專利名稱：無乳鏈球菌疫苗的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于保護魚類抵御無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染的新疫苗和制備該疫苗的新方法。
無乳鏈球菌是在許多種類的養(yǎng)殖魚類和野生魚類中導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟損失的B組鏈球菌細菌。該感染性細菌普遍存在于水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施中，在所述養(yǎng)殖設(shè)施中，魚被密集地養(yǎng)殖在淡水、微咸水或海水中。高密度的魚和所述水環(huán)境有利于鏈球菌疾病的快速傳播。此外，受感染的養(yǎng)殖魚類可將所述疾病傳播給野生魚群體，或受感染的野生魚類可將疾病傳播給養(yǎng)殖魚類。
現(xiàn)有技術(shù)的描述以前曾利用基于腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射的策略開發(fā)出抗各種鏈球菌和腸球菌(Enterococcus)種類的疫苗。已開發(fā)出用于預(yù)防鏈球菌癥的數(shù)種可注射的疫苗，盡管這些疫苗中的許多種在其配制上不同。Eldar等人(Development and efficacy of a vaccine againstStreptococcus iniae infection in farmed rainbow trout，VetImmunol Immunopathol 1997；56175-183)報導(dǎo)了在用福爾馬林滅活的海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)疫苗進行腹膜內(nèi)(IP)接種后，虹鱒魚獲得了保護。Klesius等人[Efficacy of a killedStreptococcus iniae vaccine in tilapia(Oreochromis niloticus)，Bull Eur Ass Fish Pathol 1999；19(1)38-41；和Efficacy of asingle and combined Streptococcus iniae isolate vaccineadministered by intraperitoneal and intramuscular routes intilapia(Oreochromis niloticus)，Aquaculture 2000；188(3-4)237-246]已開發(fā)了由整個細胞和濃縮的細胞外產(chǎn)物組成的經(jīng)修飾的滅活海豚鏈球菌疫苗。經(jīng)免疫的25g羅非魚(尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus))具有95.3的相對百分比存活率(RPS)，而100g羅非魚具有在84.2至94的變化范圍內(nèi)的RPS值。在用富含類毒素的菌苗bacterin接種后，保護了大菱鲆(大菱鲆(Scophthalmus maximus)抵御腸球菌的侵害[Romalde等人，Prevention of streptococcosisin turbot by intraperitoneal vaccinationA review，J ApplIchthyol 1999；15153-158；Long-lasting protection againstturbot streptococcosis obtained with a toxoid-enrichedbacterin，Bull Eur Ass Fish Pathol，1996；16(5)169-171；和Toranzo等人，Efficacy of intraperitoneal and immersionvaccination against Enterococcus sp.infection in turbot，Aquaculture 1995；13417-27]。富含類毒素的菌苗疫苗是兩種經(jīng)福爾馬林滅活的腸球菌分離株和其培養(yǎng)液的組合。用弗氏不完全佐劑中的福爾馬林滅活鏈球菌免疫的虹鱒魚獲得了抗鏈球菌的保護，而通過浴浸(bath immersion)免疫的大菱鲆則不受保護[Akhlaghi等人，Comparison of passive and active immunization of fish againststreptococcosis(enterococcosis)，J Fish Dis 1996；19251-258]。近來，Nakanishi等人(Development of a new vaccine deliverymethod for fishPercutaneous administration by immersion withapplication of a multiple puncture instrument，Vaccine 2002；203764-3769)證實，浸在福爾馬林滅活的海豚鏈球菌疫苗懸浮液中的皮膚穿孔幼虹鱒魚獲得的保護和通過IP(腹膜內(nèi))注射獲得的保護相當(dāng)。
Eldar等人公開了由福爾馬林滅活的難辨鏈球菌(Streptococcus difficile)制備的可注射疫苗制劑。據(jù)報導(dǎo)，該疫苗可保護羅非魚(紅色吳郭魚Oreochromis sp.)抵御難辨鏈球菌的攻擊[Eldar等人，Vaccination with whole-cell vaccine andbacterial protein extracts protects tilapia againstStreptococcus difficile meningoencephalitis，Vaccine 1995；13(9)867-870；和Bercovier等人，Immunization with BacterialAntigensinfections with Streptococci and Related Organisms；Fish Vaccinology，Dev.Biol.Stand.，第90卷(Liiehaug，G.，Midlyng，PJ & Brown，F(xiàn).eds.)Karger，Basel，Switzerland，pp.153-160，1997]。
然而在之后的報導(dǎo)中，Vandamme等人(Streptococcus difficileis a nonhemolytic group B，type Ib Streptococcus，Int J SystBacteriol，1997；47(1)81-85)提出，Eldar等人報導(dǎo)的難辨鏈球菌實際上是非溶血性的B組鏈球菌，無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)。許多報導(dǎo)的最初未確定種類的或錯誤鑒定的鏈球菌魚分離株更近以來確實已被表征為非溶血性的B組鏈球菌，無乳鏈球菌。
