專利名稱：抑制植物病害發(fā)生的微生物農(nóng)藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制植物病害發(fā)生的微生物農(nóng)藥，具體涉及含有昆蟲寄生絲狀菌蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)的微生物農(nóng)藥，和通過將該微生物農(nóng)藥散布于果實、蔬菜等植物或施于植物栽培土壤達到抑制植物致病菌生長和土壤改良的效果的微生物農(nóng)藥。
背景技術(shù)：
由于對蔬菜、果實、稻麥、果樹等植物的有害生物防治或者對于附在植物根莖的土壤有害生物使用化學物質(zhì)防治研究的進展，目前，依靠化學殺蟲劑、殺菌劑防治占主流。但是，使用化學物質(zhì)的農(nóng)藥具有優(yōu)異效果的另一面，可能存在一些，對人畜有毒性、殘留于自然環(huán)境而給其他生態(tài)系統(tǒng)帶來影響、更甚的是由于長期使用出現(xiàn)具有抵抗性的病蟲害、甚至殺滅大自然存在的天敵反而形成有害生物發(fā)生的環(huán)境等問題。在這樣的情況下，微生物農(nóng)藥被期待作為解決該問題的一個手段。
據(jù)報道，微生物農(nóng)藥中可利用的微生物是將植物原有抵抗性活化防治病害的非致病的鐮刀菌(例如，參照非特許文獻1、特許文獻1)、對病原菌具有抗生作用的木霉屬(例如，參照非特許文獻2)。另外，使用假單胞細菌屬細菌防治植物病害的方法是眾所周知的，例如，對于茄科植物青枯病(例如，參照特許文獻2、特許文獻3、特許文獻4)、稻屬苗立枯病(例如，參照特許文獻5)、葡萄孢菌屬和青霉屬植物病原菌引起的植物病害(例如，參照特許文獻6)、革蘭氏陽性細菌引起的植物病害(例如，參照特許文獻7)、鐮刀菌屬菌引起的植物病害(例如，參照特許文獻8)的防治方法。而且，眾所周知，以作為能通過假單胞細菌屬細菌防治的菌株對植物病原絲狀菌具有抗菌性的假單胞細菌屬·SPCGF7菌株(例如，參照特許文獻9)、假單胞細菌屬·SPCGF878菌株為有效成分的微生物農(nóng)藥(例如，參照特許文獻10)，用假單胞細菌屬熒光(Pseudomonas fluorescens熒光假單胞菌)細菌處理植物(例如，萵苣)病原菌為假單胞細菌·菊苣(Pseudomonas cichorii菊苣假單胞菌)的腐病防治方法(例如，參照特許文獻11)，包含在茄科植物上接種假單胞細菌屬產(chǎn)堿桿菌(Pseudomonasalcaligenes產(chǎn)堿假單胞菌)細菌的茄科植物栽培方法(例如，參照特許文獻12)。
另外，眾所周知，選自屬于對禾本科植物尤其育苗中發(fā)生的細菌性病原體有拮抗作用的細菌假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬的細菌作為拮抗菌的微生物農(nóng)藥(例如，參照特許文獻13)。而且，據(jù)報道，盾殼霉(Coniothyrium)屬菌和葚孢霉(Sporidesmium)屬菌對菌核病有效，青霉屬菌對黃萎病病具有防治效果(例如，參照非特許文獻3)。用木霉屬菌株的煙草菌核病防治，使用木霉屬菌株和粘帚霉(グリオクラデイウム)屬菌株對立枯病和斑點病的防治被報道(例如，參照非特許文獻4)。已經(jīng)登記的土壤放線菌劑(細菌劑)是由根瘤病菌的拮抗微生物土壤放線菌84株培養(yǎng)活菌組成的殺菌劑，施于菊花、薔薇的苗根部有藥效，另外，突變處理野生軟腐病菌的非致病的歐文氏茵劑(Botokiller)是有效防治白菜軟腐病的微生物農(nóng)藥。同樣登記的嗜酸枯草芽孢桿菌劑(Botokiller)對植物灰霉病菌有預防效果是公知的(例如，參照非特許文獻5)。
眾所周知，對于與土壤病害相關(guān)的蔬菜土壤病原菌，以前是先用氯化苦(溴化甲烷)等進行土壤消毒，然后將屬于木霉屬(トリコデルマ)屬的微生物收集于用具土壤崩解性的材料制造的容器作為土壤病害防治劑(例如，參照特許文獻14)，以及在栽培植物過程中，將屬于粘帚霉(グリオクラデイウム)屬的真菌和VA菌根菌施用于權(quán)利要求植物和/或栽培上壤中，通過屬于粘帚霉(グリオクラデイウム)屬的真菌固著于植物根際以及VA菌根菌與植物共生防治植物土壤病害的方法(例如，參照特許文獻15)。
其他方法，使用昆蟲致病的絲狀菌進行植物害蟲驅(qū)避的植物害蟲驅(qū)避劑(微生物農(nóng)藥)已經(jīng)登記并上市。其中之一利用蠟蚧輪枝菌的微生物農(nóng)藥，商品名為Vertalec(‘バ-タレツク’)和Mycotal(‘マイコタ-ル’)是可以購買的。絲狀菌蠟蚧輪枝菌最初是作為介殼蟲(カイガラムシ)寄生菌發(fā)現(xiàn)的，之后，可以從蚜蟲類、粉虱類、纓翅類等各種各樣的昆蟲、螨類分離。另外，寄生于異皮線蟲、根結(jié)線蟲、植物病原菌銹菌，白粉菌等具有拮抗作用是公知的(例如，參照非特許文獻6)?？梢云诖氖?，利用蠟蚧輪枝菌的微生物農(nóng)藥對于蚜蟲類(半翅目)、粉虱類(半翅目)、纓翅類(纓翅目)和葉螨類等有效，尤其是在對于各種各樣害蟲的抗藥性取得較大進展的設施園藝上的利用。
