專利名稱：一種高效快速的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種甘蔗轉(zhuǎn)基因育種方法，具體是一種高效快速的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法。

背景技術(shù)：
甘蔗是全世界最為重要的糖料經(jīng)濟作物，也是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的糖料經(jīng)濟作物。目前我國是世界第三大產(chǎn)糖國，2008/2009榨季全國總產(chǎn)糖量達到1243萬噸，其中甘蔗糖占總產(chǎn)糖量的94％。近年來甘蔗還發(fā)展成為一種重要的能源作物，是生產(chǎn)綠色燃料——酒精的重要原料。
由于現(xiàn)代甘蔗栽培種是甘蔗屬熱帶種，割手密和印度種等物種的種間雜交種，在長期的高貴化育種過程中，減數(shù)分裂的異常使得現(xiàn)代甘蔗栽培種形成大量的非整倍體，其染色體數(shù)量多、基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜、在同株中染色體倍數(shù)不同，同時由于甘蔗對光周期反應(yīng)敏感，許多重要親本在亞熱帶和溫帶地區(qū)很難開花，即使開花花粉數(shù)量也不足，而且經(jīng)常與近緣植物的花期不遇，這給常規(guī)的抗逆育種帶來許多困難。因此基因工程轉(zhuǎn)基因技術(shù)成了甘蔗品種遺傳改良的重要途徑。
目前甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)主要有基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。早期甘蔗轉(zhuǎn)基因植株的獲得主要是采用基因槍轉(zhuǎn)化法，但該法轉(zhuǎn)化效率較低，嵌合體比較多，外源基因插入拷貝數(shù)比多，遺傳穩(wěn)定性比較差，轉(zhuǎn)化成本高。1998年以來，世界多個實驗室采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，獲得很多種轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的優(yōu)點在于外源基因插入的拷貝數(shù)低，對受體傷害小，而且實現(xiàn)了大片段DNA的轉(zhuǎn)化。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化過程中，乙酰丁香酮的正確采用雖然大幅提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率，但其轉(zhuǎn)化效率約為3％，還是不能滿足轉(zhuǎn)基因工程的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展需求，而且農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化中仍然存在不足(1)在甘蔗愈傷組織的采用上一直沿襲著早期基因槍轉(zhuǎn)化法的愈傷繼代誘導(dǎo)方式，愈傷本身分化效率偏低，直接影響了最后的轉(zhuǎn)化效率；(2)在農(nóng)桿菌與愈傷組織共培養(yǎng)后，很難將農(nóng)桿菌徹底清除干凈，導(dǎo)致分化培養(yǎng)與再生培養(yǎng)時期污染嚴重；(3)通常采用共培養(yǎng)后愈傷組織分化期即進行篩選，但因甘蔗愈傷組織分化的芽較小，抗性芽很難長高，導(dǎo)致在更換培養(yǎng)基過程中很難將抗性芽與被篩選劑殺死的芽區(qū)分開來。(4)轉(zhuǎn)化時間較長，達6個月以上。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服原有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不足而提供一種高效快速的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，通過改變轉(zhuǎn)化模式，大大提高了轉(zhuǎn)化效率，縮短了轉(zhuǎn)化的時間，節(jié)約了轉(zhuǎn)化的成本。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案 一種高效快速的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，包括甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程，農(nóng)桿菌的活化及胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程，胚性愈傷組織的分化再生及篩選過程，轉(zhuǎn)化小植株DNA/RNA微量提取及PCR與RT-PCR鑒定過程 1、甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程以優(yōu)良甘蔗栽培種的頂端生長點處的幼葉組織為外植體，外植體經(jīng)消毒、無菌水沖洗、無菌濾紙吸干其表面的水分后切成薄片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于避光條件下進行培養(yǎng)至誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加1-2mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠。