發(fā)明概述現(xiàn)在我們已經(jīng)發(fā)明這樣的新的疫苗，該疫苗對在魚類，特別是對無乳鏈球菌感染易感的羅非魚(尼羅羅非魚)和其他種類的魚中控制無乳鏈球菌是安全和有效的。所述疫苗包含無乳鏈球菌的一種或多種β溶血性分離株的完整(整個)滅活細胞和來自β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物的濃縮提取物。該疫苗組合物對于保護魚類抵御相同的或其他強毒株無乳鏈球菌(即和用于制備疫苗的無乳鏈球菌分離物不同)的感染是有效的。
根據(jù)本發(fā)明，提供抵御針對魚類的無乳鏈球菌的新型高保護性疫苗是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的另一個目的是提供對于在魚類群體中預(yù)防由無乳鏈球菌引發(fā)的家畜流行病(epizootics)有效的疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供可通過注射或浸浴給藥的抵御無乳鏈球菌的有效疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供功效增加的抵御無乳鏈球菌分離物的單價或多價疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供新的來自魚類的β溶血性無乳鏈球菌分離株，該分離株可用于制備在魚類中抵御無乳鏈球菌感染的疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提高羅非魚、條紋石瓰(Striped Bass)和其他魚類的存活力和生產(chǎn)力，以及減少由無乳鏈球菌導(dǎo)致的經(jīng)濟損失。
根據(jù)隨后的描述，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢將變得更加清楚。
附圖簡述


圖1顯示羅非魚的平均累積死亡率百分比，所述羅非魚是通過腹膜內(nèi)(IP)注射施用海豚鏈球菌疫苗和用2.6×104CFU無乳鏈球菌/魚(_接種者；_非接種者)進行IP攻擊的羅非魚。
圖2顯示通過腹膜內(nèi)(IP)注射施用無乳鏈球菌疫苗(試驗3和4)和用無乳鏈球菌T進行IP攻擊的羅非魚的平均累積死亡率百分比；試驗3的攻擊劑量為2.6×103CFU/魚(Δ接種者；非接種者)；試驗4攻擊劑量為1.5×104CFU/魚(_接種者；_非接種者)。
圖3顯示通過浸浴施用無乳鏈球菌疫苗(試驗5和6)和用無乳鏈球菌進行IP攻擊的羅非魚的日死亡率。試驗5的攻擊劑量為3.6×105CFU/魚(T＝非接種者；B＝接種者)；試驗6的攻擊劑量為1.7×106CFU/魚(C＝接種者；D＝非接種者)。壽命試驗法(Lifetest procedure)(SASInstitute，Cary，NC)。
圖4顯示在攻擊后不同時間點，受攻擊的羅非魚中平均葡萄糖值(mg/dL)(線)和累積死亡率百分比(柱狀圖)之間的關(guān)系。10條經(jīng)接種的(條紋柱)羅非魚和對照(涂黑柱)羅非魚的累積死亡率百分比和經(jīng)接種的(條紋柱)羅非魚和對照(涂黑柱)羅非魚中的平均血糖水平，所述羅非魚用1.5×104CFU無乳鏈球菌通過IP注射攻擊。
生物材料的保藏按照布達佩斯條約的條款，將β溶血性、有莢膜的無乳鏈球菌腦分離株(ARS-KU-3 B和ARS-KU-11 B)于2002年7月17日保藏于位于1815 North University Street，Peoria，IL 61604的美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心，保藏號分別為NRRL B-30608和NRRL B-30607。
如此處所用的，無乳鏈球菌是指經(jīng)過驗證的種類，其特征已由Evans等人(Characterization of β-haemolytic Group BStreptococcus agalactie in cultured seabream，Sparus auratusL.，and wild mullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait，Journalof Fish Diseases 2002；25505-513，the contents of which areincorporated by reference herein)描述，其他參考菌株已被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Virginia，USA。
發(fā)明詳述如此處所用的，“疫苗”在廣義上定義為以能夠在用所述疫苗接種的動物中激起保護性免疫應(yīng)答的可施用形式存在的任何類型的生物學(xué)試劑。
本發(fā)明提供了這樣的新的疫苗，即該疫苗包含了一種或多種以完整(整個)的細胞形式存在的無乳鏈球菌滅活β溶血性分離株，和來自相同的或不同的β溶血性無乳鏈球菌分離株的培養(yǎng)物的濃縮提取物。所述疫苗對控制由任何無乳鏈球菌菌株引起的魚類感染是有效的，所述菌株包括與用于制備所述疫苗的菌株不同的菌株。此外，所述疫苗對控制由β溶血性和非溶血性菌株以及有莢膜的或無莢膜的菌株引起的感染是有效的。然而，所述疫苗對于在魚中誘發(fā)針對由β溶血性無乳鏈球菌菌株引起的感染的保護性反應(yīng)特別有效。
本發(fā)明的疫苗在施用于多種魚中時可有效控制無乳鏈球菌的感染。接種疫苗也在接受治療的魚中顯著地降低了異常的行為和形態(tài)學(xué)。不局限于此，所述疫苗對治療家養(yǎng)的或外來魚類特別有益，所述魚類包括黃金銀色小魚(golden shiners)、bullminnows、藍魚(bluefish)、海灣油鯡(gulf menhaden)、海鯰(sea catfish)、鯡鯉(mullet)、菱體兔齒鯛(pinfish)、細須石首魚(Atlantic croaker)、spot、weakfish、斑點叉尾鮰(channel catfish)、虹鱒魚、鰻魚(eels)、雌性親紋鱸(striped bass)和其雜交品種、海鱸(sea bass)、真鯛(sea bream)、大菱鲆和羅非魚。