利用蠟蚧輪枝菌的微生物農(nóng)藥可以水合劑的形式制劑化，使用時溶于水散布。在制劑中含有蠟蚧輪枝菌的孢子，其散布后接觸害蟲，孢子發(fā)芽寄生于害蟲，之后菌絲在害蟲體內(nèi)生長，直至使充滿的害蟲死亡。由于以前的蠟蚧輪枝菌菌株在葉面等植物體表面的固著能力小，微生物藥劑未直接接觸害蟲體表而失去寄生能力，因此，當散布該微生物藥劑時有必要謹慎地將散布液直接散布于害蟲體表。同樣，由于直接散布于發(fā)生的害蟲的必要性，符合害蟲發(fā)生時機，更要符合害蟲發(fā)生場所，微生物藥劑散布幾次是需要的。因此，本發(fā)明者專心研究在葉面等植物體表面具有固著能力的絲狀菌蠟蚧輪枝菌菌株，結(jié)果成功分離了在植物葉面等上具有固著能力比自然界高且在對害蟲的致病能力上不亞于以前的蠟蚧輪枝菌的菌株。業(yè)就是說，提出了含有新分離的蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)、蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)、蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)那樣具有植物體表面固著能力的蠟蚧輪枝菌作為害蟲寄生菌的微生物農(nóng)藥(例如，參照特許文獻16)。
特許文獻1特公平7-096485號公報特許文獻2特開平6-9325號公報特許文獻3特開平6-86668號公報特許文獻4特公平6-17291號公報特許文獻5特開平4-104783號公報特許文獻6特開平4-77405號公報特許文獻7特開平5-310521號公報特許文獻8特公平6-6523號公報特許文獻9特開平09-255513號公報特許文獻10特開平11-187866號公報特許文獻11特開2001-247423號公報特許文獻12特開2002-233246號公報特許文獻1399/016859第二表特許文獻14特開平06-024925號公報特許文獻15特開平08-225419號公報特許文獻16特開2003-335612號公報非特許文獻1Baker(貝克)，Hanchey，Dottara植物病理學(Baker，Hanchey，Dottara；Phytopathology)1978年非特許文獻2農(nóng)林水產(chǎn)省登記第7023號非特許文獻3生物農(nóng)藥·生長調(diào)節(jié)劑開發(fā)利用手冊，LIC非特許文獻4Plant Pathology，38，227，1989非特許文獻5‘農(nóng)藥手冊2001年版’，p352-353，社團法人日本植物防疫協(xié)會平成13年11月1日第11版發(fā)行非特許文獻6‘今月農(nóng)業(yè)’2001，9月號，P72-77發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所解決的問題本發(fā)明的問題是提供，通過將含有對植物病原菌生長抑制有效的絲狀菌蠟蚧輪枝菌的微生物農(nóng)藥散布于果實、蔬菜等植物進行植物病害防治的微生物農(nóng)藥，以及用含有絲狀菌蠟蚧輪枝菌的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥代替以前的土壤消毒劑即化學藥劑氯化苦(溴化甲烷)等，從而提供適用于土壤達到土壤改良效果的土壤改良劑。
解決問題的手段如前所述，本發(fā)明者報道了通過事先將具有植物體表面固著能力的蠟蚧輪枝菌作為微生物農(nóng)藥散布于植物，達到對病蟲害的高抑制效果，根據(jù)進一步地利用該絲狀菌的有用性的方法進行專心研究，發(fā)現(xiàn)對于附于植物的害蟲所有植物病原菌的生長具有顯著抑制作用。而且，發(fā)現(xiàn)通過將絲狀菌蠟蚧輪枝菌施于土壤，起到對附于植物根莖的病原菌的生長抑制效果，在移栽后的土壤中也沒有病原菌發(fā)生，并且改良土壤，至此本發(fā)明完成。
