專利名稱：一種柑桔的轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柑桔的轉(zhuǎn)基因方法。它主要應(yīng)用于柑桔類果樹的品種改良。
背景技術(shù)：
柑桔品種改良所應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因方法很多，主要有外源DNA直接轉(zhuǎn)化法和根癌農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。
外源DNA直接轉(zhuǎn)化法所使用的外植體為原生質(zhì)體，而柑桔類果樹中很多品種的原生 質(zhì)體培養(yǎng)周期長且再生困難，成本也較高，所以目前很少有實(shí)驗(yàn)室采用這種方法。
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法所使用的外植體很多，有無菌實(shí)生苗的上胚軸切段、子葉切塊、 成年樹莖段以及田間成年樹腋芽等。利用無菌實(shí)生苗的上胚軸切段、子葉切塊為外植體 的遺傳轉(zhuǎn)化頻率高，但獲得的轉(zhuǎn)基因植株要經(jīng)過漫長的童期才能開花結(jié)實(shí)。而以成年樹 莖段為外植體所獲得的轉(zhuǎn)基因植株可以避開童期，但其出芽率和轉(zhuǎn)化率極低。李衛(wèi)等在 《植物學(xué)報(bào)》上發(fā)表了《柑桔基因轉(zhuǎn)化新方法的研究》(1997， 39(8) :782-784),他們是 以田間成年樹腋芽為外植體，釆用附體腋芽轉(zhuǎn)化一離體擴(kuò)繁鑒定的方法轉(zhuǎn)化柑桔，所獲 得的轉(zhuǎn)化率為5.26%。但是這種方法在共培養(yǎng)過程中，需要不時(shí)的往棉球上添加出芽培 養(yǎng)基保濕3天，而且獲得轉(zhuǎn)基因植株需要走試管內(nèi)生根這一途徑。但柑桔一年只抽梢三 四次，因而在田間進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化易受季節(jié)限制，操作麻煩，而且柑桔類果樹試管內(nèi)生根 很困難，同時(shí)也帶來質(zhì)粒向環(huán)境釋放的安全性問題。
何永睿等在《熱帶作物學(xué)報(bào)》上發(fā)表了《根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑桔遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究》 (2004， 25 (1): 11-16)。該論文對柑桔成年樹腋芽在不同BA、 IM質(zhì)量濃度處理、不同 創(chuàng)傷部位和是否用石蠟帶包裹創(chuàng)傷口這三個(gè)方面的誘芽和轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了研究，建立了一個(gè) 通用、簡單、快捷的柑桔遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。但是在實(shí)際的操作過程中，用石蠟帶包裹 創(chuàng)傷口的操作難度大，且操作時(shí)間長，因而對植株的傷害很大，但是如果不用石蠟帶包裹創(chuàng) 傷口，同時(shí)在稀釋液中加入高濃度的細(xì)胞分裂素(10mg/l)，則創(chuàng)傷口很容易失水并形成愈 傷組織，很難再分化形成芽；同時(shí)，該方法是以第一代嫁接苗作為轉(zhuǎn)化的起始材料，而在嫁 接的過程中，需要木質(zhì)化或半木質(zhì)化的柑桔成年樹枝條，因而取材容易受到季節(jié)限制，不可 能周年進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便的可周年進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的柑桔的轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，包括試管砧木、外植體的準(zhǔn) 備，嫁接苗的制備，嫁接苗的創(chuàng)傷感染，擬轉(zhuǎn)化芽的嫁接，擬轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)鑒 定，以獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株的嫁接，其特征在于所述方法中嫁接苗的制備是 選用第二、三代嫁接苗作為起始材料。
