專利名稱：用于飼料產(chǎn)品的解毒的角質(zhì)酶的制作方法
用于飼料產(chǎn)品的解毒的角質(zhì)酶關(guān)于序列表本申請(qǐng)含有計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表。通過提述將該計(jì)算機(jī)可讀形式并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種方法，包括使用角質(zhì)酶處理用于使受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污 染的飼料產(chǎn)品解毒。
背景技術(shù)：
谷類上的數(shù)種植物病原性和/或收割后鐮孢屬物種生成家畜和家禽生產(chǎn)者相當(dāng) 關(guān)注的有毒物質(zhì)，例如脫氧瓜萎鐮菌醇(deoxynivalenol)、T_2毒素、ΗΤ_2毒素、蛇形菌素 (diacetoxyscirpenol)禾口玉米赤霉烯酮(zearalenone)。玉米赤霉烯酮在全世界見于多種谷類作物，如玉米(maize，corn)、大麥 (barley)、燕麥(oats)、小麥(wheat)、黑麥(rye)、稻(rice)、粟(millet)和高粱 (sorghum)。在收割之前似乎不發(fā)生顯著量的玉米赤霉烯酮生成，但是在合適的環(huán)境條件 下，它易于在貯藏的谷物和小谷粒(small grains)上生成。當(dāng)在乙醇生產(chǎn)中使用谷類谷物及消耗淀粉時(shí)，玉米赤霉烯酮在發(fā)酵副產(chǎn)物中，例 如在蒸餾酒干酒糟中濃縮。發(fā)酵副產(chǎn)物中的玉米赤霉烯酮含量可以相對(duì)于谷類谷物升高為三倍。該毒素是熱穩(wěn)定的，而且它不受長期貯藏、焙燒(roasting)、或添加丙酸或發(fā)霉延 遲劑破壞。盡管它們的結(jié)構(gòu)與類固醇雌激素類不同，但是玉米赤霉烯酮及其數(shù)種衍生物擁有 雌激素活性。玉米赤霉烯酮經(jīng)歷折疊，使得羥基或潛在羥基變成適當(dāng)取向的，以便于結(jié)合通 常結(jié)合雌激素的組織受體。玉米赤霉烯酮是引起不孕不育、流產(chǎn)或其它育種問題的主要毒素，尤其在豬中。青 春期前的小母豬中的癥狀尤其嚴(yán)重，包括擴(kuò)大的乳房、子宮和外陰腫脹、及卵巢萎縮。在嚴(yán) 重的病例中，可發(fā)生外陰和直腸脫垂。公豬展現(xiàn)擴(kuò)大的乳房和萎縮的睪丸。玉米赤霉烯酮存在于來自用受到污染的谷物喂養(yǎng)的動(dòng)物的肉以及自受到污染的 小麥烤制的面包。雖然罕見人中毒的病例，但是關(guān)注人長期暴露于此類雌激素活性的影響。使用環(huán)氧酶或內(nèi)酯酶滅活真菌毒素，包括玉米赤霉烯酮披露于W09612414。需要使受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污染的動(dòng)物飼料產(chǎn)品，例如發(fā)酵副產(chǎn)物，包括 蒸餾酒濕和干酒糟解毒的其它方法。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用角質(zhì)酶處理飼料產(chǎn)品能降解飼料產(chǎn)品中的玉米赤霉烯 酮。因而，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于降解飼料產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮的方法，該 方法包括用角質(zhì)酶處理所述飼料產(chǎn)品。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供角質(zhì)酶用于降解真菌毒素的用途。發(fā)明詳述
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玉米赤霉烯酮在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“玉米赤霉烯酮”包含自某些鐮孢屬菌種(Fusarium sp.) 生成的真菌毒素玉米赤霉烯酮。IUPAC名稱是(4S，12E)-15，17-二羥基-4-甲基-3-氧雙 環(huán)[12.4.0]十八-12，15，17，19-四烯-2，8-二酮。術(shù)語“玉米赤霉烯酮”還涵蓋玉米赤霉 烯酮的任何衍生物，其包含對(duì)角質(zhì)酶修飾易感的內(nèi)部羧酸酯鍵。動(dòng)物飼料產(chǎn)品術(shù)語“動(dòng)物”包括所有動(dòng)物，包括人類。動(dòng)物的例子有牛(包括但不限于母牛(cow) 和小牛)；單胃動(dòng)物，例如，豬(包括但不限于小豬、飼育豬和母豬)；家禽，如火雞和雞(包 括但不限于仔雞、蛋雞)；和魚(包括但不限于鮭魚)。術(shù)語“飼料”或“飼料產(chǎn)品”指適合或意圖由動(dòng)物攝取的任何化合物、制備物、混合 物或組合物。飼料產(chǎn)品可以是不含有害水平(unwanted level)的玉米赤霉烯酮的產(chǎn)品，其適合 動(dòng)物消費(fèi)。