即本發(fā)明是(1)一種微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有對植物病原菌具有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作為有效成分；(2)一種如前述(1)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，蠟蚧輪枝菌菌株是具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株；(3)一種如前述(2)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)；(4)一種如前述(2)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)；(5)一種如前述(2)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)；(6)一種如前述(1)-(5)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，植物病原菌是蔬菜、果實的白粉菌、灰霉菌、枯萎病菌或黃萎病菌；(7)一種如前述(4)或(6)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有對草莓灰霉菌具有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)作為有效成分；(8)關(guān)于植物病害抑制方法，其特征在于將前述(1)-(7)記載的微生物農(nóng)藥散布于植物葉面。
本發(fā)明也是(9)一種土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有對土壤病害菌有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作為有效成分；(10)一種如前述(9)記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，蠟蚧輪枝菌菌株是具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株；(11)一種如前述(10)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)；(12)一種如前述(10)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)；(13)一種如前述(10)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)；(14)一種如前述(9)-(13)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，土壤病原菌是枯萎病菌或黃萎病菌；(15)一種如前述(11)或(14)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有抑制黃瓜枯萎病菌引起的土壤病害的蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)作為有效成分；(16)一種如前述(13)或(14)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有抑制番茄黃萎病菌引起的土壤病害的蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)作為有效成分；(17)關(guān)于土壤病害的抑制方法，其特征在于，將前述(9)-(16)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥施于植物根附近。
而且本發(fā)明是(18)一種土壤改良劑，其特征在于，含有前述(9)-(16)記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥作為主要成分；(19)關(guān)于土壤改良方法，其特征在于，將前述(18)記載的土壤改良劑施于土壤。


圖示通過蠟蚧輪枝菌4菌株和草莓灰霉病菌經(jīng)兩相培養(yǎng)的抑制試驗結(jié)果。
圖示在實驗室蠟蚧輪枝菌散布后草莓灰霉侵入部分的程度。
圖示在農(nóng)場蠟蚧輪枝菌接種后草莓灰霉病發(fā)病率的結(jié)果。
以cfu數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌在草莓灰霉病菌感染土壤中的固著性。
以cfu數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌在黃瓜根表面的固著性。
以cfu數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌在黃瓜根際內(nèi)的固著性。