上述方法中選用第二、三代嫁接苗作為起始材料，是將第一代嫁接苗從接穗上水平 切下，進(jìn)行第二次嫁接，獲得第二代嫁接苗；或?qū)⒌诙藿用绲捻斞吭俅芜M(jìn)行嫁接， 獲得第三代嫁接苗；以第二或第三代嫁接苗作為轉(zhuǎn)化起始材料，接穗與砧木之間用石蠟 帶包纏。這樣接穗和砧木的傷口愈合很牢固，而且在進(jìn)行感染操作時(shí)就不會(huì)出現(xiàn)脫落的 現(xiàn)象；同時(shí)經(jīng)過多次嫁接，可以獲得更多的轉(zhuǎn)化起始材料，以實(shí)現(xiàn)周年進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作的 目的。
為了加快遺傳轉(zhuǎn)化的周期，試管砧木的準(zhǔn)備過程中，種子剝種皮時(shí)要用消毒的脫脂 棉進(jìn)行固定。
上述試管砧木準(zhǔn)備過程中的種子接種無菌條件下用解剖刀將果實(shí)劃開，取出種子，
將種子放在脫脂棉上，剝?nèi)シN皮，接種在已消毒的裝有MS固體培養(yǎng)基的試管中；在28士2 'C下暗培養(yǎng)，砧木長到7 — 10cm長以備用。
為了獲得更高的轉(zhuǎn)化效率，本發(fā)明在嫁接苗的創(chuàng)傷感染過程中采用5mg/l細(xì)胞分裂 素，不進(jìn)行包纏；將不定芽嫁接在試管砧木上，對擬轉(zhuǎn)化植株的DNA，進(jìn)行PCR和 Southernbloting分析，獲得轉(zhuǎn)基因植株；練苗一周，以試管砧木作為中間砧，嫁接在 田間砧木上，套袋保濕l-2周。
上述創(chuàng)傷感染過程中，轉(zhuǎn)化起始材料保留了兩片葉，從上往下，第二片葉的腋芽要 進(jìn)行完全創(chuàng)傷。對第二片葉的腋芽完全創(chuàng)傷后，第一片葉腋芽的創(chuàng)傷口上很容易萌發(fā)出 不定芽，第二片葉的腋芽的創(chuàng)傷口處也可以萌發(fā)出不定芽，這樣就可以獲得更多的擬轉(zhuǎn) 化芽，有利于轉(zhuǎn)化頻率的提高。
本發(fā)明的有益效果-
1、 在試管砧木的準(zhǔn)備上，種子剝種皮時(shí)用消毒的脫脂棉進(jìn)行固定，種皮容易剝離， 種子的萌發(fā)速度快，可以加快遺傳轉(zhuǎn)化的周期；
2、 選擇第二、三代嫁接苗作為轉(zhuǎn)化起始材料，接穗和砧木的傷口愈合很牢固，而且 兩者用石蠟帶包纏，在進(jìn)行感染操作時(shí)就不會(huì)出現(xiàn)脫落的問題。如果采用第一代嫁接苗 作為轉(zhuǎn)化起始材料，在第一代嫁接苗中接穗上萌發(fā)的腋芽與接穗的結(jié)合不是很牢固，如 果直接在第一代嫁接苗上進(jìn)行創(chuàng)傷感染，大概有80%的腋芽會(huì)脫落。
3、 在轉(zhuǎn)化過程中，維持整個(gè)植株的健壯生長是獲得高誘芽率的必要條件，葉柄基部
4在感染的過程中多少會(huì)受到傷害，此時(shí)如果再用石蠟帶包纏，很容易使葉片脫落，不利 于整個(gè)植株的生長；為了避免傷口上愈傷組織的形成，本發(fā)明采用降低農(nóng)桿菌稀釋液中 細(xì)胞分裂素的辦法，采用5mg/1的細(xì)胞分裂素而不進(jìn)行包纏。本發(fā)明之所以對保留了 2 片葉的第二、三代嫁接苗從上往下的第二片葉的腋芽進(jìn)行完全創(chuàng)傷，是因?yàn)椋绻贿@ 樣，對于切除了頂芽的第二、三代嫁接苗，第二片葉的腋芽萌發(fā)速度很快，長勢也好， 營養(yǎng)優(yōu)先供應(yīng)，則傷口處不易萌發(fā)出不定芽。
4、 本發(fā)明不直接對不定芽進(jìn)行PCR鑒定，是因?yàn)閺膫谔庨L出來的不定芽很容易被 質(zhì)粒污染，同時(shí)因?yàn)橛糜谔崛NA的葉片數(shù)量有限，沒法進(jìn)行Southernbloting分析， 導(dǎo)致假陽性率增高；試管內(nèi)的不定芽很嫩，水份含量也高，如果將不定芽直接嫁接在田 間砧木上，則嫁接后很容易失水萎焉，導(dǎo)致嫁接成活率降低。本發(fā)明采用將不定芽嫁接 在試管砧木上，隨著植株的逐步長大，葉片也逐步增多(如果用于提取DNA的葉片不夠 的話，可以取擬轉(zhuǎn)化植株的頂芽再進(jìn)行一次試管內(nèi)嫁接)，這樣就可以對擬轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行 Southernbloting分析，對檢測為轉(zhuǎn)基因植株的，練苗一周，以試管砧木作為中間砧，嫁 接在田間砧木上，套袋保濕l-2周，這樣的嫁接成活率可高達(dá)95%以上。
