專利名稱：一種在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是涉及一種番茄組織培養(yǎng)方法使用的誘導(dǎo)、分化、生根
培養(yǎng)基，利用該培養(yǎng)基番茄實現(xiàn)在試管中開花結(jié)果的方法。
背景技術(shù)：
番茄屬于茄科、番茄屬、番茄種(拉丁文名稱Lycopersicon esculantumMill)。番 茄是一種重要的經(jīng)濟作物，是世界范圍內(nèi)分布廣、消費多的主要蔬菜，同時番茄又是生物科 學(xué)研究中的一種重要實驗材料，是研究果實發(fā)育和成熟的模式植物。通過組織培養(yǎng)方法實 現(xiàn)番茄在試管中開花結(jié)果，可以為番茄生物科學(xué)研究提供一個新的方法。為進一步探索植 物開花結(jié)果的原理機制，提供理論依據(jù)，也可以為園藝植物的微型培養(yǎng)提供新的途徑。
現(xiàn)有技術(shù)中的番茄組織培養(yǎng)方法主要用于優(yōu)良品種的快繁和番茄轉(zhuǎn)基因中的生 物技術(shù)的基本操作，但是沒有番茄在試管中開花結(jié)果的組織培養(yǎng)方法的研發(fā)，因為番茄在 試管內(nèi)開花結(jié)果不同于土壤中開花結(jié)果，因為試管中是一個相對密閉的人為控制的微環(huán) 境，難點在于對于光照、溫度的控制和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和激素配比，以達到滿足番茄能 在試管內(nèi)開花結(jié)果的需求。常規(guī)的番茄組織培養(yǎng)主要是為了調(diào)節(jié)番茄組織的分化增殖能力 以提高番茄試管苗的繁殖系數(shù)，或者是為了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥男枰M行調(diào)控，當(dāng)番茄試管苗分 化后就轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中，生根后就移栽至土壤中。本發(fā)明人是在番茄組織培養(yǎng)成熟技術(shù) 的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基中激素種類和濃度、營養(yǎng)成分進行了改進。該發(fā)明中的激素調(diào)節(jié)主要為 了番茄試管苗在試管中實現(xiàn)由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)化達到開花結(jié)實的目的，因此在激素 的種類和濃度以及營養(yǎng)成分與常規(guī)的番茄組織培養(yǎng)是大不相同的。由于試管內(nèi)開花結(jié)實不 受季節(jié)限制，可以隨時誘導(dǎo)，組培試管成花具有成花率高、重復(fù)性好、技術(shù)穩(wěn)定等優(yōu)點，因此 可被大量用于成花結(jié)實研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了填補現(xiàn)有技術(shù)中組織培養(yǎng)方法實現(xiàn)番茄在試管中開花結(jié)果的方法的 空白，發(fā)明了一種在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的方法，實現(xiàn)了番茄試管苗在試管中由營養(yǎng) 生長向生殖生長轉(zhuǎn)化達到開花結(jié)實的效果和目的。
本發(fā)明的內(nèi)容為 —種在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的方法，所述方法包括番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步 驟，分化幼莖步驟，培育生根和開花結(jié)果步驟；所述方法的整個過程均在試管中完成，即本 方法不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還在試管中完成開花結(jié)實的組培過程。
在實際的組培中，在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的步驟為 (1)所述的番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟為取番茄幼嫩葉片，用自來水徹底沖洗 后放在1% _10%的吐溫-20中停留2-10分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，然后 用O. 1%升汞(HgCl2)溶液表面滅菌2-10分鐘，再用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次； 葉片組織剪成大小面積范圍為lmmX lmm 10mmX 10mm作為外植體，接種到MS基本培養(yǎng)基
3+6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)0. l-10mgL—'+吲哚乙酸(IAA) 0. 01-lmgL—瓊脂4_10g L-^蔗糖 20-50g的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷； (2)所述的分化幼莖步驟為將愈傷組織轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，將愈傷組織分化為 幼莖； (3)培育生根，開花結(jié)果步驟為將幼莖接種到MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸 IBAO. 1-lOmgL—^瓊脂4-10g L—^蔗糖20_50g的基質(zhì)中，其pH值為5. 0-6. 7，控制組織培養(yǎng) 室培養(yǎng)溫度為23-25°C ，光照為白色熒光，光強度定為65 E/m7s，在12-20小時的光周期， 12-4小時的暗周期中完成生根、開花結(jié)果。在具體的實踐中，所述在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的步驟為 在所述的(1)番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟中所述的用自來水徹底沖洗后放在
5%的吐溫_20中停留時間為5分鐘；用0. 1%升汞(HgCl2)溶液表面滅菌時間為4分鐘；
所述的葉片組織剪成大小范圍為5mmX5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基
+6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL—^吲哚乙酸(I AA) 0. 2mgL—^瓊脂6g L 蔗糖30g的培養(yǎng)
基中，誘導(dǎo)愈傷； 在所述的(3)培育生根，開花結(jié)果步驟中的幼莖接種的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+ 吲哚丁酸IBAlmgL—^瓊脂8g L—^蔗糖30g ;所述的pH值為5. 8 ;所述的組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫 度為23-25°C ，所述的光照為白色熒光，光強定為65 i！ E/m7s，所述的光周期為16小時，所 述的暗周期8小時。 本發(fā)明完善了番茄組織培養(yǎng)的技術(shù)，即不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還 可以在試管中開花結(jié)實，由于在試管中培育的技術(shù)較難，目前世界上在試管中能夠開花結(jié) 實的植物種類很少，該項發(fā)明體現(xiàn)了組織培養(yǎng)的較高水平。
實施例