飼料產(chǎn)品也可以是懷疑包含有害水平的玉米赤霉烯酮的產(chǎn)品、和/或具有未知 水平的玉米赤霉烯酮的產(chǎn)品，包括不包含可檢測(cè)水平的玉米赤霉烯酮的產(chǎn)品。優(yōu)選的是，飼料產(chǎn)品是基于谷物的產(chǎn)品。優(yōu)選的是，基于谷物的產(chǎn)品包含谷類，例 如玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、高粱和粟中的一種或多種。還優(yōu)選的是基于谷物的產(chǎn)品，其包 含源自玉米、小麥、大麥、黑麥、稻、高粱和粟中的一種或多種的材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，飼 料產(chǎn)品可以例如僅僅衍生自谷類，而且在另一個(gè)實(shí)施方案中，部分源自豆類(例如大豆)且 部分源自谷類?；诠任锏漠a(chǎn)品可包含整個(gè)的或碾碎的谷物，例如濕磨或干磨的谷物，包括 含有濕磨或干磨谷物的級(jí)分(例如面筋(gluten)、蛋白質(zhì)、淀粉、和/或油級(jí)分)的基于谷 物的產(chǎn)品。還優(yōu)選包含來自釀造和/或發(fā)酵方法的副產(chǎn)物，例如酒糟的產(chǎn)品。酒糟指來自 含酒精飲料和乙醇燃料生產(chǎn)的副產(chǎn)物。啤酒酒糟(BSG)指使用發(fā)芽大麥作為主要原材料的 啤酒廠中制造啤酒的殘余物。蒸餾酒酒糟(DSG)是蒸餾酒廠中通過自發(fā)酵的谷物如玉米、 小麥、大麥、黑麥、和稻蒸餾取出酒精后剩下的產(chǎn)物。蒸餾酒酒糟也稱作蒸餾酒糟。將濕蒸 餾酒酒糟(WDG)干燥以生成干蒸餾酒酒糟(DDG)，其主要用作動(dòng)物飼料。角質(zhì)酶在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“角質(zhì)酶”包括酶分類E. C. 3. 1. 1.74所包含的酶。優(yōu)選 下文所述酶以及具有同源序列的酶，尤其是重組的和/或基本上純化的酶。角質(zhì)酶可以源自真菌。具體而言，角質(zhì)酶可以源自腐質(zhì)霉屬(Humicola)，特別是特 異腐質(zhì)霉(H. insolens)的菌株，更特別的是特異腐質(zhì)霉菌株DSM1800 (US 5，827，719)或鐮 孢屬(Fusarium)，例如大刀粉紅鐮孢(F. roseumculmorum)，或特別是茄病鐮孢(F. solani pisi)的菌株(W0 90/09446 ；W094/14964，WO 94/03578)。真菌角質(zhì)酶也可以源自絲核菌屬 (Rhizoctonia)，例如立枯絲核菌(R. solani)的菌株或鏈格孢屬(Alternaria)，例如甘藍(lán) 鏈格孢(A.brassicicola)的菌株(W0 94/03578)。角質(zhì)酶也可以是親本角質(zhì)酶的變體，如 記載于WO 00/34450或WO 01/92502的那些，通過提述都并入本文。角質(zhì)酶可以是特異腐 質(zhì)霉角質(zhì)酶的變體，其包含取代E6Q、G8D、A14P、mOT、E47K、S48E、R51P、A88H、A91H、A130V、 E179Q和R189V，其披露于10038. 204-W0的第24頁第11行。SEQ ID NO 1是特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶的氨基酸序列(對(duì)應(yīng)于US 5，827，719的SEQ ID NO :2 的和 WO 01/92502 的 SEQ ID NO :1 的成熟部分)，而 SEQ ID NO :2 是依照 WO 94/14964圖ID的茄病鐮孢的氨基酸序列。角質(zhì)酶必須以有效量存在于待解毒的培養(yǎng)基中。優(yōu)選的是，角質(zhì)酶以0. Ol-IOOmg 酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)，優(yōu)選0. I-IOmg酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)，或更優(yōu)選l_5mg酶蛋白質(zhì)每 kg干物質(zhì)的濃度存在。培養(yǎng)基在一個(gè)實(shí)施方案中，角質(zhì)酶降解包含飼料產(chǎn)品的培養(yǎng)基中的玉米赤霉烯酮。所述 培養(yǎng)基優(yōu)選是含水的，而且可以是液體、糊體或漿體。為了形成合適的培養(yǎng)基，可以向飼料 產(chǎn)品添加水?？梢栽谶m合施用于所述培養(yǎng)基的固體或液體配制物中包含角質(zhì)酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，角質(zhì)酶降解玉米赤霉烯酮至一定程度，由此每kg干物質(zhì)飼料 產(chǎn)品的玉米赤霉烯酮含量降低至少于初始量的50%，優(yōu)選少于60%，更優(yōu)選少于70%，和 最優(yōu)選少于80%。