專利名稱：一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生方法，特別是涉及一種 以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法。
背景技術(shù)：
川芎為我國最常見的中藥材之一，同時(shí)也是近幾年國際市場的暢銷植 物藥，是許多保健品和藥品的重要原料。由于該藥材受地理?xiàng)l件的限制， 所以其栽種面積有限，主要分布在我國四川省都江堰。川芎為兩年生植物， 由于川芎植物結(jié)實(shí)困難，歷來川芎的育種方法都是采用傳統(tǒng)的莖節(jié)營養(yǎng)繁 殖栽培，這種方法由于育種期間需要進(jìn)行山區(qū)育苓、壩區(qū)栽種等環(huán)節(jié)，因 此育種周期較長；另外，所采用的種芎種質(zhì)資源"苓種"自身存在易衰老 和易受病毒侵染等缺陷，因而造成川芎種性退化和品質(zhì)下降，并易使川芎 在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏中大量產(chǎn)生各種嚴(yán)重的病蟲害。因此川芎的種質(zhì)資源質(zhì)量問 題及育種時(shí)間長一直是困擾川芎大規(guī)模生產(chǎn)和提高產(chǎn)品質(zhì)量的難題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的育種時(shí)間長、種質(zhì)資源不穩(wěn)定、 "苓種"自身易衰老和帶菌等問題而提供一種以幼嫩葉片為外植體的川芎 組織培養(yǎng)快繁方法，該方法可以大量快速地繁殖出生長速度快、品質(zhì)優(yōu)和 染菌率低的川芎組培苗。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案是先將作為外植體的川芎 幼嫩葉片進(jìn)行消毒處理，然后將葉片剪成適當(dāng)大小，接種到愈傷組織培養(yǎng) 基上；45天后將愈傷組織分割成適當(dāng)大小，再轉(zhuǎn)接到不定芽的分化培養(yǎng)基上，當(dāng)芽長至2 3cm以上時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)， 并將基部愈傷組織再切成小塊，轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上，以便形成更 多的不定芽；當(dāng)組培苗不定根長至2cm以上時(shí)，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3 4天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的蛭石介 質(zhì)中；上述愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 0 0.5mg/L+2.4-D 1 3mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂7.0g/L， PH值5.8 6.5;上述分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 0.5mg/L+IAA 0.1 0.8mg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂7.0g/L， PH值5.8 6.5;上述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 0.5mg/L+IBA 0.1 0.5mg/L+蔗 糖15g/L+瓊脂7.0g/L， PH值5.8 6.5;上述培養(yǎng)條件為溫度18 22°C、每天光照11 13小時(shí)、光照強(qiáng)度 1500 2000Lx。上述解決方案中可采用的外植體消毒方法可以有很多，常用的消毒劑 有70 75%乙醇、次氯酸鈉溶液、二氯化汞溶液等，本發(fā)明優(yōu)選的方法是 先用洗衣粉浸泡外植體2 5分鐘，再用流水沖洗2 3小時(shí)，然后在無菌 條件下分別采用濃度為70 75%的乙醇消毒10 20秒、濃度為0.1%的升 汞處理3 6分鐘，最后用無菌水沖洗3 4次。上述解決方案中將組培苗移栽至松軟的蛭石介質(zhì)后，應(yīng)適當(dāng)遮光，并 保持溫度在1S 22。C，相對(duì)濕度為75 85%，這樣組培苗的生長更快、更健祐。上述解決方案中的最佳愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+2， 4-D2mg./L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 一定范圍內(nèi)的2， 4-D有 利于愈傷組織生長，但過高的2.4-D濃度則有抑制愈傷組織生長的作用，并 發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用2， 4-D的培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷組織生長速度較快，且十分有利于川芎進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，但不利于后期的不定芽分化；而同時(shí)加入了 2.4-D和6-BA兩種激素的培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷組織雖生長速度稍慢，但有利 于后期的不定芽分化，所以本發(fā)明優(yōu)選的愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+2， 4隱D2mg/L。上述解決方案中的最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。采用這種濃度配比的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分 化培養(yǎng)巧，不定芽的誘導(dǎo)率最高，且苗生長速度快、健壯。上述解決方案中的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L。