一種紅根野蠶豆組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)方法，具體涉及一種紅根野蠶豆組織培養(yǎng)方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]紅根野蠶豆，植物界中被子植物門、雙子植物綱、玄參科、野蠶豆屬、紅根野蠶豆種，又名滑野蠶豆、大花胡麻草、小紅藥等，為玄參科植物紅根野蠶豆全草，性溫、味酸、微辛，用于散瘀止血、消腫止痛；主治咯血、咳血、吐血、婦女閉經(jīng)、內(nèi)傷瘀血、中老年人風濕痹痛、筋骨痛、腦血栓、腦溢血、酒精肝等。作為一種名貴中藥材，現(xiàn)今由于自然繁殖能力低市場需求大，人類的過度采摘等原因?qū)е伦匀毁Y源稀缺，無法滿足人類對紅根野蠶豆的藥用需求。
[0003]19世紀30年代，德國植物學家施萊登和德國動物學家施旺創(chuàng)立了細胞學說，根據(jù)這一學說，如果給細胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個細胞都應(yīng)該能夠獨立生活；1902年，德國植物學家哈伯蘭特細胞全能性的理論是植物組培的理論基礎(chǔ)。1958年，一個振奮人心的消息從美國傳向世界各地，美國植物學家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)果，證實了哈伯蘭特在五十多年前關(guān)于細胞全能的預(yù)言。
[0004]植物的組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細胞具有全能性這個理論，近幾十年來發(fā)展起來的一項無性繁殖的新技術(shù)。植物的組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)；狹義是指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。
[0005]中國中藥雜志2003年12月第28卷第12期，薛建平、葛德燕等對玄參科地黃組織培養(yǎng)的研宄進行了闡述。1983年，毛文岳等人就對地黃的組織培養(yǎng)進行了研宄，其中吳美芳等人以懷地黃北京一號，新鮮的塊根為外植體進行培育，得出完整植株；毛文岳等以地黃莖尖為外植體進行培養(yǎng)也獲得了地黃完整植株。迄今為止國內(nèi)外對地黃、金魚草、玄參等玄參科植物組織培養(yǎng)方面都取得了顯著的成功。
[0006]雖然地黃、金魚草等都是玄參科植物，現(xiàn)今國內(nèi)外對地黃、金魚草等玄參科植物組織培養(yǎng)研宄也相當成熟，但是紅根野蠶豆作為一種名貴而稀缺的中藥材，其組織培養(yǎng)在國內(nèi)外仍然是一片空白，現(xiàn)今紅根野蠶豆的繁殖方法還停留在種子土播的繁殖方式上，這種方法具有成本高、發(fā)芽率低、不易成活(成活率低于百分之一)的缺點。鑒于這些傳統(tǒng)的繁殖方式上的缺點和不足，急待研宄出一套適合紅根野蠶豆組織培養(yǎng)技術(shù)，用于解決紅根野蠶豆自然繁殖能力低的問題，從而在一定程度上滿足人類對紅根野蠶豆的需求，為中藥材發(fā)展帶來更大的社會效益和經(jīng)濟效益。
[0007]植物組織培養(yǎng)方法的專利很多，中國發(fā)明“一種玉米的組織培養(yǎng)方法”，申請?zhí)?01210011592.8通過基因改良與組織培養(yǎng)，以實現(xiàn)玉米的人工快速繁育；中國發(fā)明“一種草莓繼代培養(yǎng)方法”，申請?zhí)?01310212115.2采用低溫-常溫的培養(yǎng)條件，大幅度提高體細胞胚的成熟率，但是紅根野蠶豆組織培養(yǎng)的方法還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，提供一種紅根野蠶豆組織培養(yǎng)方法，用于解決紅根野蠶豆自然繁殖能力低的問題。
[0009]為實現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
[0010]一種紅根野蠶豆組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0011](I)外植體的處理和保存:將從野外采摘回來的紅根野蠶豆種子作為外植體，夕卜植體用84消毒液的100倍稀釋液浸泡8?15分鐘，再用自來水沖洗0.5?I小時，置于干凈的玻璃器皿內(nèi)備用，未用完的放于冰箱內(nèi)保存以便日后使用；
[0012](2)外植體的滅菌:將處理過的外植體置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒25?35秒，再在體積濃度為0.1 %的升未中浸泡8?10分鐘后，用無菌水沖洗2?4次；
[0013](3)外植體接種:將上述滅菌過的外植體破殼接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基采用誘導培養(yǎng)基一號，并進行封口標記；
[0014](4)組織培養(yǎng):將接種好的培養(yǎng)瓶置于25?35 °C的黑暗溫室中培養(yǎng)5?8天，再置于25?35°C的光照溫室中培養(yǎng)25?40天，得到紅根野蠶豆種苗；