2、農(nóng)桿菌的活化及胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程將含有目的基因的農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種到活化培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，通過離心回收菌體，再重懸于等體積vir基因誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌質(zhì)粒vir基因的表達，此菌液即為轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌工程菌液；將甘蔗胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌液中，浸泡后再接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上于黑暗條件下共培養(yǎng)，然后接種于分化培養(yǎng)基上。所述活化培養(yǎng)基是以YEP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加相應(yīng)抗生素Kan 50μg/mL，Str50μg/mL，Rif 50μg/mL。所述vir基因誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素修改為原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮。所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素修改為原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮、卡拉膠20g/L。所述分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加1mg/L6-BA、0.2mg/LKT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠。
3、胚性愈傷組織的分化再生及篩選過程將接種于分化培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織置于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)至胚狀體形成，然后將胚狀體更換到生芽培養(yǎng)基上，繼續(xù)置于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)產(chǎn)生小芽，然后將小芽轉(zhuǎn)接到成苗培養(yǎng)基上，1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)至長成小苗，將長成0.5cm-3cm的小苗轉(zhuǎn)接到抗性培養(yǎng)基上于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)18-25天獲得抗性植株，將抗性植株單株單瓶按編號培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基上進行抗性植株的生根壯苗培養(yǎng)18-25天。所述生芽培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠。所述成苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠。所述抗性培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠。所述壯苗生根培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠、50-100ml/L椰子汁。
4、轉(zhuǎn)化小植株DNA/RNA微量提取及PCR與RT-PCR鑒定過程按編號剪取單株單瓶培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基上的抗性植株的葉片，剪碎后置于液氮中冷凍3-8秒，研碎，用CTAB法提取DNA，然后進行PCR檢測。經(jīng)PCR檢測為陽性的植株用同樣的方法提取RNA進行RT-PCR檢測。最后將PCR及RT-PCR檢測均呈陽性的植株從培養(yǎng)基中取出洗凈煉苗后移栽到大棚。
本發(fā)明對甘蔗進行遺傳轉(zhuǎn)化的實驗，所獲數(shù)據(jù)列表如下 甘蔗轉(zhuǎn)化效果數(shù)據(jù) *注篩選效率＝檢測陽性植株數(shù)量/篩選抗性植株數(shù)量 轉(zhuǎn)化效率＝檢測陽性植株數(shù)量/使用愈傷數(shù)量 從以上數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明在甘蔗轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域?qū)⒏收徂r(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化效率提高到20％左右，大大優(yōu)先于先前的3％；篩選效率達到了90％，轉(zhuǎn)化時間也從原來的半年縮短到4個月左右。
本發(fā)明以甘蔗頂端生長點處的幼葉組織作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織，作為農(nóng)桿菌侵染的受體材料，通過先分化培養(yǎng)，后進行高濃度的PPT篩選，獲得抗性植株后，采用創(chuàng)新的DNA、RNA微量提取技術(shù)，提取抗性苗的DNA/RNA，然后進行PCR、RT-PCR檢測，經(jīng)PCR、RT-PCR檢測為陽性的植株再移栽到大棚，待植株長大后再進行其它的分子與生理生化的檢測。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明可大幅度提高轉(zhuǎn)化效率，縮短轉(zhuǎn)化的時間，只需4個月就可得到PCR、RT-PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，也降低了轉(zhuǎn)化成本。

具體實施例方式 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
本發(fā)明包括甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程，農(nóng)桿菌的活化及對甘蔗胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程，轉(zhuǎn)化后胚性愈傷組織的分化再生及篩選過程，轉(zhuǎn)化小植株DNA、RNA微量提取及PCR與RT-PCR鑒定過程。
下面的實施例為利用本實驗室構(gòu)建好的植物表達載體PCBI1900對甘蔗胚性愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化。
