃G)，器官、組織和細胞結(jié)構(gòu)明顯。(2)、通過乙醇逐級脫水不會引起組織和細胞的收縮，故不會導(dǎo)致水潘變形。(3)標本經(jīng)丙酮置換后，折射率改變，透明度提高，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清楚。(4)采用聚甲基丙烯酸酯進行封片，使標本的透明度增高，干燥的時間縮短。
具體實施方式
實施例1 固定將活的水潘置于70%的乙醇水溶液中進行麻醉和固定。
單染硼砂洋紅浸染1天。
分色鹽酸_酒精分色，即70%乙醇中滴加1-2滴鹽酸，直至無染料落下為止。
乙醇逐級脫水85%乙醇一95%乙醇一無水乙醇脫水(無水乙醇3次)(每個梯度15分鐘)。 置換將脫水后水潘體內(nèi)的乙醇經(jīng)35%丙酮一50%丙酮一75%丙酮一85%丙酮—95%丙酮一無水丙酮置換(無水丙酮3次)(每個梯度15分鐘)。 封片將丙酮中的水潘用吸管吸出直接放到干凈的載玻片上，稍微蒸發(fā)后，滴加
1、2滴經(jīng)過預(yù)聚合的甲基丙烯酸酯，仔細覆蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，封好片后放在60°C
烘箱里36小時，取出即制得水潘顯微玻片標本。 聚甲基丙烯酸酯的配比為 甲基丙烯酸甲酯5ml 甲基丙烯酸丁酯95ml 硬脂酸 0. 7ml 過氧化丙酮甲酰0.6g 偶氮異丁腈0. 7g。 實施例2 固定將活的水潘置于Bouin' s固定液1小時。
染色先進行鉻砜氰寧染色，染色3小時。
分色鹽酸-酒精分色。 乙醇逐級脫水經(jīng)過35%乙醇一45%乙醇一55%乙醇一75%乙醇一85%乙醇
—95%乙醇一無水乙醇一無水乙醇一無水乙醇脫水，每個梯度20分鐘。 復(fù)染在脫水到95X乙醇時，配制飽和橙黃G乙醇溶液，浸染1小時。 置換將脫水后水潘體內(nèi)的乙醇經(jīng)過35%丙酮一50%丙酮一75%丙酮一85%丙
酮一95%丙酮一無水丙酮一無水丙酮一無水丙酮置換，每個梯度15分鐘。 封片將丙酮中的水潘用吸管吸出直接放到干凈的載玻片上，稍微蒸發(fā)后，滴加
1、2滴經(jīng)過預(yù)聚合的甲基丙烯酸酯，仔細覆蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，封好片后放在50°C
烘箱里24小時，取出即制得水潘顯微玻片標本。 聚甲基丙烯酸酯的配比為 甲基丙烯酸甲酯10ml 甲基丙烯酸丁酯90ml 硬脂酸 0. 9ml 過氧化丙酮甲酰0. 5g 偶氮異丁腈0. 6g。 實施例3 將活的水潘置于4%中性甲醛溶液中進行固定，其余同實施例2，制得水潘顯微玻片標本。 將實施例1、2和3制得的水潘顯微玻片標本分別在光學(xué)顯微鏡下觀察，水潘的細胞界線明顯，腸道、卵巢等結(jié)構(gòu)觀察得更為清楚，而且透明度好。
權(quán)利要求
一種水溞顯微玻片標本的制作方法，其特征在于，包括如下步驟1)將水溞用固定液固定、單染、分色、乙醇逐級脫水；2)將脫水后水溞體內(nèi)的乙醇用丙酮逐級置換；3)將丙酮置換后的水溞用吸管吸出滴在載玻片上，滴加聚甲基丙烯酸酯進行封片，得到水溞顯微玻片標本；所述的聚甲基丙烯酸酯的配比為甲基丙烯酸甲酯5-10ml甲基丙烯酸丁酯90-95ml硬脂酸0.5-1ml過氧化丙酮甲酰0.5-1g偶氮異丁腈0.5-1g。
2 如權(quán)利要求1所述的一種水潘顯微玻片標本的制作方法，其特征在于，所述的固定 液為Bouin' s固定液、70%乙醇溶液或4%中性甲醛溶液。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種水潘顯微玻片標本的制作方法，其特征在于，所述的單染 為硼砂洋紅染色。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種水潘顯微玻片標本的制作方法，其特征在于，所述的聚甲 基丙烯酸酯，是在使用前按權(quán)利要求1所述的聚甲基丙烯酸酯原料比例混合后，在70-80°C 水浴中邊加熱邊搖動，使其聚合成甘油樣的粘稠狀。
5. 如權(quán)利要求1、2或4所述的一種水潘顯微玻片標本的制作方法，其特征在于，所述的 步驟1)是將水潘用固定液固定、鉻礬氰寧染色、分色、橙黃G染色、乙醇逐級脫水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水溞顯微玻片標本的制作方法，先將水溞用固定液固定、單染或復(fù)染、分色、乙醇逐級脫水；再將脫水后水溞體內(nèi)的乙醇用丙酮逐級置換；最后將丙酮置換后的水溞用吸管吸出滴在載玻片上，滴加經(jīng)過預(yù)聚合的聚甲基丙烯酸酯進行封片，得到水溞顯微玻片標本；這種方法制得的水溞顯微玻片標本不僅使水溞的細胞界線明顯，腸道、卵巢等結(jié)構(gòu)觀察得更為清楚，而且透明度增加，晾干的時間縮短。
文檔編號A01N1/00GK101790975SQ201010136398
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者姜美玲, 張小民, 武玉瓏, 王蘭, 王茜 申請人:山西大學(xué)