5、 經(jīng)驗(yàn)證，運(yùn)用本發(fā)明所述的柑桔轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)化頻率可以達(dá)到10%左右。彭愛紅 等發(fā)表在《分子植物育種》(2009， 7 (1): 51-55)上的論文《根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)甲型肝炎 病毒(HAV)衣殼蛋白融合基因轉(zhuǎn)化柑桔成年材料的研究》中雖也提到10%的遺傳轉(zhuǎn)化率， 但那只是實(shí)驗(yàn)室的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在由實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)向田間的過程中，有相當(dāng)?shù)囊徊糠洲D(zhuǎn)基因植 株要死亡(如表l)。
表l:實(shí)驗(yàn)室的遺傳轉(zhuǎn)化率與田間的遺傳轉(zhuǎn)化率的差異
實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)基因 植株(株)實(shí)驗(yàn)室的 轉(zhuǎn)化頻率田間的轉(zhuǎn)基因 植株(株)田間的轉(zhuǎn)化頻率
論文方法2510%104%
本發(fā)明方法2510%249. 6%
總之，運(yùn)用本發(fā)明所述的柑桔轉(zhuǎn)基因方法田間的轉(zhuǎn)化頻率可以達(dá)到10%左右，同時(shí)
本發(fā)明在獲得轉(zhuǎn)基因植株之前都是在室內(nèi)進(jìn)行的，因而可以有效地避免質(zhì)粒向環(huán)境釋放
的可能且可以有效地避開柑桔的童期，嫁接到田間后2 — 3年就能開花結(jié)實(shí)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于此。
實(shí)施例
1、試管砧木的準(zhǔn)備。果實(shí)的準(zhǔn)備選取柑桔成熟的、完好的果實(shí)用自來水洗凈表面，在超凈工作臺上用 酒精表面消毒；
無菌脫脂棉的準(zhǔn)備用剪刀剪取一塊長寬各10cm左右的脫脂棉，浸泡在75%的酒精
中大約10分鐘，擰干，以備用；
種子接種無菌條件下用已消毒的解剖刀將果實(shí)劃開，取出種子，將種子放在脫脂 棉上， 一手拿解剖刀， 一手拿脫脂棉，剝?nèi)シN皮，接種在已消毒的裝有MS固體培養(yǎng)基的 試管中；28。C土2'C下暗培養(yǎng)，砧木長到7 — 10cm長以備用。
本例的MS固體培養(yǎng)基，是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上附加30g/l的蔗糖和8.5 g/l的瓊脂， PH5. 8。MS培養(yǎng)基的配方(1 )大量元素NH4N03 1650; KN031900; CaCl 2 2H20 440; MgS04 7H20 370; KH2P04 1700; (2)微量元素KI 0.83; H3B03 6.2; MnS04*4H20 22. 3; ZnS04 7H20 8. 6; Na2Mn04 2H20 0. 25; CuS04 5H20 0. 025; CoCl2 6H20 0. 025; FeS04 7H20 ( 27 . 8) +Na2-EDTA 2H20 ( 37 . 3); (3)有機(jī)成分肌醇100;煙酸0.5;鹽酸吡哆醇(維生素BJ 0.5;鹽酸硫胺素(維生素B,) 0.5;甘氨酸2，以上單位為mg/1。
2、 外植體的準(zhǔn)備。選取健壯的田間成年樹枝條，去掉葉片，將枝條剪短，長度為 5-10cm，洗凈表面，并用自來水沖洗干凈。在超凈工作臺上用O. 1% (g/1)的升汞消毒IO 分鐘左右，然后用無菌水沖洗干凈，裝在已消毒的培養(yǎng)皿中，以備用。
3、 試管嫁接苗的制備。在超凈工作臺上，用嫁接刀切取枝條上的腋芽(切取的方法 相當(dāng)于田間切接的方法)；用鑷子將砧木從試管中取出，放在培養(yǎng)皿中；用嫁接刀把試管
砧木上半部分水平去掉，然后在中間開一個(gè)嫁接口， 口的深度根據(jù)腋芽的大小而定，然
后將腋芽鑲嵌到砧木的嫁接口中，用已消毒的石蠟帶(純酒精浸泡6小時(shí)以上)完全包纏 嫁接口，放在裝有MS液體培養(yǎng)基的試管中(內(nèi)含濾紙橋)，28土2'C下暗培養(yǎng)，直至腋芽萌 發(fā)并長至約lcm長，見光(溫度28土2。C,光照度40iimol/ni2s，光照時(shí)間12h/d，以下同)， 獲得第一代嫁接苗；見光4一5天后，將第一代嫁接苗上的整個(gè)芽水平切下，在莖上用嫁 接刀削去表皮層，露出形成層，將芽嫁接在試管砧木上，用石蠟帶包纏嫁接口 (相當(dāng)于 田間嫁接的切接)，放在裝有MS液體培養(yǎng)基的試管中(內(nèi)含濾紙橋)，在光照條件下繼續(xù)培 養(yǎng)，獲得第二代嫁接苗；或?qū)⒌诙藿用绲捻斞壳谐?，嫁接在試管砧木上，獲得第三 代嫁接苗(嫁接的方法同上，培養(yǎng)條件同上)。
