專利名稱：牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的 方法。
背景技術(shù)：
牡丹(Paeonia Suffruticosa)系芍藥科、芍藥屬多年生灌木，是我國(guó)傳統(tǒng)名花，雍 容華貴、富麗堂皇，深受我國(guó)廣大人民的喜愛(ài)。由于牡丹傳統(tǒng)的繁殖方法存在結(jié)實(shí)率低、種 子變異性強(qiáng)、無(wú)性繁殖系數(shù)低等問(wèn)題，目前，我國(guó)的牡丹生產(chǎn)還很難滿足日益增長(zhǎng)的社會(huì)需 求，繁殖方法的滯后也限制了牡丹種質(zhì)資源保存及新品種選育工作的進(jìn)展。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可在一定時(shí)間內(nèi)，從一個(gè)外植體離體培養(yǎng)繁殖出比常規(guī) 傳統(tǒng)繁殖多幾百倍甚至千萬(wàn)倍與母體性狀相似的小植株。有關(guān)牡丹組織培養(yǎng)的研究也有 過(guò)一些報(bào)道，陳怡平等以紫斑牡丹不同外植體為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，包括胚、上胚軸、腋芽、 頂芽、土芽、葉片、葉柄、心皮、花藥等，結(jié)果認(rèn)為土芽的愈傷組織誘導(dǎo)率最高。Margherita Beruto等的研究表明，帶有展開(kāi)葉片的芽比僅具有幼葉原基的芽更容易啟動(dòng)組培過(guò)程。張 子學(xué)等進(jìn)行了鳳丹組織培養(yǎng)研究，采用種子、種胚以及由此產(chǎn)生的子葉、葉柄、葉片和愈傷 組織等作為外植體進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)采用胚培養(yǎng)可以打破上胚軸休眠，大大縮短初代培 養(yǎng)周期。孟軍等分析認(rèn)為，土芽的組織分化程度最低，最容易脫分化產(chǎn)生愈傷組織，是最理 想的外植體材料。目前，牡丹組織培養(yǎng)中，經(jīng)常要用氯化汞對(duì)外植體進(jìn)行滅菌處理，對(duì)人和環(huán)境存在 很大安全隱患，還存在外植體容易污染滅菌困難、培養(yǎng)物容易發(fā)生褐化而死亡、愈傷組織分 化成芽難及培養(yǎng)周期長(zhǎng)等問(wèn)題(一般，從牡丹外植體誘導(dǎo)愈傷組織，再由愈傷組織分化芽 需要60天以上)，影響了牡丹組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，它可克服現(xiàn)有 技術(shù)中外植體容易污染滅菌困難、培養(yǎng)物容易發(fā)生褐化而死亡、愈傷組織分化成芽難及培 養(yǎng)周期長(zhǎng)的一些不足。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是使用時(shí)本發(fā)明先行進(jìn)行植株處理，再取鱗芽作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，滅菌容易，雜 菌污染少，可快速獲得牡丹無(wú)菌芽。本發(fā)明對(duì)牡丹離體快速繁殖進(jìn)程具有促進(jìn)作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。本發(fā)明所述的方法包括如下步驟a、用殺菌劑將牡丹植株處理后用基質(zhì)填充，用 塑料膜保濕并冷藏；b、待牡丹即將解除休眠時(shí)，取其鱗芽剝?nèi)ネ鈱影~后滅菌，并用無(wú)菌水 沖洗；c、在無(wú)菌環(huán)境下，剝開(kāi)鱗芽，切掉其基部2-4張芽?jī)?nèi)小葉片和芽?jī)?nèi)上部葉的葉尖部分，將其余部分接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；d、將接種后的外植體置于培養(yǎng)溫度為25士2°C、 并具有一定光照條件的環(huán)境下培養(yǎng)形成無(wú)菌芽。