采用這種濃度配比的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生 根培養(yǎng)時(shí)，生根率最高，且根分化速度快、根系發(fā)達(dá)及根粗壯。本發(fā)明采用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)組培苗所花的時(shí)間與傳統(tǒng)育種所花的時(shí) 間相比大大縮短，而且培養(yǎng)的組培苗自身生長健壯、不易感染病毒，因此 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是能在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖出優(yōu)質(zhì)的川芎組培苗，從而 滿足川芎大規(guī)模生產(chǎn)的需求。另外實(shí)施本發(fā)明方法，只需有簡單的植物組 織培養(yǎng)設(shè)備即可進(jìn)行，因此實(shí)用性強(qiáng)，可行性高，且不受季節(jié)限制。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1) 外植體的消毒先將作為外植體的川芎幼嫩葉片放入洗衣粉液中浸泡2分鐘，再用流 水沖洗2.5小時(shí)，然后在無菌條件下分別采用濃度為70%的乙醇消毒10秒， 濃度為0.1%的升汞處理3分鐘，最后用無菌水清洗4次；(2) 愈傷組織的培養(yǎng)將消毒后的葉片剪成適當(dāng)大小，接種到愈傷組織培養(yǎng)基 MS+6-BA0.5mg/L+2， 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L上，并在24 26°C 、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為1500 2000Lx進(jìn)行培養(yǎng)，45天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo) 率為65%;(3) 分化培養(yǎng)45天后將愈傷組織分割成適當(dāng)大小，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基 MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L上，并在24 26°C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為1500 2000Lx進(jìn)行分化培養(yǎng)，培養(yǎng) 25天后，陸續(xù)開始在愈傷組織上有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)，經(jīng)3 4周后長出不定芽， 培養(yǎng)50天后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率為45%;(4) 生根培養(yǎng)將長到2cm以上的不定芽從愈傷組織上切割下來，接種到生根培養(yǎng)基 1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L上進(jìn)行生根培 養(yǎng)，并把剩下的基部愈傷組織切成小塊，再轉(zhuǎn)接到上述不定芽分化培養(yǎng)基 上，繼續(xù)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，以便形成更多的不定芽。不定芽在轉(zhuǎn)接到生 根培養(yǎng)基上35天左右陸續(xù)在莖基部四周長出較粗壯的不定根，培養(yǎng)50天 后統(tǒng)計(jì)生根率為64%; (5)煉苗和移栽當(dāng)組培苗長至2cm以上時(shí)，選擇生長較健壯、根系較發(fā)達(dá)的壯苗逐漸 打開瓶蓋，讓幼苗慢慢地適應(yīng)周圍環(huán)境，在室內(nèi)煉苗3天后，移栽至松軟 的蛭石介質(zhì)中，適當(dāng)遮光，溫度保持在2(TC左右，相對(duì)濕度在75 85%， 組培苗生長健壯。實(shí)施例2愈傷組織培養(yǎng)基采用MS+2， 4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，其它步驟同實(shí)施例1。采用該愈傷組織培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，45天后統(tǒng)計(jì)其誘 導(dǎo)率為67.5%，略高于實(shí)施例l。所產(chǎn)生的愈傷組織生長速度較快，且十分 有利于川芎進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，但不利于后期的不定芽分化。而采用實(shí)施例1的愈傷組織培養(yǎng)基雖然誘導(dǎo)率稍低，愈傷組織生長速度稍慢，但有利 于后期不定芽的分化。 實(shí)施例3愈傷組織培養(yǎng)基采用MS+6-BA0.5mg /L+2， 4-D3mg/L+蔗糖30g/L+瓊 脂7.0g/L，其它步驟同實(shí)施例l。采用該愈傷組織培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，45 天后統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率為55%，低于實(shí)施例l、實(shí)施例2，但不明顯。而當(dāng)2， 4-D的濃度為4mg/L時(shí)，45天后統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率僅為25%，出現(xiàn)了明顯下降。實(shí)施例4分化培養(yǎng)基采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它歩驟同實(shí)施例l。 50天后統(tǒng)計(jì)其不定芽誘導(dǎo)率為27.5%，低于 實(shí)施例1 。實(shí)施例5分化培養(yǎng)基采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L上，其它步驟同實(shí)施例l。 50天后統(tǒng)計(jì)其不定芽誘導(dǎo)率為17.5%。 