用于制備疫苗的β溶血性無乳鏈球菌的具體菌株不是最重要的，任何β溶血性、有莢膜或無莢膜的無乳鏈球菌分離株都適合在此處使用。可通過使用常規(guī)技術(shù)和類似于Evans等人(Characterization ofβ-haemolytic Group B Streptococcus agalactie in culturedseabream，Sparus auratus L.，and wild mullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait，Journal of Fish Diseases 2002；25505-513，the contents of which are incorporated by reference herein)描述的富集技術(shù)從環(huán)境或天然的來源例如受感染的魚中或從以前分離的基本上純的菌株中分離合適的無乳鏈球菌。優(yōu)選的菌株包括有莢膜的菌株，特別是上述菌株NRRL B-30608和NRRL B-30607。盡管單價和多價疫苗都顯現(xiàn)功效，但由于在種類中可能存在的抗原異質(zhì)性，使用超過一種β溶血性無乳鏈球菌菌株制備的多價系統(tǒng)是優(yōu)選的。
本發(fā)明的疫苗是滅活的細胞制劑或細菌疫苗，其也包括無乳鏈球菌培養(yǎng)物的細胞外濾出液(不含細胞的培養(yǎng)液)的濃縮級分。這樣，所述濃縮的級分基本上不含有無乳鏈球菌的細胞、細胞壁片段和細胞內(nèi)組分。盡管從濃縮級分中除去了細胞，但熟練的操作者認識到，由于在培養(yǎng)過程中發(fā)生的正常細胞裂解的原因，可存在相對少量的細胞內(nèi)產(chǎn)物和細胞壁片段。在特別優(yōu)選的實施方案中，由濃縮級分中除去低分子量細胞外組分(以及任何低分子量的細胞內(nèi)組分)，優(yōu)選地除去分子量低于大約1kDa、更優(yōu)選地分子量低于大約2kDa、和最優(yōu)選地分子量低于大約3kDa的組分。不限于理論，據(jù)認為滅活無乳鏈球菌的各種細胞外產(chǎn)物的低分子量組分對菌苗懸浮液的抗原性具有抑制作用。細胞外保留物的濃縮和過濾基本上除去了這些抑制性組分，從而增加了疫苗的功效。此外，據(jù)認為細胞外產(chǎn)物包括來自莢膜的抗原或分泌/外排的抗原以及提供較高的免疫應(yīng)答的其他有益分子。
可通過在任何常規(guī)的條件下和在促進其生長的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來繁殖用于制備疫苗的細菌。盡管各種常規(guī)的固體和液體培養(yǎng)基可以適合在此使用，但在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)對于大規(guī)模生產(chǎn)是特別優(yōu)選的。不受限于此，常規(guī)的胰酶大豆肉湯是優(yōu)選的，盡管可加入額外的營養(yǎng)物以增加莢膜(多糖)的產(chǎn)量。例如，糖例如葡萄糖的加入可增加多糖的產(chǎn)量?？赏ㄟ^選擇的分離株的穩(wěn)定培養(yǎng)來進行所述疫苗的生產(chǎn)，而無需在25℃下在5至7天的發(fā)酵期間調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。據(jù)認為，通過5至7天的長發(fā)酵時間，饑餓無乳鏈球菌細胞也增強所得疫苗的功效，因此該方法也是優(yōu)選的。在該培養(yǎng)基中制備的疫苗的終pH值可在pH6.5至7.4的范圍內(nèi)變動。所述疫苗制劑的鹽度優(yōu)選地在千分之(ppt)3.6至4.0的鹽(YSI Incorporated，Yellow Springs，OH)的范圍內(nèi)，并且據(jù)認為該性質(zhì)也可增加疫苗的功效，特別是當(dāng)通過浸浴免疫方法施用時。不受限于其，通過臨床用折射計(Atago A300CL，Vee Gee Scientific，Inc.，Kirkland，WA)測量的疫苗(如實施例2中所描述的那樣產(chǎn)生的)在血清蛋白(g/100ml)標(biāo)度上是1.3384至1.3387；在尿液比重(UG)標(biāo)度上是1.015至1.016；在589納米(nm)下的折射率(nD)是1.0至1.2。所述疫苗在540nm(UV-VisibleSpectrophotometers，Spectronic Unicam，Cambridge，UK)的光密度(OD)在0.887至0.939的范圍內(nèi)變化。通風(fēng)一般不是優(yōu)選的。所有基于植物的發(fā)酵培養(yǎng)基也優(yōu)選用于本文中，因為它們的使用消除了在最終的疫苗產(chǎn)品中存在動物產(chǎn)物和感染性因子的風(fēng)險。
在其繁殖和回收后，使無乳鏈球菌的細胞接受對滅活(即，使失活)該細胞有效的化學(xué)和/或物理處理。用于滅活該細胞的有效的處理在此處定義為這樣的處理，即該處理滅活了99.9％或更多的存活細胞而不裂解所述細胞，但同時保持所述細胞在動物中引發(fā)抗體反應(yīng)的能力。因此，相對于未處理的細胞，所述處理不應(yīng)當(dāng)顯著地改變滅活細胞上的細胞表面抗原的特異性。盡管滅活100％的所有存活細胞的處理一般可以是優(yōu)選的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到100％的細胞死亡不可能總是容易獲得的。在優(yōu)選的實施方案中，通過用福爾馬林處理存活細胞來制備滅活的、完整的無乳鏈球菌。可選擇地，可通過UV照射來滅活細胞，例如Purdy等人(美國專利號6,303,130)描述的用于制備溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)菌苗的方法。也可以預(yù)見，針對滅活細胞疫苗(即，菌苗)的制備描述的多種其他技術(shù)也適合在此使用，其包括但不限于用醇，特別是脂肪醇例如乙醇或異丙醇、苯酚、三甲酚(tricresol)、福爾馬林、甲醛、丙酮、硫柳汞(Merthiolate)、β內(nèi)酯處理和在不會誘導(dǎo)蛋白變性的溫度下的適度加熱(例如，56℃下1小時)。當(dāng)然，處理時間和條件可隨選擇的特定方法而發(fā)生變化，并且可通過常規(guī)的檢測容易地確定。
在優(yōu)選的實施方案中，將在其發(fā)酵容器中的無乳鏈球菌細胞暴露至福爾馬林中進行充足的時間以滅活100％的細胞。一般地，福爾馬林濃度可在大約1％至大約5％(v/v)、優(yōu)選地在大約1％至大約3％(v/v)的范圍內(nèi)變化。
可根據(jù)滅活率百分比對處理的時間的致死性滅活曲線容易地確定獲得100％滅活所需的特定福爾馬林濃度的合適暴露時間。