a步驟中，用木屑和苔蘚作填充基質(zhì)，用殺菌劑對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒處理，并保持 55% -65%的濕度，用百菌清殺菌劑溶液將待處理植株整株浸泡后撈出涼干，將牡丹植株 2 3株為一組捆綁后置于塑料袋中，植株四周用消毒好的基質(zhì)填充，將牡丹植株移至冷庫(kù) 或冰箱內(nèi)冷藏，冷藏溫度為0 _2°C，冷藏時(shí)間為15-30天。b步驟中，牡丹解除休眠的時(shí)間為15-30天，其中重瓣花牡丹需冷藏時(shí)間長(zhǎng)，單瓣 花牡丹需冷藏時(shí)間短，取健壯鱗芽，剝?nèi)ネ饷?層鱗片，用75%酒精處理40秒，再用飽和漂 白粉液或10% -15%的活性氯濃度為5. 2%的次氯酸鈉液滅菌15-25分鐘，用無(wú)菌水沖洗 4-5 次。c步驟中，固體培養(yǎng)基中各成分的重量百分比為0. 0825 0. 1650%的硝酸銨、 0. 10 0. 2%的硝酸鉀、0. 04 0. 05%的氯化鈣、0. 03 0. 04%的硫酸鎂、0. 010 0. 02% 的磷酸二氫鉀、0. 0278 0. 0556%的硝酸鈣；0. 003 0. 004 %的乙二氨四乙酸二鈉、 0. 002 0. 003%的硫酸亞鐵、0. 002 0. 003%的硫酸錳、0. 0008 0. 0010%的硫酸鋅、 0. 0006 0. 0007% 的硼酸、0. 00008 0. 00010% 的碘化鉀、0. 000025 0. 00003% 的鉬酸 鈉、0. 0000025 0. 000003% 的硫酸銅、0. 0000025 0. 000003% 的氯化鈷、0. 01 0. 02% 的肌醇、0. 00005 0. 00006 % 的維生素 Bl、0. 00005 0. 00006 % 的煙酸、0. 00005 0. 00006%的維生素B6、0. 0002 0. 0003%的甘氨酸、0. 05 0. 的水解乳蛋白、3 4 %的蔗糖、0. 65 0. 7 %的瓊脂、0. 00015 0. 00030 %的6-芐氨基嘌呤、0. 00002 0. 00004%的萘乙酸、0. 00003 0. 00006%的赤霉素、0. 08 0. 2%的聚乙烯聚吡咯烷酮或 0. 05-1. 0 %的聚乙烯聚吡咯烷酮和0. 05 0. 1 %的活性碳，余量為水，各成分的重量百分 比之和為100%，固體培養(yǎng)基的PH值為5. 8-6.0。d步驟中，光照強(qiáng)度2000Lx 3000Lx，光照時(shí)間12小時(shí)/天。本發(fā)明的牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法有如下優(yōu)點(diǎn)1、先行進(jìn)行植株處理，再取鱗芽作外植體組織培養(yǎng)，滅菌容易，雜菌污染少。2、用75%酒精處理外植體后，再用飽和漂白粉液或10% 15%的活性氯濃度為 5. 2%的次氯酸鈉液滅菌，對(duì)人體健康和環(huán)境安全危害小。3、用本發(fā)明進(jìn)行牡丹組織培養(yǎng)，外植體很少發(fā)生污染，無(wú)菌芽分化率高、分化速度 快，有利于對(duì)牡丹進(jìn)行下一步的繼代培養(yǎng)操作。4、利用低溫處理與赤霉素聯(lián)合作用，打破牡丹鱗芽休眠，可快速誘導(dǎo)牡丹無(wú)菌芽。實(shí)施例在牡丹萌芽前，將其從田間挖出，去盡泥土，剪去植株的病、殘根、病、殘枝和無(wú)芽 枝，用百菌清殺菌劑溶液將待處理植株整株浸泡后撈出涼干，以苔蘚和木屑作冷藏基質(zhì)，用 澆灌方式消毒，一邊澆灌一邊攪拌，將百菌清殺菌劑溶液與基質(zhì)徹底拌勻，并保持基質(zhì)濕度 為60%。先在塑料袋底部放少量基質(zhì)，再將牡丹植株2 3株為一組捆綁后置于其中，以免 牡丹芽受傷，植株四周用消毒好的基質(zhì)填充，以免植株失水干枯，然后扎緊袋口，在塑料袋 四周均勻扎4個(gè)0. 5 1. Ocm的通氣孔；最后將牡丹植株移至冷庫(kù)或冰箱內(nèi)冷藏。