以癥狀重癥度指數(shù)(DSI)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對黃瓜枯萎病發(fā)病抑制作用。
以鮮植物體重量表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對黃瓜枯萎病的發(fā)病抑制作用。
以cfu數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌在番茄黃萎病菌感染土壤中的固著性。
以cfu數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌在番茄根表面的固著性。
以cfu數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌在番茄根際內(nèi)的固著性。
以外觀病癥指數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對番茄黃萎病的發(fā)病抑制作用。
以內(nèi)部病癥度表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對番茄黃萎病的發(fā)病抑制作用。
以植物鮮重表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對番茄黃萎病的發(fā)病抑制作用。
以植物干重表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對番茄黃萎病的發(fā)病抑制作用。
以白粉病菌接種2-4周后的病癥變化為病癥指數(shù)表示本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對胡瓜白粉病的發(fā)病抑制作用。
關(guān)于本發(fā)明蠟蚧輪枝菌對胡瓜白粉病的發(fā)病抑制作用，以對照區(qū)和蠟蚧輪枝菌B-2株(50ml處理區(qū))3周后第3葉的患病狀況照片顯示。
具體實施例方式
本發(fā)明微生物農(nóng)藥非特別限制于含有對植物病原菌具有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌菌株作為有效成分的微生物農(nóng)藥，本發(fā)明植物病害抑制方法非特別限制于將所述本發(fā)明微生物農(nóng)藥散布于植物葉面的方法，同樣，本發(fā)明土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥非特別限制于含有對土壤病害菌具有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌菌株作為有效成分的微生物農(nóng)藥，本發(fā)明土壤病害抑制方法非特別限制于將所述本發(fā)明土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥施于植物根附近，上述植物病原菌例如胡瓜白粉菌、黃瓜屬白粉菌等蔬菜、水果的白粉菌，草莓灰霉菌等蔬菜、水果的灰霉菌，其他有黑星病菌，立枯病菌，三葉草菌核病菌，甜菜菌核病菌等，同樣，上述土壤病害菌例如黃瓜枯萎病菌等蔬菜、水果的枯萎病菌，番茄黃萎病菌等蔬菜、水果的黃萎病菌，其他有軟腐病、甜葉尾腐病、青枯病，根瘤病，辣椒花葉病，苗立枯病，紫紋羽病，白紋羽病，凋萎病，根頭癌腫病等這些病。
上述蠟蚧輪枝菌菌株舉例有A-1株、A-2株(MAFF238426)、B-1株、B-2株(MAFF238429)、C-1株(MAFF238430)，C-2株、ATCC22611株、ATCC22612株、ATCC58907株、ATCC58908株、ATCC58909株、MAFF235690株、MAFF235693株、MAFF235694株、MAFF235696株、MAFF235699株、MAFF235701株等。在這些蠟蚧輪枝菌菌株中，A-1株、A-2株(MAFF238426)、B-1株、B-2株(MAFF238429)、C-1株(MAFF238430)，C-2株等是優(yōu)選的具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株。其中，‘植物體表面固著能力’是指將菌株散布于植物體表面時菌株在給定時間內(nèi)固著于植物體表面的能力，‘植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力’是指將菌株施于植物體根附近時菌株在給定時間內(nèi)固著于植物體根表面和根際內(nèi)的能力。這些蠟蚧輪枝菌菌株由獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所的農(nóng)業(yè)生物資源基因庫和美國種質(zhì)保藏中心(タイプカルチヤ-コレクシヨン)得到。
