專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因方法，特別是涉及一種農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
十字花科(Crucifeme)植物菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort)是我國(guó)南北各 地廣泛種植的一種大宗中草藥，其根和葉是常用中藥板藍(lán)根和大青葉的主 要來(lái)源。板藍(lán)根在臨床上用途較廣，除板藍(lán)板注射液外，主要常與其它中 藥組成復(fù)方廣泛用于治療多種疾病如流感、腮腺炎、乙腦、肝炎，是公認(rèn) 的有較好抗病毒效果的中藥之一，此外，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、 解熱、緩?fù)吹人幚碜饔谩?br> 80年代開(kāi)始利用根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium) 的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單 子葉植物，甚至是裸子植物而誘發(fā)植物產(chǎn)生毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌中含有致 使植物產(chǎn)生毛狀根的Ri質(zhì)粒，在Vir區(qū)基因產(chǎn)物協(xié)助下，Ri質(zhì)粒中的T-DNA 片段能轉(zhuǎn)移進(jìn)植物核基因組中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化成功的植物產(chǎn)生大量的毛狀根。 毛狀根具有生長(zhǎng)速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可藥用的次 生代謝產(chǎn)物的特征。農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上攜帶的生根基因不僅能使被感染植物 部位產(chǎn)生大量的毛狀根，而且由產(chǎn)生的毛狀根還可以獲得再生的轉(zhuǎn)化植株， 這些植株可表現(xiàn)出許多穩(wěn)定遺傳的表現(xiàn)變異，在植物品種的改良方面具有 較廣闊的應(yīng)用前景。
目前已有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因方法申請(qǐng)了專利，如申請(qǐng)?zhí)枮?00510037948.5的"一種楊樹(shù)的農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化方法"等，這些方法目前 存在如下問(wèn)題 一是都包含有共培養(yǎng)步驟，因此轉(zhuǎn)化步驟多，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)， 轉(zhuǎn)化成本高；二是外植體除菌是通過(guò)在增殖培養(yǎng)基或/和篩選培養(yǎng)基中加入 抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因而只能去除與培養(yǎng)基相接觸的表面上的細(xì)菌，其它未 與培養(yǎng)基接觸的表面上的細(xì)菌則不能去除，因此除菌效果不佳，存活率低； 三是轉(zhuǎn)化率較低。
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)化成本低、除菌效果好的農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，該方法取消了共培養(yǎng)步驟。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案包括如下步驟
將農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 2天后，用牙簽挑取 生長(zhǎng)好的單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)；
將菘藍(lán)種子先用無(wú)菌水浸泡，再用消洗靈浸泡，然后用無(wú)菌水沖洗2 4次，再用1%。的升汞消毒，并在消毒后用無(wú)菌水沖洗2 4次，最后用無(wú) 菌濾紙吸干水分，接種于MS固體培養(yǎng)基中，在光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
將上述獲得的菘藍(lán)無(wú)菌苗切成約1 2cm長(zhǎng)的外植體，接種于MS固體 培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)12 48小時(shí)，然后放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中，在超聲 波的輔助下振蕩浸泡，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，用無(wú)菌 濾紙吸干外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)毛狀根，當(dāng)篩選 培養(yǎng)基上出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌斑時(shí)，取出外植體先用無(wú)菌水沖洗2 4次，再用含 有抗生素的脫菌水除菌，然后用無(wú)菌濾紙吸干水后，接入新配制的篩選培 養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，直至產(chǎn)生毛狀根；
將上述獲得的毛狀根接入液體增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生大量的毛狀根。
上述菘藍(lán)種子先用無(wú)菌水浸泡2 6小時(shí)后，再用0.02%的消洗靈浸泡 2 6min， 1%。的升汞消毒1 2次，每次3 5min。
所采用的農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834或Ril601 ，培養(yǎng)溫度為25 30°C，所培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液OD6(xr0.3 0.8。