發(fā)酵后，通過例如過濾或離心濃縮細胞以獲得高密度的細胞懸浮液，將細胞沉淀和發(fā)酵培養(yǎng)液分開。可保留被分開的細胞以用作疫苗的第一組分。然后，以無細胞培養(yǎng)液的形式存在的濾出液自身接受另一個濃縮步驟以產(chǎn)生濃縮的提取物，并且優(yōu)選地除去上述的小分子量細胞外組分。許多具有不同分子量截留值的過濾系統(tǒng)適合用于該優(yōu)選的實施方案。優(yōu)選的過濾器包括具有大約1kDa的分子量截留值(從而產(chǎn)生包含來自培養(yǎng)物的分子量大于大約1kDa的細胞外產(chǎn)物的濃縮提取物)的過濾器。使用具有大約2kDa分子量截留值的過濾器是更優(yōu)選的，對于具有大約3kDa的截留值的過濾器是特別優(yōu)選的，其產(chǎn)生包含來自培養(yǎng)物的分子量分別大于大約2kDa和3kDa的細胞外產(chǎn)物的濃縮提取物。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過使用利用Millipore ProfluxM12(Billerica，MA)的3kDa Amicon柱(S3Y3)濃縮無細胞培養(yǎng)液。在任何過濾系統(tǒng)中，可通過加入水重懸浮保留物來將分離進行到底。在特別優(yōu)選的實施方案中，可進行分離直至保留物體積縮小5倍。這使得在保留物中保留足夠的水以使在和保留物(即，濃縮的提取物)重組后容易地懸浮前面保留的細胞沉淀。為方便起見，一般可從相同的培養(yǎng)物中制備滅活的細胞和濃縮的提取物。然而，要認識到它們可由相同的或不同的無乳鏈球菌菌株的不同培養(yǎng)物來制備。
合適的比例可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定，但可見所述比例一般在大約5∶1(體積/體積)至大約20∶1(體積/體積)的范圍內(nèi)變化，優(yōu)選地大約10∶1(體積/體積)的原始發(fā)酵無細胞培養(yǎng)液[即，無細胞培養(yǎng)液的原始體積對濃縮培養(yǎng)液(保留物)的體積的比例]。使用0.22Fm 11微生物學(xué)過濾器(Corning，Corning，NY)對所述濃縮無細胞培養(yǎng)液進行除菌。向1000ml的無菌濃縮無細胞發(fā)酵液中加入16ml福爾馬林滅活細胞。
在重新懸浮保留物中的細胞沉淀后，通過以對魚免疫有效的量或劑量進行配制來制備用于施用的滅活無乳鏈球菌細胞。可僅以包含重懸浮的滅活細胞的保留物提供藥劑，或所述藥劑還包含本領(lǐng)域已知的藥物可接受載體和佐劑。免疫有效的量或劑量在此處定義為這樣的量，即該量可在經(jīng)處理的魚中誘導(dǎo)完全的或部分的免疫力(引發(fā)保護性免疫應(yīng)答)，所述免疫力可抵御隨后用無乳鏈球菌的強毒株進行的攻擊。當(dāng)經(jīng)處理的動物群體的保護性水平(通過受感染魚的數(shù)目的減少或感染嚴(yán)重性的降低來顯示的)顯著地高于未接種的對照組的保護性水平(在至少80％的置信水平上測量的，優(yōu)選地在95％的置信水平上測量的)時，就認為在經(jīng)處理的動物群體中已誘導(dǎo)了免疫力。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)的實驗容易地確定合適的有效劑量。一般地，疫苗可包含至少1×108個無乳鏈球菌細胞/ml浸浴培養(yǎng)基，優(yōu)選地包含大約4×109個無乳鏈球菌細胞/ml浸浴培養(yǎng)基。依賴于魚的大小，對于IP注射途徑，魚中優(yōu)選的劑量是大約0.1-0.2ml的上述量。盡管可施用更大量的細胞，但使用這樣的更高水平一般被認為是不切實際的。
通過在藥物可接受的載體中進行配制來制備用于施用的滅活細胞，所述媒介物是水、生理鹽水、礦質(zhì)油、植物油、水性羧甲基纖維素鈉或水性聚乙烯吡咯烷酮。所述疫苗制劑也可包含任選的佐劑、抗菌藥或其他藥物活性劑，如本領(lǐng)域常規(guī)的藥物活性劑。不受限于其，合適的佐劑包括但不限于礦質(zhì)油、植物油、明礬和弗氏不完全佐劑。其他優(yōu)選的佐劑包括生物相容性基質(zhì)材料微?；蛐≈椤Ｋ鑫⒘？捎扇魏紊锵嗳菪曰|(zhì)材料如本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的生物相容性基質(zhì)材料構(gòu)成，包括但不限于瓊脂和聚丙烯酸(酯)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到也可使用其他載體或佐劑。例如，Webb和Winkelstein[in Basic &Clinical Immunology，Stites等人(ed.)，第5版，Lange MedicalPublications，Los Altos，CA，1984，pages 282-285]描述了可使用的其他佐劑，其內(nèi)容在此引用作為參考。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，可將滅活的細胞摻入微?；蛭⒛抑幸匝娱L抗原物質(zhì)向受試動物的暴露，從而增加保護性免疫力的持續(xù)時間?？赏ㄟ^使用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)將各種熟知的惰性、生物相容性基質(zhì)材料形成微粒和膠囊。不受限于此，合適的基質(zhì)材料包括天然的或合成的聚合物，例如藻酸(鹽)、聚(乳酸)、聚(乳酸/羥基乙酸)、聚(己內(nèi)酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酸酐、聚原酸酯(polyortho esters)、聚縮醛(polyacetals)、聚腈基丙烯酸酯(polycyanoacrylates)、聚氨基甲酸酯(polyurethanes)、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烴、聚氧乙烯、特別是瓊脂和聚丙烯酸(酯)。Sparks[Microencapsulation，InKirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，third edition，JohnWiley & Sons，New York，(1981)，第15卷，pages 470-493]，Kydonius[controlled Release TechnologiesMethods，Theories，and Applications，CRC Press，Cleveland，OH，1980]，Gombotz等人[美國專利號5,019,400]或Beck[美國專利號4,919,929]描述了可用于在此處使用的用于將材料摻入微?；蚰z囊化的技術(shù)的示例，各參考資料的內(nèi)容在此引用作為參考。