在上述蠟蚧輪枝菌菌株中，B-2株(MAFF238429)對草莓灰霉病菌有效。草莓灰霉病是病原菌葡萄孢屬灰霉菌(botrytis cinerea)引起的草莓重要病害。該病害由于用化學農(nóng)藥防治的影響陸續(xù)發(fā)生耐藥性菌，并且成為目前難防治的病害。
另外，A-2株(MAFF238426)對黃瓜枯萎病菌引起的土壤病害有效。黃瓜枯萎病是一種溫室栽培中的多發(fā)病。引起該病的是FOM(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)。該病原菌生活在土壤中，例如不利生存的環(huán)境和形成厚膜孢子的環(huán)境作為好條件只有4-5年時間，其仍有發(fā)病危險性。該病的預防方法是利用化學農(nóng)藥和抗性品種，其中問題在于發(fā)現(xiàn)容易具有抗性的新病原菌。
而且，C-1株(MAFF238430)對番茄黃萎病菌引起的土壤病害有效。番茄黃萎病是絲狀菌(Verticillium dahliae vdt-2)的土壤污染，開始時下部分葉子部分枯萎，上部分的葉緣彎曲。之后，枯萎的部分黃化，癥狀主要分布在葉脈。病狀進一步由下部分葉子的方向慢慢枯萎。出現(xiàn)導管變色，但不是特別顯著。與發(fā)生于溫室栽培的枯萎病的發(fā)生條件相比，大地栽培的多發(fā)生于低溫、多濕的季節(jié)。目前，對于該病的對策是利用化學農(nóng)藥和抗性品種，其中問題在于發(fā)現(xiàn)容易具有抗性的新病原菌。
使用一般微生物農(nóng)藥制劑化所用的方法，將本發(fā)明蠟蚧輪枝菌菌株制劑化用作微生物農(nóng)藥和土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥。例如，含有孢子等的菌體，鈣鐵石、高嶺土等礦物質(zhì)載體，淀粉、蔗糖、葡萄糖等糖類以及表面活性劑等適當組合并粉劑化，以使用時溶于水散布的水合劑形式制劑化。表面活性劑使用聚氧化乙烯烷基醚和酯、聚氧化乙烯烷基苯基醚和酯、聚氧乙烯烷基酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯，目的是改善散布時菌體的分散性和展著性。
本發(fā)明微生物農(nóng)藥是將在葉等植物體表面具有固著性的蠟蚧輪枝菌菌株用于植物病原菌防治，在植物體散布后的固著性上優(yōu)異的前述菌株使用時，如果散布時間不符合病原菌的發(fā)生散布于植物就消除了其抑制作用。因此，本發(fā)明微生物農(nóng)藥可以在植物病原菌引起的病害發(fā)生之前預先散布，回避其特定的嚴密散布時間，而且植物病害發(fā)生多次也就沒有必要散布了。而且，本發(fā)明微生物農(nóng)藥施于植物栽培的盆，固著于植物根表面和根際內(nèi)之后移栽于病原菌(鐮刀菌、黃萎病菌)污染土，也抑制土壤病害(枯萎病、黃萎病)發(fā)生。因此，與以前的相比，除了散布次數(shù)減少之外，共計的植物病害防治費用削減并省力化，而且同時防治植物和土壤病害。同樣，以前的是在植物病原菌引起的病害發(fā)生之后必需每隔兩周散布，本發(fā)明微生物農(nóng)藥只散布一次，沒必要在植物栽培過程中進一步散布。另外，根際是指植物根周圍3mm-5mm處的領(lǐng)域。該領(lǐng)域是土壤與植物接觸的領(lǐng)域，從植物也從土壤受到極強的影響。
本發(fā)明土壤改良劑非特別限制于含有本發(fā)明土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥作為主要成分，類似的也適用，本發(fā)明土壤改良方法非特別限制于將所述本發(fā)明土壤改良劑施用于土壤。本發(fā)明土壤改良劑可在土壤病害菌污染前或污染后施用而防治土壤病害菌引起的土壤病害。
以下通過實施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明的寄生范圍不限定于例子所示的。以下按順序分別說明實施例1通過蠟蚧輪枝菌對草莓灰霉病的生物控制、實施例2通過蠟蚧輪枝菌對黃瓜枯萎病的生物控制、實施例3通過蠟蚧輪枝菌對番茄黃萎病的生物控制。
實施例1[草莓灰霉病的生物控制](供試微生物)本發(fā)明者在以下實驗中供試的是分離的蠟蚧輪枝菌A-2株、蠟蚧輪枝菌B-2株、市售的蠟蚧輪枝菌微生物農(nóng)藥Vertalec(バ-タレツク)和Mycotal(マイコタ-ル)的蠟蚧輪枝菌4個菌株。