本例中，砧木保留的長度為3cra左右，腋芽不宜太小；培養(yǎng)基為MS液體培養(yǎng)基，在MS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上附加50g/l的蔗糖，PH5.8 (以下同)；嫁接苗的支撐物為濾紙橋，折疊的 方法為用一張正方形的濾紙對角形折疊，頂部剪一個(gè)口，然后打開，包在試管底部(口 要在試管底部的中間，此試管應(yīng)該比放嫁接苗的試管要小些)，然后順著濾紙對角形的痕跡把濾紙包纏在試管上，取下，放在需要放嫁接苗的試管內(nèi)(濾紙橋的高度大約為試管 長度的l/3左右)，口朝上，嫁接苗就通過這個(gè)口把根放下去，子葉以上的部分在口以上。 得到的第一代嫁接苗，苗的莖長要有0.5cm以上。其中嫁接刀、培養(yǎng)皿、鑷子、MS液體培 養(yǎng)基都需要消毒。
4、 第二、三代嫁接苗的創(chuàng)傷、感染。
a) 感染的起始材料待第二、三代嫁接苗的傷口愈合，且具有兩片完全展開的完整 的葉片時(shí)，第二、三代嫁接苗就可以作為感染的起始材料；
b) 工程菌液的制備轉(zhuǎn)化前挑選一個(gè)農(nóng)桿菌菌株的單菌落接種于5ml液體培養(yǎng)基中， 在28。C、黑暗下、120r/min培養(yǎng)至對數(shù)期(0D6。。=0. 8-1. 0)，轉(zhuǎn)化時(shí)將其稀釋5倍，稀釋 液為MS+BA5mg/l+IAA2. 5mg/1 (PH7.2);
C)小棉球的準(zhǔn)備用脫脂棉挫成一個(gè)一個(gè)的小棉球，放在培養(yǎng)皿中，消毒備用； d)創(chuàng)傷、感染將小棉球放在已稀釋的工程菌液中；在超凈工作臺上，將轉(zhuǎn)化起 始材料從試管中取出，放在培養(yǎng)皿中；用鑷子將轉(zhuǎn)化起始材料夾起，用嫁接刀將起始材 料的頂芽沿著葉腋處水平切除，并將腋芽完全創(chuàng)傷；用浸有菌液和稀釋液的小棉球包纏 傷口，放在裝有MS液體培養(yǎng)基的試管中(內(nèi)含濾紙橋)；在黑暗的條件下共培養(yǎng)2 — 3天， 溫度28士2。C;然后在超凈工作臺上去掉小棉球，在光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。其中鑷子、 培養(yǎng)皿、嫁接刀、MS液體培養(yǎng)基都需要消毒。
5、 擬轉(zhuǎn)化芽的嫁接。
待傷口上長出的不定芽的莖有0.5cm長時(shí)，在超凈工作臺上將植株從試管中取出，放 在培養(yǎng)皿中，用嫁接刀將不定芽水平切下，嫁接在試管砧木上，獲得擬轉(zhuǎn)化植株，在光 照條件下培養(yǎng)。其中的培養(yǎng)皿、嫁接刀、鑷子、MS液體培養(yǎng)基都需要消毒。
6、 擬轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)鑒定。
在超凈工作臺上，將擬轉(zhuǎn)化植株從試管內(nèi)取出，用嫁接刀切取擬轉(zhuǎn)化植株的一部分 葉片(剩下的部分仍然放在MS液體培養(yǎng)基中)，用于提取擬轉(zhuǎn)化植株的DNA，進(jìn)行PCR和 Southernbloting分析，獲得轉(zhuǎn)基因植株。其中的培養(yǎng)皿、嫁接刀、鑷子、MS液體培養(yǎng) 基都需要消毒。
7、 轉(zhuǎn)基因植株的田間嫁接對確定為轉(zhuǎn)基因植株的，將試管苗放在窗臺上練苗一周； 然后從試管砧木的子葉處水平切下轉(zhuǎn)基因植株，按照田間切接的方法將其嫁接在田間砧 木上，用塑料袋保濕1一2個(gè)星期。
本發(fā)明將柑桔果實(shí)保存在4一8'C的冷庫或冰箱中，以達(dá)到周年供應(yīng)柑桔砧木的目的。 本發(fā)明是以第二、三代嫁接苗作為轉(zhuǎn)化的起始材料，柑桔的腋芽為復(fù)芽，當(dāng)?shù)谝淮藿?br> 7苗的整個(gè)芽水平切下后(切下部分用于嫁接，獲得第二代嫁接苗)，再將第一代嫁接苗放 在裝有MS液體培養(yǎng)基的試管中(內(nèi)含濾紙橋)，暗培養(yǎng)，溫度同上，則從腋芽處還會(huì)萌發(fā) 出新的芽，再次進(jìn)行嫁接，還可獲得第二代嫁接苗；同時(shí)也可以取第二代嫁接苗的頂芽 再次進(jìn)行嫁接(剩下的第二代嫁接苗繼續(xù)培養(yǎng)在光照的條件下，溫度同上)，獲得第三代 嫁接苗；從而可以獲得更多的轉(zhuǎn)化起始材料，同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)周年進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的 目的。