具體操作過程如下 1、胚性愈傷組織的誘導(dǎo) 以優(yōu)良甘蔗栽培品種(ROC22)為轉(zhuǎn)化受體材料，選田間生長健壯植株，取其尾稍部分逐層剝?nèi)ネ獠坷先~，取其距頂端生長點約10cm左右的幼葉組織作為外植體，先用75％的乙醇浸泡30s后，再用0.1％的升汞處理12min，后用無菌水洗3～4次，用無菌的濾紙吸干水分，再小心剝?nèi)プ钔庖粚尤~片組織，然后將其橫切成0.2～0.5mm厚的薄片并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)20-30天，即可長出胚性愈傷組織，可直接用于轉(zhuǎn)化。
2、農(nóng)桿菌工程菌液的制備 將經(jīng)PCR鑒定的農(nóng)桿菌在含相應(yīng)抗生素的YEP平板上劃線，挑取單菌落接種到活化培養(yǎng)基中，于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約24h)，再于150mL三角瓶中擴大培養(yǎng)到100mL含有相同抗生素的YEP培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD為0.3-1.5左右(10h)，將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃，5000rpm離心5min，棄上清，吸干殘液，用等體積(100mL)的vir基因誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，再置于28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1-3h，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的表達，此菌液即為轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌工程菌液。
3、農(nóng)桿菌菌液浸染甘蔗胚性愈傷組織及共培養(yǎng) 將甘蔗胚性愈傷組織置于準備好的農(nóng)桿菌工程菌液中浸泡約30-40min，期間用無菌鑷子輕輕攪動胚性愈傷組織。之后，用無菌漏勺濾去菌液，然后將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到濾紙上，在超凈工作臺中晾干，直至材料表面干爽、無水膜，再把材料組織塊切成0.3-0.5cm的小塊轉(zhuǎn)接到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，22℃左右黑暗共培養(yǎng)3-4d。共培養(yǎng)后用含Car200mg/L的無菌水洗滌胚性愈傷組織一次，再用無菌水洗2-3次，最后再用MS液體培養(yǎng)基洗一次，置于無菌濾紙上在超凈工作臺中吹晾到材料干爽后，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有Car200mg/L的分化培養(yǎng)基上，28℃光下培養(yǎng)。
4、農(nóng)桿菌浸染后的胚性愈傷組織分化成苗 將接種于分化培養(yǎng)基的胚性愈傷組織置于28℃，1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)兩周即可分化出胚狀體，再將胚狀體轉(zhuǎn)接到生芽培養(yǎng)基上，繼續(xù)置于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)以產(chǎn)生小芽，兩周后將小芽轉(zhuǎn)接到成苗培養(yǎng)基上，于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)三周左右使其長成小苗。
5、甘蔗轉(zhuǎn)化小植株的篩選 挑選0.5cm-3cm的小苗轉(zhuǎn)接到抗性培養(yǎng)基上于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)三周左右，將抗性小植株單株單瓶按編號培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基上進行抗性植株的生根壯苗培養(yǎng)3周即可長成根系發(fā)育良好的抗性植株。
6、抗性植株總DNA的微量提取 按編號用無菌剪刀剪取單株單瓶培養(yǎng)于M4培養(yǎng)基上的抗性植株葉片10-30mg，剪碎直接放入2.0mL離心管中，將離心管置于液氮中冷凍數(shù)秒，用玻璃棒將葉片組織搗碎，采用CTAB法微量提取抗性植株的DNA。
7、抗性植株的PCR檢測 以植物總DNA為模板，以植物表達載體pCBI 1900插入?yún)^(qū)域一基因設(shè)計引物，以pCBI1900質(zhì)粒DNA作正對照，以未轉(zhuǎn)化甘蔗的DNA為負對照，PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析并照相，回收PCR產(chǎn)物，并連接到pMD18-T載體上，測序并分析其序列與pCBI1900植物表達載體上該基因序列的同源性。
8、抗性植株的RNA提取 按編號用無菌剪刀剪取經(jīng)PCR檢測為陽性的植株葉片10-30mg，剪碎直接放入2.0mL離心管中(DEPC處理)，立即置于液氮中冷凍數(shù)秒后用玻璃棒搗碎，采用Trizo1法提取RNA。
9、抗性植株的RT-PCR檢測 以PCR陽性植株的RNA為模板進行RT-PCR檢測，引物與抗性植株P(guān)CR檢測相同，以pCBI 1900質(zhì)粒DNA作正對照，以未轉(zhuǎn)化甘蔗的DNA為負對照，RT-PCR產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析并照相。
10、轉(zhuǎn)化植株的移栽 將經(jīng)PCR和RT-PCR檢測均為陽性的植株移栽到溫室大棚。
權(quán)利要求
1.一種高效快速的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于包括甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程、農(nóng)桿菌的活化及胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程、胚性愈傷組織的分化再生及篩選過程、轉(zhuǎn)化小植株DNA/RNA微量提取及PCR與RT-PCR鑒定過程；