上述菘藍(lán)外植體在農(nóng)桿菌菌液中浸泡8 15min，其中用超聲波輔助超 聲作用為1 3min。
上述篩選培養(yǎng)基是1/2MS+頭孢噻肟鈉200 500mg/L+瓊脂6 8g/L +蔗糖15 25§/1^，誘導(dǎo)毛狀根的培養(yǎng)溫度為25 3(TC，光照強(qiáng)度為1500 2000Lx，每天光照8 16小時(shí)。
上述脫菌水為含200 500mg/L頭孢噻后鈉的抗菌素水，用脫菌水除菌 的時(shí)間為3 10min。
上述MS固體培養(yǎng)基為MS+瓊脂6 8g/L+蔗糖20 30g/L，培養(yǎng)溫度 為25 28'C，光照強(qiáng)度為1500 2000Lx，每天光照8 16小時(shí)。
本方案中毛狀根最好采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，所選擇的液體增 殖培養(yǎng)基為1/2MS+頭孢噻肟鈉200 500mg/L+蔗糖15 25g/L。
本發(fā)明具有如下效果
(1) 取消了共培養(yǎng)步驟，將浸染后的外植體直接接入含有抗生素的篩選 培養(yǎng)基中，大大地減少了除菌環(huán)節(jié)，并由此節(jié)約了大量的藥品，降低了轉(zhuǎn) 化成本；另外，增加了用含有抗生素的脫菌水清洗帶有農(nóng)桿菌的外植體， 并用無(wú)菌濾紙吸干植物體表面的水分，可使轉(zhuǎn)化外植體的存活率增高30% 以上，從而使得毛狀根的誘導(dǎo)率也明顯增高。
(2) 在用農(nóng)桿菌浸染外植體時(shí)，利用了超聲波作輔助，從而使外植體與 農(nóng)桿菌能充分接觸，可提高轉(zhuǎn)化率20%以上；
(3) 操作簡(jiǎn)單、易推廣。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 (l)菌種及其活化
將發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上，27。C活化2次后用牙簽在培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)好的單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中，在27°C 、 100r/min的條件下震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，至OD6。。=0.4 0.5時(shí)，即可用于浸染;
(2) 無(wú)菌苗的獲得
選取飽滿的菘藍(lán)種子先用無(wú)菌水浸泡5小時(shí)，再用0.02%的消洗靈浸泡 3min，然后用無(wú)菌水洗滌4次，再在超凈工作臺(tái)上用1%。的升汞洗滌兩次， 每次2min，然后用無(wú)菌水洗滌4次，放于無(wú)菌濾紙上吸干表面多余水分后， 放入固體培養(yǎng)基MS+瓊脂6 8g/L+蔗糖20 30g/L中，在27'C、每天光照 16小時(shí)，光照強(qiáng)度為1800Lx的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，7天即可得到無(wú)菌苗；
(3) 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)
選擇健壯的無(wú)菌苗，用手術(shù)刀將其切割成子葉、下胚軸、帶子葉下胚 軸三種長(zhǎng)約1 2cm左右的外植體，子葉在主脈上切傷處理。將外植體接種 于固體培養(yǎng)基MS+瓊脂6 8g/L+蔗糖20 30gL中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)后，放入 (l)步驟培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液中浸泡15min，其中輔以超聲波儀超聲處理的時(shí) 間為2min，然后取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸干植物體表面多余的菌液，放 入篩選培養(yǎng)基1/2MS+頭孢噻肟鈉300mg/L+瓊脂6 8g/L+蔗糖15 25g/L， 在27。C暗培養(yǎng)1天后見(jiàn)光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1800Lx，每天光照12小時(shí)， 當(dāng)篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生農(nóng)桿菌菌斑時(shí)，立即用無(wú)菌水洗滌3次，再用含有 300mg/L頭孢噻肟鈉的脫菌水浸泡5min，然后用無(wú)菌濾紙吸干植物體表面 多余的水分，放入新配制的篩選培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，直到產(chǎn)生毛狀根；
(4) 毛狀根的增殖培養(yǎng)
將(3)步驟獲得的毛狀根切成3cm長(zhǎng)，放入液體增殖培養(yǎng)基1/2MS+頭 孢噻肟鈉300mg/L+蔗糖15 25g/L中，在，27'C，光照強(qiáng)度1800Lx，每天 光照15小時(shí)條件下培養(yǎng)25天，產(chǎn)生大量的毛狀根，經(jīng)PCR鑒定，發(fā)根農(nóng) 桿菌含有的RiT-DNA已整合入菘藍(lán)基因組中并得到表達(dá)。本實(shí)施例的轉(zhuǎn)化 率可達(dá)70%。實(shí)施例2
本實(shí)施例除農(nóng)桿菌選用Ril6021夕卜，其它步驟與實(shí)施例1相同。本實(shí) 施例的轉(zhuǎn)化率為48%，說(shuō)明Ril601的效果不如ATCC15834好。 實(shí)施例3