[0015](5)繼代培養(yǎng):將培養(yǎng)好的平均株高5?6cm的紅根野蠶豆種苗在超凈工作臺上用接種工具以節(jié)為單位進行切割，將切割好的莖段接種于誘導芽和根的培養(yǎng)基二號中，并進行封口 ；將接種好的苗置于20?30°C的黑暗溫室中培養(yǎng)5?8天后，再置于25?30°C的光照溫室中培養(yǎng)30?50天，得到紅根野蠶豆的完整植株；
[0016](6)煉苗和移栽:將培養(yǎng)好的紅根野蠶豆完整植株置于溫室大棚內(nèi)進行5?8天的煉苗后，進行移栽。
[0017]步驟(3)所述的誘導培養(yǎng)基一號由如下成分組成:以一升計算:常量元素為:NH4N03750 ?850mg、KN03900 ?1000mg、Cal2.2Η20 200 ?250mg、MgS04.7Η20 150 ?200mg、KH2P04320 ?380mg ;微量元素:KI 0.80 ?0.85mg、H3B036.0 ?6.5mg、MnSO4.4Η20 22.0 ?22.5mg、ZnSO4.7H20 8.3 ?8.8mg、Na2MnO4.2H20 0.22 ?0.28mg、CuSO4.5H20 0.022 ?0.028mg、CoCl2.6H20 0.022 ?0.028mg、FeSO4.7H20 27.5 ?28mg、Na2-EDTA.2H20 37 ?37.5mg ;有機成分:肌醇80?120mg、煙酸(λ 3?0.8mg、鹽酸吡哆醇(維生素Β6)0.3?0.8mg、鹽酸硫胺素(維生素BI) 0.3?0.8mg、甘氨酸I?3mg、鹿糖25?35g、馬鈴薯45?55g、瓊脂3?8g、余量為蒸餾水；PH值5.8。
[0018]步驟(5)所述的誘導芽和根的培養(yǎng)基二號由如下成分組成:以一升計算:常量元素為:NH4N03750 ?850mg、KN031800 ?2000mg、Cal2.2H20 420 ?460mg、MgSO4.7H20320 ?360mg、KH2P046 50 ?750mg ;微量元素:KI 0.80 ?0.85mg、Η3Β036.0 ?6.5mg、MnSO4.4Η2022.0 ?22.5mg、ZnSO4.7H20 8.3 ?8.8mg、Na2MnO4.2H20 0.22 ?0.28mg、CuSO4.5H200.022 ?0.028mg、CoCl2.6Η20 0.022 ?0.028mg、FeS04.7Η20 27.5 ?28mg、Na2_EDTA.2Η2037?37.5mg ;有機成分:肌醇80?120mg、煙酸0.3?0.8mg、鹽酸P比B多醇(維生素B6) 0.3?0.8mg、鹽酸硫胺素(維生素BI) 0.3?0.8mg、甘氨酸I?3mg、矮壯素0.8?1.2g、香蕉60?80g、馬鈴薯45?55g、鹿糖25?35g、碳粉0.8?1.2g、瓊脂3?8g、余量為蒸餾水；PH值5.8。
[0019]步驟(3)所述的誘導培養(yǎng)基一號還可以用下列培養(yǎng)基:(l)MS+0?8%馬鈴薯+0?8%椰子汁+3?5%蔗糖+0.4?0.6%瓊脂，PH值5.0-6.0 ；⑵1/2MS+0?8%馬鈴薯+0?8%椰子汁+3?5%蔗糖+0.4?0.6%瓊脂，PH值5.0-6.0 ； (3)N6+0?8%馬鈴薯+0?8%椰子汁+3?5%蔗糖+0.4?0.6%瓊脂，PH值5.0-6.0。
[0020]步驟(5)所述的誘導芽和根的培養(yǎng)基二號還還可以用如下培養(yǎng)基:(l)MS+0.1?0.8mg/16_BA+0.0 ?0.5mg/l NAA+6 ?8% 香焦 +0.5 ?lg/Ι 矮壯素 +0.1 ?0.3% 碳粉+0.4 ?0.6%瓊脂+3 ?5%蔗糖、PH 值 5.0-6.0 ； (2) 1/2MS+0.1 ?0.8mg/l 6-BA+0.0 ?0.5mg/l NAA+6?8%香焦+0.5?lg/Ι矮壯素+0.1?0.3%碳粉+0.4?0.6%瓊脂+3?5%蔗糖，PH 值 5.0-6.0o
[0021]步驟(4)所述光照溫室的光照強度為1500?25001x，光照時間為5?10小時。
[0022]步驟(5)所述的光照室溫的光照強度為2000?30001x，光照時間5?10小時。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用了黑暗溫室-光照溫室的培養(yǎng)條件，完善了誘導培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基及各個時期的培養(yǎng)溫度、光照強度、光照時間，研宄出一整套適合紅根野蠶豆組織培養(yǎng)方法的流程，大大的降低了成本，培育出大量成活率高的紅根野蠶豆試管苗，從而滿足市場對紅根野蠶豆苗木的需求，是紅根野蠶豆組織培養(yǎng)的領(lǐng)跑者，為中藥材發(fā)展帶來更大的社會效益和經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0024]圖1組織培養(yǎng)紅根野蠶豆的流程圖。
【具體實施方式】
[0025]下面通過實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0026]實施例1
[0027]一種紅根野蠶豆組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0028](I)外植體的處理和保存:將從野外采摘回來的紅根野蠶豆作為外植體