本發(fā)明的解毒效率取決于例如培養(yǎng)基的緩沖劑、溫度、pH和水的可用性。例如，可 以在實(shí)際角質(zhì)酶的相對(duì)活性為至少50、或60、或70、或80或90%的pH值進(jìn)行處理。同樣 地，例如，可以在實(shí)際角質(zhì)酶的相對(duì)活性為至少50、或60、或70、或80或90%的溫度進(jìn)行處 理。相對(duì)于觀察到最高活性的PH值處的活性計(jì)算相對(duì)活性。培養(yǎng)基中的DH根據(jù)所采用的角質(zhì)酶的特征等，所采用的培養(yǎng)基中的pH通常應(yīng)當(dāng)在5-11的范圍 中，優(yōu)選在范圍6-10中，例如6. 5-8. 5。培養(yǎng)基中的溫度優(yōu)選的是，應(yīng)用接近角質(zhì)酶的最適溫度的反應(yīng)溫度。在本發(fā)明的眾多實(shí)施方案中， 應(yīng)當(dāng)采用10-65°C的范圍中的溫度，更優(yōu)選30-50°C。處理持續(xù)時(shí)間處理持續(xù)時(shí)間取決于處理類型、待處理的項(xiàng)目的類型、培養(yǎng)基的特性(例如溫度 和PH)及所采用的酶的類型和量等。繼續(xù)酶促反應(yīng)，直至實(shí)現(xiàn)期望的結(jié)果，之后可以通過滅活酶(例如通過熱處理步 驟)來終止，或者不這樣做。為了解毒目的，可采用1分鐘至1周的范圍中的處理時(shí)間。在許多情況中，6-48小 時(shí)的范圍中的處理時(shí)間會(huì)是合適的。同一性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性以參數(shù)“同一性”來描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS包(EMBOSS =The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,Trends in Genetics 16 276-277)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970， J. Mol. Biol. 48 443-453)來確定，優(yōu)選3. 0. 0版或其后版本。所使用的任選參數(shù)是缺口 打開罰分10，缺口延伸罰分0. 5，和EBL0SUM62 (EMB0SS版本的BL0SUM62)取代矩陣。使用 Needle標(biāo)記的“最長同一性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的輸出作為百分比同一性，且如 下計(jì)算(相同殘基xl00)/(比對(duì)長度-比對(duì)中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用EMBOSS包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，見上 文)的 Needle 程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，見上文) 來確定，優(yōu)選3. 0. 0版或其后版本。所使用的任選參數(shù)是缺口打開罰分10，缺口延伸罰分
0.5，和EDNAFULL(EMB0SS版本的NCBI NUC4. 4)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記的“最長同一 性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得的)的輸出作為百分比同一性，且如下計(jì)算(相同脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對(duì)長度-比對(duì)中的缺口總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”定義為在用規(guī)定序列進(jìn)行的tfasty搜索(Pearson，W. R.，1999， 于 Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener 禾口 S. A. Krawetz 編，pp. 185-219) 中給出小于0.001的E值(或期望值)的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)。術(shù)語“同源序列”也可以定義為與規(guī)定序列具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或甚至100 %的同一性程度的序列。