1)、甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)過程以優(yōu)良甘蔗栽培種的頂端生長點處的幼葉組織為外植體，外植體經(jīng)消毒、無菌水沖洗、無菌濾紙吸干其表面的水分后切成薄片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于避光條件下進行培養(yǎng)至誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加1-2mg/L 2，4-D、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠；
2)、農(nóng)桿菌的活化及胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化過程將含有目的基因的農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種到活化培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，通過離心回收菌體，再重懸于等體積vir基因誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)震蕩培養(yǎng)，以誘導(dǎo)農(nóng)桿菌質(zhì)粒vir基因的表達，此菌液即為轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌工程菌液；將甘蔗胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌液中，浸泡后再接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上于黑暗條件下共培養(yǎng)，然后接種于分化培養(yǎng)基上；所述活化培養(yǎng)基是以YEP為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加相應(yīng)抗生素Kan 50μg/mL，Str50μg/mL，Rif 50μg/mL；所述vir基因誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素修改為原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中大量元素修改為原含量的1/5，并添加1mg/L2.4-D、10mmol/L果糖、10mmol/L葡萄糖、30g/L蔗糖、100-150μmol/L乙酰丁香酮、卡拉膠20g/L；所述分化培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加1mg/L6-BA、0.2mg/LKT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠；
3)、胚性愈傷組織的分化再生及篩選過程將接種于分化培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織置于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)至胚狀體形成，然后將胚狀體更換到生芽培養(yǎng)基上，繼續(xù)置于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)產(chǎn)生小芽，然后將小芽轉(zhuǎn)接到成苗培養(yǎng)基上，1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)至長成小苗，將長成0.5cm-3cm的小苗轉(zhuǎn)接到抗性培養(yǎng)基上于1500lux，14h/d光照條件下培養(yǎng)18-25天獲得抗性植株，將抗性植株單株單瓶按編號培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基上進行抗性植株的生根壯苗培養(yǎng)18-25天；所述生芽培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加0.2mg/L6-BA、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠；所述成苗培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠；所述抗性培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠；所述壯苗生根培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加5mg/LIBA、250ul/LPPT、30g/L蔗糖、8g/L卡拉膠、50-100ml/L椰子汁；
4)、轉(zhuǎn)化小植株DNA/RNA微量提取及PCR與RT-PCR鑒定過程按編號剪取單株單瓶培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基上的抗性植株的葉片，剪碎后置于液氮中冷凍3-8秒，研碎，用CTAB法提取DNA，然后進行PCR檢測；經(jīng)PCR檢測為陽性的植株用同樣的方法提取RNA進行RT-PCR檢測；最后將PCR及RT-PCR檢測均呈陽性的植株從培養(yǎng)基中取出洗凈煉苗后移栽到大棚。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種高效快速的甘蔗轉(zhuǎn)基因方法，其是以甘蔗的幼葉組織作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織，胚性愈傷組織作為農(nóng)桿菌侵染的受體材料，通過先分化培養(yǎng)成胚狀體、小芽和小苗后再進行抗性轉(zhuǎn)化，獲得抗性轉(zhuǎn)化植株，然后提取抗性植株的DNA、RNA，進行PCR、RT-PCR檢測，經(jīng)PCR、RT-PCR檢測為陽性的植株再移栽到大棚，待長大后再進行其它一些分子與生理生化的檢測。本發(fā)明可大幅度提高轉(zhuǎn)化效率，縮短轉(zhuǎn)化的時間，只需4個月就可得到PCR、RT-PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，節(jié)約轉(zhuǎn)化成本，因先進行PCR、RT-PCR檢測后才移栽，減少了大量假抗性苗的移栽和管理，也降低了實驗成本。
文檔編號A01H5/00GK101768604SQ201010110668
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者張樹珍, 王文治, 馮翠蓮, 楊本鵬, 蔡文偉, 王俊剛, 熊國如, 吳濤 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所