冷藏溫 度為0°C，冷藏時(shí)間為15天。 然后取健壯鱗芽，剝?nèi)ネ饷?層鱗片，用75 %酒精處理40秒，再用飽和漂白粉液或10%的活性氯濃度為5. 2%的次氯酸鈉液滅菌15分鐘，用無(wú)菌水沖洗4次，然后，在無(wú)菌環(huán) 境下，剝開(kāi)鱗芽，切掉其基部2張芽?jī)?nèi)小葉片和芽上部葉的葉尖組織(若有芽?jī)?nèi)小花蕾形成 的也要將其切除)，最后將其余部分(0. 5^0. 7cm)接種于無(wú)菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基為 MS培養(yǎng)基(Murashige & Skoog于1962年研制)，進(jìn)行部分成分改良，具體如下無(wú)機(jī)鹽大量元素硝酸銨(NH4N03)0.0825%、硝酸鉀(KN03)0. 19%、氯化鈣(CaCl2 ·2Η20)0. 044%, 硫酸鎂(MgS04 · 7Η20)0.037 磷酸 二氫鉀(KH2P04)0.017 硝酸鈣 (Ca (N03) 2 · 4H20) 0. 0556 %、乙二 氨四乙酸二鈉 Na2 — EDTA 0. 00373 %、硫酸亞鐵 FeS04 · 7H200. 00278% ；無(wú)機(jī)鹽微量元素硫酸錳(MnS04· 4H20) 0. 00223 %、硫酸鋅(ZnS04 · 7H20) 0. 00086 %、硼酸 (H;3B03)0. 00062%、碘化鉀(KI) 0. 000083 %、鉬酸鈉(Na2Mo0 · 2H20) 0. 000025 %、硫酸銅 (CuS04 · 5H20) 0. 0000025%、氯化鈷(CoC12 · 6H20) 0. 0000025% ；有機(jī)物肌醇0. 01%、維生素 Bl 0.00005%、煙酸 0.00005%、維生素 B6 0.00005%、甘氨 酸0. 0002%、水解乳蛋白0. 05 0. 1% ；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-芐氨基嘌呤(6-BA)0. 00030 %、萘乙酸(NAA)0. 00004 赤霉素 (GA3) 0. 00006% ；其他蔗糖4%、瓊脂0.65%、聚乙烯聚吡咯烷酮1.0%和活性碳0. 合用，最后加水至 100%。培養(yǎng)基的PH值為5. 8 6.0。最后，將接種后的外植體置于培養(yǎng)溫度為25°C、光照強(qiáng)度2500LX，光照時(shí)間12小 時(shí)/天的環(huán)境下培養(yǎng)誘導(dǎo)無(wú)菌芽。采用本方法接種了洛陽(yáng)紅、太平紅等25多個(gè)牡丹品種，外植體培養(yǎng)5、天即可直 接分化出芽，外植體很少發(fā)生污染，無(wú)菌芽分化率高；培養(yǎng)物長(zhǎng)勢(shì)壯、生長(zhǎng)快。(參見(jiàn)附表)
權(quán)利要求
1.一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟a、用 殺菌劑將牡丹植株處理后用基質(zhì)填充，用塑料膜保濕并冷藏；b、待牡丹即將解除休眠時(shí)， 取其鱗芽剝?nèi)ネ鈱影~后滅菌，并用無(wú)菌水沖洗；C、在無(wú)菌環(huán)境下，剝開(kāi)鱗芽，切掉其基部 2-4張芽?jī)?nèi)小葉片和芽?jī)?nèi)上部葉的葉尖部分，將其余部分接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；d、將 接種后的外植體置于培養(yǎng)溫度為25士2°C、并具有一定光照條件的環(huán)境下培養(yǎng)形成無(wú)菌芽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，其特征在于a步驟中， 用木屑和苔蘚作填充基質(zhì)，用殺菌劑對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒處理，并保持55% -65%的濕度，用百 菌清殺菌劑溶液將待處理植株整株浸泡后撈出涼干，將牡丹植株2 3株為一組捆綁后置 于塑料袋中，植株四周用消毒好的基質(zhì)填充，將牡丹植株移至冷庫(kù)或冰箱內(nèi)冷藏，冷藏溫度 為0 _2°C，冷藏時(shí)間為15-30天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，其特征在于b步驟中， 牡丹解除休眠的時(shí)間為15-30天，取健壯鱗芽，剝?nèi)ネ饷?