(在體外培養(yǎng)的蠟蚧輪枝菌的拮抗作用)研究蠟蚧輪枝菌的體外培養(yǎng)在培養(yǎng)基上對草莓灰霉病菌的拮抗性。通過蠟蚧輪枝菌4個菌株和草莓灰霉病菌的兩相培養(yǎng)(dual culture)進行試驗。草莓灰霉病菌アガ-デイスク置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDAシグマ公司制)平板的單側(cè)，在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)上培養(yǎng)過的蠟蚧輪枝菌的アガ-デイスク置于同一平板的另一側(cè)。在25℃下培養(yǎng)5天后測定抑制圈范圍(mm)。相同實驗進行3次。在奧林巴斯光學顯微鏡下觀察蠟蚧輪枝菌和草莓灰霉病菌之間菌絲的相互作用。
在PDA上使用蠟蚧輪枝菌的草莓灰霉病菌抑制試驗結(jié)果是蠟蚧輪枝菌所有菌株形成了強的中間抑制圈范圍(圖1)。圖1中分別表示a是A-2株，b是B-2株，c是バ-タレツク，d是マイコタ-ル。抑菌圈范圍在5日后可以清晰識別，連續(xù)數(shù)周時間圈的范圍縮小。蠟蚧輪枝菌和草莓灰霉病菌的菌絲相互作用可在兩相培養(yǎng)中看到。
(在實驗室中草莓灰霉病菌拮抗藥劑的控制)健康正常的草莓果實在5％消毒藥水(antiformin)中表面殺菌5分鐘，用蒸餾水洗凈。將拮抗藥劑蠟蚧輪枝菌A-2株和B-2株的孢子懸浮液(1×107孢子/ml)和草莓灰霉病菌的懸浮液(1×106孢子/ml)散布于這些草莓果實。用10個果實作為1個處理。散布蒸餾水的果實作為對照。在上述懸浮液和蒸餾水中加入吐溫80作為表面活性劑。處理過的果實保持在25℃的溫度下置于恒溫箱。接種4天后，由圖象推測各草莓果實病變部位，根據(jù)灰霉侵入范圍計算(％)以0-5點進行接種處理過的果實的點數(shù)評價。0＝在各果實中灰霉侵蝕部分為0％，1＝＞0＝＜20％，2＝＞20＝＜40％，3＝＞40＝＜60％，4＝＞60＝＜80％，5＝＞80％。
用蠟蚧輪枝菌處理果實時灰霉指數(shù)僅為0.9-1.0(圖2)?？梢钥闯鏊芯甑慕Y(jié)果和用蒸餾水得到的結(jié)果有顯著差別。在用蠟蚧輪枝菌處理過的果實中，灰霉指數(shù)較低，這些果實覆蓋其他的霉。
在農(nóng)場中天然型灰霉病的控制)在5月23日(2003年)，以列間隔為1m，苗間隔為40cm種植草莓的“エラン(Eran)”品種的苗。各實驗地由每2列各2棵苗共計4棵構(gòu)成。接種蠟蚧輪枝菌懸浮液1×107孢子/ml。在對照苗中，散布自來水，散布抗病蟲害劑百菌清(殺菌劑)和高滅磷(殺蟲劑)(住化武田農(nóng)藥(股份)制)的混合物。加入懸浮液1L，表面活性劑20ml(優(yōu)選之一為20ml吐溫80)。懸浮液于7月11日、7月25日、8月8日和8月22日的傍晚涂敷。成熟的果實主要以每周2次，有時每周3次，收獲后計算果實總數(shù)和感染果實數(shù)。
結(jié)果顯示蠟蚧輪枝菌B-2株具有最佳拮抗性(圖3)。B-2株將灰霉病發(fā)病率抑制至5.0％，バ-タレツク和マイコタ-ル也顯示了抑制作用。此外，研究在實施實驗過程中普遍具有的平均溫度和相對濕度與灰霉發(fā)病率的平均值相關(guān)，還有草莓灰霉病菌的發(fā)病率與相對濕度相關(guān)。
實施例2[黃瓜鐮刀菌枯萎病的生物控制](供試微生物)用表1列舉的包括市售的バ-タレツク和マイコタ-ル，蠟蚧輪枝菌的分離株20株供試。該真菌于暗處25±1℃下在馬鈴薯蔗糖幾丁質(zhì)瓊脂(PSCA1升中，馬鈴薯200g、蔗糖20g、幾丁質(zhì)10g，瓊脂20g)平板上培養(yǎng)2周，之后在濕潤條件下于園藝用土壤和麥麩(4∶1，w/w)中將這些菌株繁殖2周。其他方法是由十勝農(nóng)業(yè)試驗場的黃瓜果木上分離黃瓜鐮刀菌枯萎病菌(FOM)。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上維持在5±1℃繁殖該病原菌。


(供試植物)在全部實驗中使用容易感染黃瓜鐮刀菌枯萎病菌(FOM)的黃瓜品種“キングメルテイ-”。在移栽于盆之前，種子在暗室的petrel培養(yǎng)皿生長2日的時間。這些盆處于調(diào)節(jié)好溫度和濕度的溫室下生長。
(在體外培養(yǎng)的蠟蚧輪枝菌的拮抗作用)研究蠟蚧輪枝菌的體外培養(yǎng)在培養(yǎng)基上對黃瓜鐮刀菌枯萎病菌的拮抗性。通過蠟蚧輪枝菌20個菌株和黃瓜鐮刀菌枯萎病菌的兩相培養(yǎng)(dual culture)進行試驗。黃瓜鐮刀菌枯萎病菌的瓊脂糖培養(yǎng)基置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDAシグマ公司制)平板的一側(cè)，在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)上培養(yǎng)過的蠟蚧輪枝菌的瓊脂糖培養(yǎng)基(アガ-デイスク)置于同一平板的另一側(cè)。在25℃下培養(yǎng)10天后測定抑制圈范圍(mm)。相同實驗進行3次。在奧林巴斯光學顯微鏡下觀察蠟蚧輪枝菌和黃瓜鐮刀菌枯萎病菌之間菌絲的相互作用。