實(shí)施例實(shí)施例1塵重組生產(chǎn)的酶組合物，其包含10038. 204-W0第24頁第11行披露的來自特異 腐質(zhì)霉的角質(zhì)酶變體。測(cè)定法在裝有玉米赤霉烯酮30 μ Μ, Tris IOOmM和酶0. Img EP/mL的Eppendorf 管中的300微升體積中進(jìn)行反應(yīng)。在對(duì)照反應(yīng)中，用等量的H2O取代酶體積。將反應(yīng)于37°C 溫育24小時(shí)，之后通過添加600微升100 μ M乙腈終止溶液來終止。將反應(yīng)物保存于_20°C， 直至層析分析。層析分析將樣品離心，并如Smedsgaard (J. Chromatogr. A, 1997, 760, 264-270)所述通過HPLC-DAD對(duì)上清液分析玉米赤霉烯酮。DAD掃描200_600nm。在 Phenomenex (Torrance, CA) Luna C18(2) 10 X 2mm ID，3 微米，柱 2 上使用線性梯度 5%變動(dòng) 至100%乙腈在20分鐘里進(jìn)行分離。相對(duì)于對(duì)照計(jì)算殘余玉米赤霉烯酮。結(jié)果呈現(xiàn)于表1。M 1PH 7溫育24小時(shí)后的殘金玉米,未g《希_。_酶殘余玉米赤霉烯酮(％ )_對(duì)照100角質(zhì)酶19
權(quán)利要求
一種用于降解飼料產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮的方法，該方法包括用角質(zhì)酶處理所述飼料產(chǎn)品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述角質(zhì)酶的劑量是0.Ol-IOOmg酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)，優(yōu) 選0. I-IOmg酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)，或更優(yōu)選l_5mg酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料產(chǎn)品是基于谷物的飼料產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料產(chǎn)品包含選自玉米、小麥、大麥、黑 麥、稻、高粱和粟中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料產(chǎn)品是動(dòng)物飼料組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料產(chǎn)品是來自發(fā)酵方法的副產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料產(chǎn)品包括啤酒酒糟、蒸餾酒酒糟、蒸 餾酒濕酒糟、和/或蒸餾酒干酒糟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法，其中所述飼料產(chǎn)品是豬飼料產(chǎn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法，其中所述角質(zhì)酶是具有SEQID NO :1所示序列或 同源序列的角質(zhì)酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法，其中所述角質(zhì)酶是SEQID NO :1所示角質(zhì)酶的 變體，所述變體包含取代G8D、N15D、S48E、A88H、N91H、A130V和R189V中的一個(gè)或多個(gè)，如 包括全部上述取代。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中所述角質(zhì)酶是具有SEQIDNO :2所示序列 或同源序列的角質(zhì)酶。
12.角質(zhì)酶用于降解真菌毒素的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其中所述真菌毒素是玉米赤霉烯酮。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13任一項(xiàng)的用途，其用于基于谷物的飼料產(chǎn)品。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的用途，其中所述角質(zhì)酶的劑量是0.Ol-IOOmg酶蛋白 質(zhì)每kg干物質(zhì)，優(yōu)選0. I-IOmg酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)，或更優(yōu)選l_5mg酶蛋白質(zhì)每kg干物質(zhì)。全文摘要
本發(fā)明涉及一種方法，包括用于受到真菌毒素玉米赤霉烯酮污染的飼料產(chǎn)品的解毒的角質(zhì)酶處理。
文檔編號(hào)A23K1/18GK101902924SQ200880122226
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者伯思·H·索倫森, 安德斯·維克索-尼爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司