層鱗片，用75%酒精處理40秒， 再用飽和漂白粉液或10 %-15 %的活性氯濃度為5. 2 %的次氯酸鈉液滅菌15-25分鐘，用無(wú) 菌水沖洗4-5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，其特征在于c步驟中， 固體培養(yǎng)基中各成分的重量百分比為0. 0825 0. 1650%的硝酸銨、0. 10 0.2%的硝 酸鉀、0. 04 0. 05%的氯化鈣、0. 03 0. 04%的硫酸鎂、0. 010 0. 02%的磷酸二氫鉀、 0. 0278 0. 0556%的硝酸鈣；0. 003 0. 004%的乙二氨四乙酸二鈉、0. 002 0. 003%的 硫酸亞鐵、0. 002 0. 003 %的硫酸錳、0. 0008 0. 0010 %的硫酸鋅、0. 0006 0. 0007 % 的硼酸、0. 00008 0. 00010% 的碘化鉀、0. 000025 0. 00003 % 的鉬酸鈉、0. 0000025 0. 000003 %的硫酸銅、0. 0000025 0. 000003 %的氯化鈷、0. 01 0. 02 %的肌醇、 0. 00005 0. 00006% 的維生素 BU0. 00005 0. 00006% 的煙酸、0. 00005 0. 00006 % 的維生素B6、0. 0002 0. 0003%的甘氨酸、0. 05 0. 的水解乳蛋白、3 4%的蔗糖、 0. 65 0. 7%的瓊脂、0. 00015 0. 00030%的6-芐氨基嘌呤、0. 00002 0. 00004%的萘乙 酸、0. 00003 0. 00006%的赤霉素、0. 08 0. 2%的聚乙烯聚吡咯烷酮或0. 05-1. 0%的聚 乙烯聚吡咯烷酮和0. 05 0. 的活性碳，余量為水，各成分的重量百分比之和為100%， 固體培養(yǎng)基的pH值為5. 8 6. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，其特征在于d步驟中， 光照強(qiáng)度2000Lx 3000Lx，光照時(shí)間12小時(shí)/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牡丹組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成芽的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟a、用殺菌劑將牡丹植株處理后用基質(zhì)填充，用塑料膜保濕并冷藏；b、待牡丹即將解除休眠時(shí)，取其鱗芽剝?nèi)ネ鈱影~后滅菌，并用無(wú)菌水沖洗；c、在無(wú)菌環(huán)境下，剝開(kāi)鱗芽，切掉其基部2-4張芽?jī)?nèi)小葉片和芽?jī)?nèi)上部葉的葉尖部分，將其余部分接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；d、將接種后的外植體置于培養(yǎng)溫度為25±2℃、并具有一定光照條件的環(huán)境下培養(yǎng)形成無(wú)菌芽。本發(fā)明具有滅菌容易，雜菌污染少，可快速獲得牡丹無(wú)菌芽的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102084812SQ20091020012
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者殷麗青, 王新其, 胡永紅, 黃衛(wèi)昌 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院