實(shí)施例6分化培養(yǎng)基采用MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實(shí)施例l， 50天后統(tǒng)計(jì)其不定芽誘導(dǎo)率為42%。 實(shí)施例7生根培養(yǎng)采用1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂 7.0g/L，其它步驟同實(shí)施例l。 50天后統(tǒng)計(jì)生根率為53%。 實(shí)施例8生根培養(yǎng)基采用1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊月旨 7.0g/L，其它步驟同實(shí)施例l。 50天后統(tǒng)計(jì)生根率為40.2%。 實(shí)施例9生根培養(yǎng)基采用1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L，其它步驟同實(shí)施例l。 50天后統(tǒng)計(jì)生根率為51%。 實(shí)施例10生根培養(yǎng)基采用1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂 7.0g/l，其它步驟同實(shí)施例l。 50天后統(tǒng)計(jì)生根率為36.2%。
權(quán)利要求
1.一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于先將作為外植體的川芎幼嫩葉片進(jìn)行消毒處理，然后將葉片剪成適當(dāng)大小，接種到愈傷組織培養(yǎng)基上；45天后將愈傷組織分割成適當(dāng)大小，再轉(zhuǎn)接到不定芽的分化培養(yǎng)基上；當(dāng)芽長至2～3.0cm以上時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，并將基部愈傷組織再切成小塊，轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上，以便形成更多的不定芽；當(dāng)組培苗不定根長至2cm以上時(shí)，打開瓶蓋，在室內(nèi)煉苗3～7天后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去培養(yǎng)基，將其移栽至松軟的蛭石介質(zhì)中；上述愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 0～0.5mg/L+2，4-D 1～3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；上述分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IAA 0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；上述生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L，PH值5.8～6.5；上述培養(yǎng)條件為溫度18～22℃、每天光照11～13小時(shí)、光照強(qiáng)度1500～2000Lx。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快 繁方法，其特征在于所采用的消毒方法是先用洗衣粉浸泡外植體2 5分 鐘，再用流水沖洗2 3小時(shí)，然后在無菌條件下分別采用70 75%的乙醇 消毒10 20秒、0.1%升汞處理3 6分鐘，最后用無菌水沖洗3 4次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培 養(yǎng)快繁方法，其特征在于將組培苗移栽至松軟的蛭石介質(zhì)后，應(yīng)適當(dāng)遮 光，并保持溫度在20 25'C，相對(duì)濕度為75 85%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法，其特征在于愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+2， 4-D 2mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快 繁方法，其特征在于分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+ 蔗糖30g/L+瓊脂7.0g/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快 繁方法，其特征在于生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L+ 蔗糖15g/L+瓊脂7.0g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以幼嫩葉片為外植體的川芎組織培養(yǎng)快繁方法，該方法包括外植體的消毒、愈傷組織的培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗和移栽步驟，所采用的愈傷組織培養(yǎng)基為MS+6-BA 0～0.5mg/L+2，4-D1～3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5～7.0g/L；分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1～0.5mg/L+NAA0.1～0.8mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5～7.0g/L；生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂6.5～7.0g/L。本發(fā)明方法可以大量快速繁殖出生長速度快、品質(zhì)優(yōu)、染菌率低的川芎組培苗，從而滿足大規(guī)模生產(chǎn)川芎的需求。
文檔編號(hào)A01G31/00GK101243774SQ20081004498
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者暢 劉, 潔 吳, 孫雁霞, 張海強(qiáng), 徐文俊, 王躍華, 鄔曉勇, 馬丹煒 申請(qǐng)人:成都大學(xué)