蠟蚧輪枝菌的體外培養(yǎng)對黃瓜鐮刀菌枯萎病菌的拮抗性試驗結(jié)果如表1所示。由表1可知，蠟蚧輪枝菌的A-2株、B-1株、C-1株和MAFF235693株顯示了強抑制圈范圍。
(菌落在土壤、根表面和根際的形成)該實驗使用蠟蚧輪枝菌分離株20個菌株。用這20個菌株處理過的20種處理土壤分別加入非殺菌土壤(3％)。非殺菌土壤作為對照區(qū)。黃瓜種子以每3顆1盆種植(3個重復)。30日后用稀釋平板法檢測這些菌落。拔出各盆苗3棵中的2棵的根。在試管中，這些根在5ml蒸餾水中震蕩1分鐘。在加有45ml蒸餾水的錐瓶中加入5g根際土壤。根和土壤分別稀釋4倍和3倍。在含有硫酸鏈霉素的二碘曙紅瓊脂培養(yǎng)基中滴入1ml懸浮液，在25℃下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，計算蠟蚧輪枝菌菌落。所有實驗各進行3次。
在土壤、根表面和根際內(nèi)檢測蠟蚧輪枝菌菌落。菌落(cfu)數(shù)的結(jié)果分別如圖4-6所示。在土壤中，檢測全部菌株，充分顯示高的菌落形成能力(圖4)。其中，ATCC22612株、A-2株和A-3株超過5×108cfu/g。在根表面，A-2株和B-1株具有高的菌落形成能力和優(yōu)異的固著性(圖5)。同樣，在根際，MAFF235701株，ATCC58908株，ATCC22612株也可以形成其大規(guī)模菌落和優(yōu)異的固著性(圖6)。
(溫室內(nèi)的接種實驗)在該實驗中，使用6株蠟蚧輪枝菌(MAFF235690、MAFF235693、ATCC58908、A-2、B-2和C-1)。種子在陪替式培養(yǎng)皿中生長，在裝滿約16g苗培養(yǎng)土(タキイ種苗公司制)的盆中，移栽于含有混入3％蠟蚧輪枝菌培養(yǎng)液的處理土壤的各雅致的盆(日本阪田種苗公司制6cm)。苗生出子葉時，這些盆加入1％病原菌FOM感染土壤移于塑料淺盤。這些植物置于溫室30日后，以癥狀重癥指數(shù)(DSI)和植物鮮重量評價。DSI(％)是由立枯葉數(shù)/全部葉數(shù)×100得出。在各植物中，基于植物葉外觀評價，0等級植物為健康正常，100等級的植物為死亡，進行0-100等級區(qū)分。
根據(jù)以前的實驗，由于拮抗作用顯著，選擇蠟蚧輪枝菌的3株(MAFF235690株、MAFF235693株和ATCC58908株)。另外，通過本發(fā)明者的研究進行的評價，該實驗使用在葉表面具有菌落形成能力的3株(A-2株、B-2株和C-1株)。這6個菌株顯示了優(yōu)異的生物控制作用(圖7)。移栽于盆16日后，除了控制區(qū)以外，病原體控制區(qū)以及所有株感染FOM。從第24日開始病原體控制顯示急劇的損害，DSI值最終為80％。在蠟蚧輪枝菌株中，A-2株控制的最好。不是只有A-2株，而且B-2株、ATCC235693株、MAFF58908株在初級階段可以充分控制。由病原體控制而得的植物鮮重量(圖8)是每棵植物0.7g。與其相比較，由控制而得的植物鮮重量(圖8)是每棵植物4.5g。以A-2株處理的植物鮮重量為每棵植物2.0g。
實施例3[番茄黃萎病的生物控制](供試微生物)與實施例2相同，以表2列舉的含有市售的バ-タレツク和マイコタ-ル，蠟蚧輪枝菌的分離株20株供試。


(在體外培養(yǎng)的蠟蚧輪枝菌的拮抗作用)研究蠟蚧輪枝菌的體外培養(yǎng)在培養(yǎng)基上對番茄黃萎病菌的拮抗性。通過蠟蚧輪枝菌20個菌株和番茄黃萎病菌的兩相培養(yǎng)(dual culture)進行試驗。番茄黃萎病菌瓊脂糖培養(yǎng)基置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDAシグマ公司制)平板的單側(cè)，在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)上培養(yǎng)過的蠟蚧輪枝菌的瓊脂糖培養(yǎng)基置于同一平板的另一側(cè)。在25±0.1℃下培養(yǎng)3周后測定抑制圈范圍(mm)。相同實驗進行3次。在奧林巴斯光學顯微鏡下觀察蠟蚧輪枝菌和番茄黃萎病菌之間菌絲的相互作用。
蠟蚧輪枝菌的體外培養(yǎng)對番茄黃萎病菌的拮抗性試驗結(jié)果如表2所示。通過蠟蚧輪枝菌菌落以圍攏抑制圈可限制病原體的生長，可以清楚看到其抑制作用。由表2可知，除了ATCC22611株、ATCC58908株、MAFF235696株、MAFF235699株、MAFF235701株之外，蠟蚧輪枝菌菌株顯示了對番茄黃萎病菌(V.Dahliae)的抗真菌活性。尤其是，バ-タツク株、B-1株、B-2株、MAFF 235690株、ATCC58907株顯著抑制番茄黃萎病菌的生長。