實例1 將番茄品種MicroTom田間生長的葉片作為外植體，自來水下徹底沖洗，然后放在 5%的吐溫-20中5分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，O. 1%升汞(HgCl2)表面滅 菌4分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次。 葉片組織剪成大小為5mmX5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基 +6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL—^吲哚乙酸(IAA)O. 2mgL—^瓊脂6g L—^蔗糖30g，誘導(dǎo)愈傷 25-30天。 將愈傷轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-10天，愈傷組織分化為幼莖。將幼莖接種到MS 基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸(IBA) lmgL—^瓊脂8g L—^蔗糖30g， pH值5. 8，組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫 度23-25°C，白色熒光光強65 i！ E/m7s， 16小時的光周期，8小時的暗周期。7天后生根、形 成花蕾，15天開花，30天果實轉(zhuǎn)色，45天果實成熟。
實例2 將番茄品種Bener Best田間生長的葉片作為外植體，自來水下徹底沖洗，然后放 在5%的吐溫-20中5分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，0. 1 %升汞(HgCl2)表面 滅菌4分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次。 葉片組織剪成大小為5mmX5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基 +6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL—^吲哚乙酸(IAA)O. 2mgL—^瓊脂6g L—^蔗糖30g，誘導(dǎo)愈傷25-30天。 將愈傷轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)14-20天，愈傷組織分化為幼莖。將幼莖接種到 MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸(IBA) lmgL—^瓊脂8g L—^蔗糖30g， pH值5. 8，組織培養(yǎng)室培養(yǎng) 溫度23-25t:，光照為白色熒光，光強65ii E/m7s， 16小時的光周期，8小時的暗周期。7天 后生根、14天形成花蕾，20天開花，40天果實轉(zhuǎn)色，60天果實成熟。
權(quán)利要求
一種在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的方法，其特征在于；所述方法包括番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟，分化幼莖步驟，培育生根和開花結(jié)果步驟；所述方法的整個過程均在試管中完成，即本方法不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還在試管中完成開花結(jié)實的組培過程。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的方法，其特征在于(1) 所述的番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟為取番茄幼嫩葉片，用自來水徹底沖洗后放 在1% -10%的吐溫_20中停留2-10分鐘，用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗3-4次，然后用 0.1%升汞(HgCl2)溶液表面滅菌2-10分鐘，再用高溫高壓滅菌的蒸餾水漂洗4-5次；葉 片組織剪成大小面積范圍為lmmXlmm 10mmX 10mm作為外植體，接種到MS基本培養(yǎng)基 +6_芐氨基腺嘌呤(6-BA)0. l-10mgL—'+吲哚乙酸(IAA) 0. 01-lmgL—瓊脂4-10g L-^蔗糖 20-50g的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷；(2) 所述的分化幼莖步驟為將愈傷組織轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基，將愈傷組織分化為幼莖；(3) 培育生根，開花結(jié)果步驟為將幼莖接種到MS基本培養(yǎng)基+吲哚丁酸 IBAO. 1-lOmgL—^瓊脂4-10g L—^蔗糖20_50g的培養(yǎng)基中，其pH值為5. 0-6. 7，控制組織培 養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為23-25t:，光照為白色熒光，光強度定為65iiE/m7s，在12-20小時的光周 期，12-4小時的暗周期中完成生根、開花結(jié)果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種在試管中進行番茄組織培養(yǎng)的方法，其特征在于 在所述的(1)番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟中所述的用自來水徹底沖洗后放在5%的吐溫-20中停留時間為5分鐘；用0. 1%升汞(HgCl2)溶液表面滅菌時間為4分鐘；所述的 葉片組織剪成大小范圍為5mmX 5mm左右作為外植體，接種到培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+6-芐 氨基腺嘌呤(6-BA)2mgL—^吲哚乙酸(IAA)O. 2mgL—^瓊脂6g L—^蔗糖30g的培養(yǎng)基中，誘 導(dǎo)愈傷；在所述的(3)培育生根，開花結(jié)果步驟中的幼莖接種的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+吲哚 丁酸IBAlmgL—^瓊脂8g L—^蔗糖30g ;所述的pH值為5. 8 ;所述的組織培養(yǎng)室培養(yǎng)溫度為 23-25°C ，所述的光照為白色熒光，光強定為65 ii E/m7s，所述的光周期為16小時，所述的暗 周期8小時。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是涉及一種番茄組織培養(yǎng)方法使用的誘導(dǎo)、分化、生根培養(yǎng)基，利用該培養(yǎng)基番茄實現(xiàn)在試管中開花結(jié)果的方法。所述方法包括番茄誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)步驟、分化成苗步驟、生根，花芽分化，開花結(jié)果步驟；所述方法的整個過程均在試管中完成；即本方法不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還在試管中開花結(jié)實。本發(fā)明完善了番茄組織培養(yǎng)的技術(shù)，即不僅能在試管中使番茄分化增殖，而且還可以在試管中開花結(jié)實，由于在試管中培育的技術(shù)較難，該項發(fā)明體現(xiàn)了組織培養(yǎng)的高水平。
文檔編號C12N5/04GK101731144SQ200810225940
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者劉敏, 沈前華, 潘毅, 闞晟, 鹿金穎 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所