可通過任何便利的、可使細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的途徑(例如通過腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射、浸浴、經(jīng)口施用或經(jīng)鼻施用)將本發(fā)明的疫苗施用給受試動物。然而，腹膜內(nèi)注射或浸浴優(yōu)選地用于初次免疫(primaryimmunization)，而必要時，經(jīng)口免疫優(yōu)選地用于二次或加強免疫。也可預(yù)見的是，可在浸浴前或浸浴期間刺破魚的表面，例如如Nakanishi等人(2002，同上)所描述的，或刮擦，或稍微去鱗片，以幫助疫苗暴露至動物的免疫系統(tǒng)?？梢詥蝿┗蚨鄤┦┯靡呙?。依賴于飼養(yǎng)條件，可以多劑施用疫苗，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定施用的時間安排。
通過浸浴免疫進行的抗無乳鏈球菌感染的接種提供了優(yōu)于其他免疫途徑的幾個有利方面。這些有利方面包括每條被免疫魚的成本更低、大量魚的集體免疫(mass immunization)、減少的壓力(reducedstress)、魚存活率顯著更高和沒有對接種的不利反應(yīng)。此外，浸浴接種對于不能注射或不能接受皮膚刺孔的更小魚的集體接種是種有效的方法?？蛇x擇地，商購可獲得的魚類疫苗的腹膜內(nèi)注射由于其可靠性和高效性而普通用于淡水或海水養(yǎng)殖農(nóng)場，盡管每條被免疫的魚的成本較高和對魚的壓力較大。
下列實施例僅僅旨在進一步說明本發(fā)明，并不想限制由權(quán)利要求界定的本發(fā)明的范圍。
實施例1評估以前由Klesius等人發(fā)展的海豚鏈球菌疫苗抗無乳鏈球菌的功效。所述疫苗是非保護性的。
材料和方法羅非魚來自保持在ARS、USDA、水生動物健康研究實驗室(AquaticAnimal Health Research Laboratory)(Auburn，AL)的原種。在實驗前使具有5g和30g平均重量的羅非魚適應(yīng)57升的流通玻璃缸(補充以0.5升/小時去氯水)的環(huán)境10天。保持12小時12小時的光照和暗周期并通過礦砂氣泡石(air stone)提供通氣。每天用AQUAMAXGROWER 400(Brentwood，MO)將魚喂至飽足。每天使用YSI 85 oxygenconductivity、鹽度和溫度測量儀(Yellow Spring Instrument Co.，Yellow Springs，OH)測量溶氧度、溫度和鹽度，監(jiān)控水的質(zhì)量。每天的水溫平均為26.3±0.03℃，每天的平均溶氧是5.95±0.06mg/l。為確證魚不含無乳鏈球菌的狀態(tài)，通過將接種環(huán)穿入腦和腎獲取樣品以進行培養(yǎng)。將樣品直接在綿羊血瓊脂上劃線培養(yǎng)，于27℃下溫育24至48小時。從5條隨機選擇的魚中未分離出無乳鏈球菌。
疫苗制備以前描述了海豚鏈球菌疫苗的制備(Klesius等人，Efficacy ofa killed Streptococcus iniae vaccine in tilapia(Oreochromisniloticus)，Bull Eur Ass Fish Pathol，1999；19(1)38-41.1999)。簡而言之，通過在胰酶大豆肉湯(TSB)中分別培養(yǎng)海豚鏈球菌分離株(NRRL B-30264和NRRL B-30238)并在27℃下在搖床(70RPM)水浴中溫育72小時來制備疫苗。在27℃下用10％中性緩沖福爾馬林處理培養(yǎng)物24小時，獲得3％的終濃度。在7000xg下將經(jīng)福爾馬林處理的培養(yǎng)物離心30分鐘，將細胞沉淀和培養(yǎng)液分離。使用2kDa中空纖維濃縮儀將無細胞培養(yǎng)液濃縮20倍，以除去所有更低分子量的組分。然后將該2kDa培養(yǎng)液濃縮物以10∶1的V/V用于重懸所述細胞沉淀。疫苗的終濃度為4×109CFU/ml。通過在被福爾馬林滅活前獲得疫苗的光密度來估計細菌濃度。使用螺旋全自動微生物接種儀和Qcount(SpiralBiotech，Norwood，MA)確定CFU/ml的實際數(shù)目。非接種者只接受濃縮的胰酶大豆肉湯(TSB)。根據(jù)在72小時綿羊血瓊脂上缺少生長來確定疫苗細胞被滅活。
接種方案為確定海豚鏈球菌疫苗是否具有抗無乳鏈球菌的保護性(試驗1)，將200條平均重量為30g的羅非魚分入10個水箱，每個水箱20條魚，包括非免疫的對照(表1)。羅非魚的5個重復(fù)水箱用作對照。以0.1ml的體積將海豚鏈球菌NRRL B-30264疫苗或組合的NRRLB-30264/NRRL B-30238疫苗經(jīng)腹膜內(nèi)注射入羅非魚。對照羅非魚接受0.1ml的TSB。在攻擊前將經(jīng)免疫的羅非魚和對照羅非魚保持30天。攻擊后就死亡率對羅非魚進行監(jiān)控14天。
進行實驗性無乳鏈球菌攻擊和細菌學(xué)樣品收集和評估。使用無乳鏈球菌分離株NRRL B-30607(最先由患有天然鏈球菌疾病的野生單鰭魚科鯔魚(Klunzingeri mullet)，多耙鮻Liza Klunzingeri(Day)分離的)感染魚。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法，所述分離株被鑒定為無乳鏈球菌。將從鯔魚(mullet)(多耙鮻Liza Klunzingeri)分離的無乳鏈球菌(被稱為ARS-KU-11B(美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心NRRL B-30607))在27℃下在胰酶大豆肉湯(TSB，Difco Laboratories，Sparks，MD)中培養(yǎng)24小時，然后以0.2ml等分在-70℃下冷凍。通過用所述冷凍分離株的解凍等分接種TSB來制備用于本研究的感染性分離株。然后通過IP注射，用100μl 2.6×105CFU/ml的無乳鏈球菌攻擊魚。每天兩次取出死魚并進行尸體剖檢，在無菌條件下從腦、前腎和腸中獲取樣品。在27℃下將樣品直接在綿羊血瓊脂上培養(yǎng)24至48小時。將β溶血性、過氧化氫酶呈陰性和格蘭氏染色呈陽性的球菌菌落在綿羊血瓊脂上進行傳代培養(yǎng)，然后根據(jù)Evans等人(Characterization ofbeta-haemolytic Group B Streptococcus agalactie in culturedseabream，Sparus auratus(L.)and wild mullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait，J Fish Dis，2002；25505-513)(在此引用作為參考)描述的檢測法進行細菌學(xué)和生物化學(xué)鑒定，其被鑒定為無乳鏈球菌。使用購自Remel(Lenexa，KS)的培養(yǎng)基在27℃下進行所有的檢測。