本發(fā)明創(chuàng)建的以成年樹腋芽為外植體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是在人工設(shè)置的溫度28± 2'C、光照度40iimol/m2s 、光照時(shí)間12h/d的條件下進(jìn)行的，可以打破柑桔的自然休眠 期，因而可以周年進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作；再者，在共培養(yǎng)的過程中，只需把浸有菌液和稀 釋液(MS+BA5rag/l+IAA2.5mg/1)的小棉球放在傷口上，從而簡化了操作程序；三者，從 傷口上長出的不定芽嫁接到試管砧木上，經(jīng)檢測，確定為轉(zhuǎn)基因植株的再嫁接到田間砧 木上，從而避免了試管內(nèi)生根這一途徑。
權(quán)利要求
1、一種柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，包括試管砧木、外植體的準(zhǔn)備，嫁接苗的制備，嫁接苗的創(chuàng)傷感染，擬轉(zhuǎn)化芽的嫁接，擬轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)鑒定，以獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株的嫁接，其特征在于所述方法中嫁接苗的制備是選用第二、三代嫁接苗作為起始材料。
2、 如權(quán)利要求l所述的柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述方法中選用第二、三 代嫁接苗作為起始材料，是將第一代嫁接苗從接穗上水平切下，進(jìn)行第二次嫁接，獲得 第二代嫁接苗；或?qū)⒌诙藿用绲捻斞吭俅芜M(jìn)行嫁接，獲得第三代嫁接苗；以第二或 第三代嫁接苗作為轉(zhuǎn)化起始材料，接穗與砧木之間用石蠟帶包纏。
3、 如權(quán)利要求l所述的柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述方法中試管砧木的準(zhǔn) 備種子剝種皮時(shí)用消毒的脫脂棉進(jìn)行固定。
4、 如權(quán)利要求3所述的柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述試管砧木準(zhǔn)備過程中 的種子接種無菌條件下用解剖刀將果實(shí)劃開，取出種子，將種子放在脫脂棉上，剝?nèi)?種皮，接種在已消毒的裝有MS固體培養(yǎng)基的試管中；在28士2'C下暗培養(yǎng)，砧木長到7 —10cm長以備用。
5、 如權(quán)利要求l所述的柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于嫁接苗的創(chuàng)傷感染過程中采用5mg/l細(xì)胞分裂素，不進(jìn)行包纏；將不定芽嫁接在試管砧木上，對擬轉(zhuǎn)化植株的DNA， 進(jìn)行PCR和Southernbloting分析，獲得轉(zhuǎn)基因植株；練苗一周，以試管砧木作為中間砧， 嫁接在田間砧木上，套袋保濕l-2周。
6、 如權(quán)利要求5所述的柑桔的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所述嫁接苗的創(chuàng)傷感染過 程中，轉(zhuǎn)化起始材料保留了兩片葉，從上往下，第二片葉的腋芽要進(jìn)行完全創(chuàng)傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種柑桔的轉(zhuǎn)基因方法。它包括試管砧木、外植體的準(zhǔn)備，嫁接苗的制備，嫁接苗的創(chuàng)傷感染，擬轉(zhuǎn)化芽的嫁接，擬轉(zhuǎn)化植株的分子生物學(xué)鑒定，以獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株的嫁接，其特征在于所述方法中嫁接苗的制備是選用第二、三代嫁接苗作為起始材料。本發(fā)明是一種能有效地解決柑桔可周年進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的轉(zhuǎn)基因方法。
文檔編號A01G1/06GK101575612SQ200910104100
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者何永睿, 彭愛紅, 彭祝春, 許蘭珍, 鄒修平, 陳善春 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所