本實(shí)施例中篩選培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中抗生素頭孢噻肟鈉的濃度為 200mg/L，其它步驟與實(shí)施例l相同。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化外植體的染菌率高 于實(shí)施例l，而存活率低于實(shí)施例l，說(shuō)明不同濃度的抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的抑 菌作用是不同的。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于包括下述步驟將農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～2天后，用牙簽挑取生長(zhǎng)好的單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)；將菘藍(lán)種子先用無(wú)菌水浸泡，再用消洗靈浸泡，然后用無(wú)菌水沖洗2～4次，再用1‰的升汞消毒，并在消毒后用無(wú)菌水沖洗2～4次，最后用無(wú)菌濾紙吸干水分，接種于MS固體培養(yǎng)基中，在光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)；將上述獲得的菘藍(lán)無(wú)菌苗切成約1～2cm長(zhǎng)的外植體，接種于MS固體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)12～48小時(shí)，然后放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中，在超聲波的輔助下振蕩浸泡，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)毛狀根，當(dāng)篩選培養(yǎng)基上出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌斑時(shí)，取出外植體先用無(wú)菌水沖洗2～4次，再用含有抗生素的脫菌水除菌，然后用無(wú)菌濾紙吸干水后，接入新配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，直至產(chǎn)生毛狀根；將上述獲得的毛狀根接入液體增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生大量的毛狀根。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征 在于菘藍(lán)種子先用無(wú)菌水浸泡2 6小時(shí)后，再用0.02%的消洗靈浸泡2 6min， 1%。的升汞消毒1 2次，每次3 5min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征 在于所述農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834或Ri1601，培養(yǎng)溫度為25 30°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其 特征在于所培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌液OD6()f0.3 0.8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于菘藍(lán)外植體在超聲波輔助下振蕩浸泡的時(shí)間為8 15min，其中超聲 波作用的時(shí)間為1 3min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征 在于所述篩選培養(yǎng)基是1/2MS+頭孢噻肟鈉200 500mg/L+瓊脂6 8g/L+ 蔗糖15 25g/L，誘導(dǎo)毛狀根的培養(yǎng)溫度為25 30°C，光照強(qiáng)度為1500 2000Lx，每天光照8 16小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征 在于所述脫菌水為含200 500mg/L頭孢噻肟鈉的抗菌素水。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其 特征在于用脫菌水除菌的時(shí)間為3 10min。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特征 在于所述液體增殖培養(yǎng)基為1/2MS+頭孢噻躬鈉200 500mg/L+蔗糖15 25g/L。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，其特 征在于所述MS固體培養(yǎng)基為MS+瓊脂6 8g/L+蔗糖20 30g/L，培養(yǎng) 溫度為25 28。C，光照強(qiáng)度為1500 2000Lx，每天光照8 16小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菘藍(lán)轉(zhuǎn)基因方法，該方法包括如下步驟(1)將菘藍(lán)種子接種到MS培養(yǎng)基中獲得無(wú)菌苗外植體；(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌接入YEB培養(yǎng)基中，制備所需的菌液；(3)將外植體通過(guò)預(yù)培養(yǎng)后，浸入已活化的農(nóng)桿菌菌液中，利用超聲波輔助，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸后，取出外植體轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)將獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根進(jìn)行增殖培養(yǎng)。本發(fā)明取消了共培養(yǎng)步驟，增加了用含有抗生素的脫菌水清洗外植體，從而使轉(zhuǎn)化外植體的存活率明顯增高，轉(zhuǎn)化時(shí)間也明顯縮短，降低了轉(zhuǎn)化成本；另外由于在用農(nóng)桿菌浸染外植體時(shí)，利用了超聲波作輔助，因此提高了轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)A01H5/06GK101280319SQ20081004507
公開(kāi)日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者何俊蓉, 孫雁霞, 張海強(qiáng), 徐文俊, 王躍華, 鄔曉勇 申請(qǐng)人:成都大學(xué)