在14天的時期內(nèi)確定各試驗中接種的和未接種的羅非魚的平均死亡率百分比和平均累積死亡率百分比。根據(jù)Amend(1981)，將疫苗的功效計算為相對存活率百分比(relative percent survival，RPS)。
統(tǒng)計分析通過使用Gomez和Gomez描述的區(qū)組設(shè)計(block design)，對處理水箱進行隨機化。檢查所有數(shù)據(jù)以確保不違反常態(tài)性統(tǒng)計學(xué)假設(shè)。使用Statistical Analytical Systems(SAS)(SAS Institute，Cary，NC，1997)進行所有統(tǒng)計分析。使用廣義線性模型(General LinearModel，GLM)方法檢測處理組之間(接種的和對照)和這些處理組的重復(fù)(水箱)(其中使用同樣的水箱)之間的累積死亡率上的顯著差異(p＜0.05)。在P＜0.05-標(biāo)準(zhǔn)誤差下確定顯著差異。
結(jié)果海豚鏈球菌疫苗制劑不能保護羅非魚抵御無乳鏈球菌的感染。在無乳鏈球菌攻擊后，接種海豚鏈球菌的羅非魚和未接種的羅非魚的平均死亡率百分比示于表1。用海豚鏈球菌經(jīng)IP免疫的并用無乳鏈球菌NRRL B-30607分離株攻擊的羅非魚的RPS為0，而100％的接種海豚鏈球菌的羅非魚被無乳鏈球菌感染。接種者和未接種者之間的死亡率沒有表現(xiàn)出顯著差異。接種者的死亡率比未接種者的死亡率更早發(fā)生和更高(
圖1)。在經(jīng)海豚鏈球菌接種的羅非魚和未接種者中死亡分別在第1天和第2天開始。在第4天，海豚鏈球菌接種者中的累積死亡率百分比達到100％，相比之下，非接種者在第11天達到100％的死亡率。
表1用無乳鏈球菌1經(jīng)IP攻擊的經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)接種海豚鏈球菌的羅非魚和非接種的羅非魚(尼羅羅非魚)的平均死亡率百分比和相對存活率百分比(RPS)。
1未接種者僅接受胰酶大豆肉湯(TSB)。
實施例2評估本發(fā)明的無乳鏈球菌疫苗抗無乳鏈球菌的功效。和實施例1的海豚鏈球菌疫苗相反，無乳鏈球菌疫苗具有保護性。
材料和方法羅非魚羅非魚來自保持在ARS、USDA、水生動物健康研究實驗室(AquaticAnimal Health Research Laboratory)(Auburn，AL)的原種。在實驗前使具有5g和30g平均重量的羅非魚適應(yīng)57升流通玻璃缸(補充以0.5升/小時去氯水)的環(huán)境10天。保持12小時12小時的光照和暗周期并通過礦砂氣泡石提供通氣。每天用AQUAMAX GROWER 400(Brentwood，MO)將魚喂至飽足。每天使用YSI 85 oxygenconductivity、鹽度和溫度測量儀(Yellow Spring Instrument Co.，Yellow Springs，OH)測量溶氧、溫度和鹽度，監(jiān)控水的質(zhì)量。在所有試驗中，每天水的溫度平均為31.68±0.08℃或26.3±0.03℃，每天的平均溶氧是5.95±0.06mg/l。為證實魚不含有無乳鏈球菌的狀態(tài)，通過將接種環(huán)穿入腦和腎獲取樣品以進行細菌培養(yǎng)。將樣品直接在綿羊血瓊脂上劃線培養(yǎng)，于27℃下溫育24至48小時。從5條隨機選擇的魚中未分離出無乳鏈球菌。
疫苗制備通過在胰酶大豆肉湯(TSB)中分開培養(yǎng)無乳鏈球菌分離株(NRRLB-30608和NRRL B-30607)并在27℃下在搖床(70RPM)水浴中溫育72至125小時來制備疫苗。用3％終濃度的中性緩沖福爾馬林處理培養(yǎng)物24小時。在7000xg下將福爾馬林處理的培養(yǎng)物離心30分鐘，將細胞沉淀和培養(yǎng)液分離。在3kDa Amicon柱(S3Y3)上使用MilliporeProflux M12(Billerica，MA)將無細胞培養(yǎng)液濃縮5倍。然后使用0.22Fm 1升的微生物過濾器(Corning，Corning，NY)對濃縮的無細胞培養(yǎng)液進行除菌。將16ml經(jīng)福爾馬林滅活的細胞加入至1升無菌的濃縮無細胞培養(yǎng)液中。該疫苗在540nm具有1.9的光密度。在最終的疫苗制劑中，每毫升無乳鏈球菌的菌落形成單位(CFU)數(shù)估計為4×109。通過在由福爾馬林滅活前獲得疫苗的光密度來估計細菌濃度。使用螺旋全自動微生物接種儀和Qcount(Spiral Biotech，Norwood，MA)確定CFU/ml的實際數(shù)目。非接種者只接受濃縮的胰酶大豆肉湯(TSB)。通過在72小時時綿羊血瓊脂上缺少生長來確定疫苗細胞被滅活。
接種方案腹膜內(nèi)施用進行三個IP無乳鏈球菌疫苗試驗(試驗2-4)。關(guān)于試驗2，將40條5g的羅非魚分成2組，每組20條魚。關(guān)于試驗3，將200條30g的羅非魚分入10個水箱中，每個水箱20條魚。5個重復(fù)的羅非魚水箱用作對照。關(guān)于試驗4，將160條30g的羅非魚分成6組(非免疫對照和接種者的3個重復(fù)水箱)，每組26-27條魚。在32℃下進行試驗2和4，在26℃下進行試驗3。對于所有試驗，以0.1ml的體積將疫苗經(jīng)IP注射入羅非魚。以相同的體積用無菌TSB經(jīng)IP注射對照羅非魚。
浸浴施用在32℃下進行兩個無乳鏈球菌疫苗浸沒試驗(試驗5-6)，將130條5g的羅非魚分成兩組，一組65條魚(對照)和一組65條魚(經(jīng)免疫的)。將對照羅非魚浸沒在1升的500ml無菌水500ml TSB中20分鐘，浸沒后，將20-25條魚置于3個重復(fù)玻璃缸中。將經(jīng)免疫的魚浸入含有16ml菌苗和1000ml類毒素的未稀釋疫苗中20分鐘，通入空氣，浸浴后，將2-25條魚置于三個重復(fù)的魚缸中。5g的羅非魚不能很好耐受直接的疫苗，在接種后30條魚死亡，這使得有必要對疫苗稀釋。將另外30條魚浸入稀釋的疫苗(500ml疫苗∶500ml無菌水)中并分配到重復(fù)水箱中以替換在直接疫苗浸浴期間損失的魚。接種后30天，沒有明顯的進一步死亡。關(guān)于試驗6，將45條30g的羅非魚分成4組，每組11-12條魚。將2組(每組6條魚)在500ml未稀釋的疫苗中免疫(第一浸浴)，而將另外兩組(每組6條魚)在通有空氣的相同疫苗溶液中免疫(第二浸浴)。將第一浸浴和第二浸浴免疫的魚放入分開的玻璃缸中。使用相同的方法將對照魚浸入TSB中。
實驗性攻擊和細菌學(xué)樣品評估在接種后30-64天，將接種者組和非接種者組稱重，并用0.1ml同源(ARS-KU-MU-11B)或異源(ARS-KU-MU-3B)無乳鏈球菌分離物以2.6×103至1.7×106CFU/魚(表2)的細胞濃度范圍進行IP攻擊，14天中每天監(jiān)控臨床體癥和死亡率。觀察受感染的羅非魚中無規(guī)律游動的行為和病理體征。每天兩次取出死魚并在無菌條件下從20％的病態(tài)魚和死魚的腦、前腎和腸中獲得細菌樣品，以確認無乳鏈球菌的存在。將樣品培養(yǎng)在綿羊血瓊脂(Remel，Lenexa，KS)上。通過使用RAPID ID32 STREP TEST(bioMerieux Vitek，Hazelwood，MO)，β溶血性、氧化酶呈陰性和革蘭氏染色呈陽性的球菌菌落被鑒定為無乳鏈球菌。在14天內(nèi)確定各試驗的接種和非接種羅非魚的平均死亡率百分比和平均累積死亡率百分比。疫苗的功效計算為相對存活率百分比(RPS)(Amend，1981)。
統(tǒng)計根據(jù)SAS Institute，Cary，NC(1997)的方法，通過T檢驗和壽命試驗法對攻擊后各試驗的被免疫者和非免疫對照之間死亡率方面的顯著差異進行統(tǒng)計分析。在P＜0.05時確定了顯著差異。(參見前面)。
結(jié)果疫苗功效在無乳鏈球菌攻擊后，接種無乳鏈球菌的羅非魚和非接種的羅非魚的平均死亡率百分比和RPS示于表2中。與海豚鏈球菌IP接種并用無乳鏈球菌攻擊相反，在試驗3和4中，用無乳鏈球菌疫苗進行IP接種并分別在接種后64天和30天用2.6×103和1.5×104CFU/魚進行IP攻擊的30g羅非魚分別具有70和80的優(yōu)良RPS值。試驗3和4之間的水溫(26和32℃)似乎對RPS結(jié)果沒有影響。圖2顯示在用無乳鏈球菌攻擊后，接種無乳鏈球菌的魚和非接種的魚的日平均累積死亡率百分比。無乳鏈球菌接種者中的平均累積死亡率百分比從第3天至第14天保持在15-16％。在試驗3和4中觀察到被免疫者和非免疫對照之間的死亡率上的高顯著差異。試驗3(P＝0.9117)和4(P＝0.9510)中各處理的重復(fù)實驗之間沒有表現(xiàn)出顯著差異。用無乳鏈球菌攻擊的、較少IP無乳鏈球菌接種的和非接種的5g羅非魚的RPS為25(試驗2，表2)。
浸浴接種5g(試驗5)和30g(試驗6)的羅非魚后，分別以3.6×105和1.7×106CFU/魚進行無乳鏈球菌攻擊，產(chǎn)生相似的RPS，為34(表2)。在試驗5中觀察到被免疫者和非免疫對照之間的死亡率有顯著差異。試驗5中各處理的重復(fù)實驗之間沒有表現(xiàn)出顯著差異(P＝0.9798)，其與疫苗(未稀釋的和稀釋的)處理無關(guān)。相反地，在試驗6中沒有觀察到被免疫者和非免疫對照之間在死亡率上的顯著差異。試驗6中在各處理的重復(fù)實驗(第一和第二浸浴)之間的死亡率上沒有顯著差異(P＝0.7327)。5g和30g的接種者具有比5g和30g非接種者更低的日累積死亡率百分比。盡管30g的魚受到比5g的魚高出10倍的劑量的攻擊，但5g和30g的非接種者具有非常相似的日累積死亡率。非接種者的平均死亡率百分比平均為85，接種者的平均死亡率百分比平均為55(表2)。在攻擊后一天，兩個試驗的非接種對照的死亡率都超過50％(圖3)。直至第5天接種者才達到50％的死亡率。
表2在用無乳鏈球菌IP攻擊后，IP接種無乳鏈球菌(試驗2-4)的羅非魚(羅尼羅非魚)和浸浴(BI)接種(試驗5-6)的羅非魚以及非接種的羅非魚(羅尼羅非魚)的平均死亡率百分比和相對存活率百分比(RPS)。
*異源攻擊*同源攻擊實施例3再次就預(yù)防由無乳鏈球菌強毒株產(chǎn)生的感染的功效對本發(fā)明的無乳鏈球菌疫苗進行檢查，也確定對血糖水平的影響。
材料和方法，疫苗制備和接種方案全都和前面實施例2中描述的一樣。
血液的取樣和分析在接種之前(0小時)，對10條魚進行取樣以測定血糖。在接種后2、6和24小時對魚進行重復(fù)取樣以測定血糖。接種后28小時，在攻擊之前(攻擊前0小時)確定10條接種者和10條對照的血糖。在攻擊后2、6、24、48、72小時和312小時對這些魚進行重復(fù)取樣以測定血糖。使用結(jié)核菌素注射器(tuberculin syringe)和27號針頭從尾靜脈獲取血液樣品。將5至10μl血滴置于干凈的載玻片上。通過將ONE TOUCH ULTRA METER(Lifescan，Miptas，CA)測試條的上部邊緣以15至30°的角度和玻璃表面上的血滴輕輕接觸并使血液完全充滿確認窗來確定血糖濃度(Diouf等人，2000)。在大約5秒內(nèi)以mg/dL顯示葡萄糖濃度。在前面的研究中，Evans等人(2003b)在可接受的DO水平上從10個來自健康羅非魚的血液樣品的重復(fù)中確定了20mg/dL的靈敏度和3.25％的內(nèi)部測定誤差(intra-assay variance)(平均值為20.4±0.66mg/dL)。此外，通過葡萄糖監(jiān)控儀測量的葡萄糖氧化酶反應(yīng)和比色商業(yè)化實驗方法相關(guān)。在P＜0.001時，相關(guān)系數(shù)(r)為0.928。
實驗性攻擊在接種后第28天，對接種者和非接種者稱重并用0.1mL無乳鏈球菌分離株以1.5×105CFU/mL的細胞濃度進行IP攻擊，每天監(jiān)控臨床體征和死亡率，進行13天。觀察受感染的羅非魚中無規(guī)律游動的行為和病理體征。每天兩次取出死魚并在無菌條件下從腦、前腎和腸中獲得細菌樣品，將其培養(yǎng)在SBA上以確認無乳鏈球菌的存在。通過使用RAPID ID 32 STREP TEST(bioMerieux Vitek，Hazelwood，MO)(Evans等人，2002)，β溶血性、氧化酶呈陰性和革蘭氏染色呈陽性的球菌菌落被鑒定為無乳鏈球菌。在13天的時期內(nèi)確定累積處理死亡率。將疫苗的功效計算為相對存活百分比(RPS)(Amend，1981)。
統(tǒng)計根據(jù)SAS Institute，Cary，NC(1997)的方法，通過ANOVA方法，然后再經(jīng)鄧肯多重范圍檢驗(Duncan′s Multiple Range test)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。在p＜0.001(對于ANOVA)和在p＜0.05(對于Duncans)的水平上，在一個時間段上各處理之間和單個處理在所有時間段之間有血糖水平的顯著差異。通過SAS的相關(guān)性方法進行血糖水平和死亡率之間的關(guān)聯(lián)。如上所述進行重量分析。記錄所有處理的平均血糖值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
結(jié)果在疫苗注射后2小時，接種者具有比對照魚(52.1±5.37mg/dL)顯著更高的血糖水平(97.9±9.90mg/dL)(數(shù)據(jù)未顯示)。在注射后6小時，接種者的血糖水平保持在提高的水平，但在24小時時返回至注射前水平之前沒有統(tǒng)計學(xué)上的提高。在接種前(0小時)或在接種后6小時和24小時，在接種者和對照之間的血糖水平上沒有觀察到顯著差異。用TSB進行IP注射的對照的血糖水平在任何時間間隔都沒有顯著差異。在接種后第28天，在對照或接種者中沒有出現(xiàn)死亡。在用1.5×104CFU的無乳鏈球菌通過IP注射進行攻擊和感染之后，接種者和對照都在2、24、48和72小時具有比攻擊前(0小時)顯著更高的血糖水平(圖4)。在24、48和312小時表現(xiàn)出對照和接種者之間顯著提高的血糖水平。
然而，在這些時間段，接種者的血糖水平比對照的要低。對照的葡萄糖值(117.0±14.09mg/dL)在第48小時達到峰值。接種者在312小時的血糖值(41.9±2.39mg/dL)和接種者在接種和攻擊前的0小時獲得的血糖值相同。
在攻擊后24小時，對照表現(xiàn)出受感染魚的典型行為異常。魚聚集在水箱的底部，對食物沒有反應(yīng)或反應(yīng)遲鈍，呈昏睡狀態(tài)。在對照中死亡發(fā)生得要比在接種者中早得多。在攻擊后72小時內(nèi)，在對照中表現(xiàn)出60％的死亡率(圖4)。在攻擊后96小時，只有一個接種者死亡，沒有一條魚顯現(xiàn)感染的體征異常行為。在312小時，相對存活率百分比是83.4。圖4顯示一段時間內(nèi)受攻擊的接種者和對照的平均葡萄糖值和累積死亡率百分比之間的關(guān)系。受感染的對照的血糖水平和死亡率是顯著相關(guān)(r2＝0.9236，P＝0.0134)。垂死的對照(N＝4)在腦、前腎和腸中顯示無乳鏈球菌培養(yǎng)陽性。
要理解前面詳細的描述僅僅是用來舉例說明的，可在此處產(chǎn)生修飾和變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其中包含免疫有效量的分離β溶血性無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的完整滅活細胞和β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物的濃縮提取物。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述β溶血性無乳鏈球菌是有莢膜的。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述β溶血性無乳鏈球菌包含具有保藏目錄號NRRL B-30607的所有鑒別特征的菌株，包含具有保藏目錄號NRRL B-30608的所有鑒別特征的菌株，或者它們的混合物。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述濃縮提取物基本上由β溶血性無乳鏈球菌的所述培養(yǎng)物的細胞外產(chǎn)物組成。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述濃縮提取物基本上不含有所述β溶血性無乳鏈球菌的細胞、細胞壁片段和細胞內(nèi)組分。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述濃縮提取物包含具有大于大約1kDa的分子量的所述β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物細胞外產(chǎn)物。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述細胞外產(chǎn)物具有大于大約2kDa的分子量。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述細胞外產(chǎn)物具有大于大約3kDa的分子量。
9.權(quán)利要求6的組合物，其中所述濃縮提取物基本上由所述β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物的細胞外產(chǎn)物組成。
10.無乳鏈球菌的生物純培養(yǎng)物，該無乳鏈球菌具有選自保藏目錄號NRRL B-30607和保藏目錄號NRRL B-30608中的菌株的所有鑒別特征。
11.保護魚抵御無乳鏈球菌的感染的方法，包括給其施用權(quán)利要求1的組合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述魚選自金體美洲鳊魚(goldenshiners)、bullminnows、藍魚(bluefish)、海灣鯡魚(gulf menhaden)、海鯰(sea catfish)、胭脂魚(mullet)、菱體兔齒鯛(pinfish)、細須石首魚(Atlantic croaker)、spot、weakfish、斑點叉尾鮰(channel catfish)、虹鱒魚、鰻魚(eels)、條紋石瓰(striped bass)和其雜交品種、海鱸(sea bass)、真鯛(sea bream)、大菱鲆和羅非魚。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述魚是羅非魚。
14.權(quán)利要求11的方法，其中通過腹膜內(nèi)注射或浸浴施用所述組合物。
15.保護魚抵御無乳鏈球菌感染的方法，包括給其施用權(quán)利要求3的組合物。
16.保護魚抵御無乳鏈球菌感染的方法，包括給其施用權(quán)利要求4的組合物。
17.保護魚抵御無乳鏈球菌感染的方法，包括給其施用權(quán)利要求6的組合物。
18.保護魚抵御無乳鏈球菌感染的方法，包括給其施用權(quán)利要求9的組合物。
19.生產(chǎn)用于保護魚抵御無乳鏈球菌感染的疫苗的方法，包括a)提供來自分離β溶血性無乳鏈球菌的培養(yǎng)物的滅活完整細胞制劑，b)提供來自β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物的細胞外產(chǎn)物的濃縮提取物，和c)將所述滅活完整細胞和所述濃縮提取物以免疫有效的量混合。
20.權(quán)利要求19的方法，其中通過將分離的β溶血性無乳鏈球菌培養(yǎng)物接受化學(xué)或物質(zhì)處理來產(chǎn)生所述滅活的完整細胞制劑，該處理可有效滅活其中將近100％的細胞，而無明顯程度的細胞裂解。
全文摘要
由分離的β溶血性無乳鏈球菌的完整的滅活細胞和β溶血性無乳鏈球菌的培養(yǎng)物的濃縮提取物制備的組合物對保護魚抵御相同的菌株和其他無乳鏈球菌強毒株的感染是有效的。
文檔編號A01N63/00GK101068566SQ200580013779
公開日2007年11月7日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月18日
發(fā)明者菲利普·H·克雷休斯, 克雷格·A·舒梅克, 喬伊斯·J·埃文斯 申請人:(由農(nóng)業(yè)部部長代表的)美利堅合眾國