(菌落在土壤、根表面和根際的形成)該實驗使用蠟蚧輪枝菌分離株20個菌株。用這20個菌株處理過的20種處理土壤分別加入非殺菌土壤(3％)。非殺菌土壤作為對照區(qū)。番茄種子以每3顆1盆種植(3個重復)。在25℃下生長4周后用稀釋平板法檢測這些菌落。拔出各盆苗3棵中的2棵的根。在試管中，使用附有這些土壤的根5g和蒸餾水，為了根表面真菌菌落游離于水中，使用(超微波清洗機)super micro wave washing machine將這些根攪拌1分鐘。另外，用攪拌機將附著的土壤攪勻。攪拌后的根和土壤用滅菌蒸餾水連續(xù)稀釋，在含有硫酸鏈霉素的二碘曙紅瓊脂培養(yǎng)基中滴入1ml懸浮液，在25℃下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，計算蠟蚧輪枝菌菌落。各實驗各進行3次。
在土壤、根表面和根際內(nèi)檢測蠟蚧輪枝菌菌落。菌落(cfu)數(shù)的結(jié)果分別如圖9-11所示。在土壤中，檢測所有菌株，充分顯示高的菌落形成能力(圖9)。其中，ATCC22612株、A-1株、A-3株、C-1株、ATCC589095株顯示了高的菌落形成能力，Vertalec(バ-タレツク)株、ATCC58908株、MAFF235701株顯示了高的菌落形成能力。在根表面，B-2株、A-3株、ATCC22612株、ATCC58909株、MAFF235696株、MAFF235699株、MAFF235701株在1.83×104-2.29×104孢子/ml時具有高的菌落形成能力和優(yōu)異的固著性(圖10)。同樣，在根際，B-2株、C-1株、Vertalec(バ-タレツク)株、ATCC58908株、MAFF235690株和MAFF235696株在0.67×105-0.73×105孢子/ml時具有高的菌落形成能力和優(yōu)異的固著性(圖11)。
(溫室內(nèi)的接種實驗)在該實驗中，使用6株蠟蚧輪枝菌株(MAFF235690、ATCC58908、A-2、B-2、B-1和C-1)。種子在陪替式培養(yǎng)皿中生長，在裝滿約16g苗培養(yǎng)土(日本阪田種苗公司制)的盆中，移栽于含有混入3％蠟蚧輪枝菌培養(yǎng)液的處理土壤的各雅致的盆(日本瀧井公司制；6cm)。苗生出子葉時，這些盆加入5％病原菌(V.dahliae)感染土壤200g移于塑料淺盤。這些植物置于20-25℃的溫室10周。準備用番茄黃萎病菌處理(pathogen)或未處理的苗(control)作為對照。實驗結(jié)束時回收莖和葉，測量鮮重量和干重量。在各處理中進行3次重復，每次重復由4棵植物構(gòu)成。利用許多枯莖以外觀病癥指數(shù)和內(nèi)部病癥度評價莖的病癥。為了該實驗的對照與其他處理比較成長，播種2周后注入V.Dahliae懸浮液1ml，另外播種8周后注入ハイポネツクス(HYPONeX)(1ml/盆)。上述外觀病癥指數(shù)為枯萎莖數(shù)/全部莖數(shù)×100得到，內(nèi)部病癥是基于植物變色程度以0-3等級進行評價。
根據(jù)以前的實驗，由于拮抗作用顯著，選擇蠟蚧輪枝菌的2株(MAFF235690株和ATCC58908株)。另外，在本發(fā)明者的研究中進行評價，該實驗使用在葉表面具有菌落形成能力的4株(A-2株、B-2株、B-1株和C-1株)。其結(jié)果如圖12(外部病癥指數(shù)(％))和圖13(內(nèi)部病癥度)所示。這些菌株顯示了優(yōu)異的生物控制作用(圖12，13)。移栽于盆后，除了控制區(qū)以外，病原體控制區(qū)以及所有株感染番茄黃萎病菌。蠟蚧輪枝菌C-1株對番茄黃萎病的枯萎抑制作用最有效。B-1株、MAFF235690株對初期階段番茄黃萎病的枯萎有效。與病原菌對照相比較，B-1株顯示了番茄實際生長的鮮重量(g/植物)和干重量(g/植物)的增加(圖14，15)。由于蠟蚧輪枝菌菌株減少了內(nèi)部病癥的重癥度，結(jié)果大致等于外觀病癥發(fā)生率。與病原體對照相比較，全部菌株顯著地顯示了內(nèi)部病癥數(shù)的減少。然而，B-2株和C-1株與對照同樣顯示了內(nèi)部病癥重癥度的減少。
實施例4[在體外培養(yǎng)的蠟蚧輪枝菌的拮抗作用]與實施例1-3相同，研究體外培養(yǎng)的蠟蚧輪枝菌的拮抗作用。其結(jié)果顯示了蠟蚧輪枝菌B-2株對胡瓜白粉病和黃瓜白粉病的強拮抗作用，顯示了蠟蚧輪枝菌A-2株對胡瓜白粉病的拮抗作用。
實施例5[胡瓜白粉病的生物控制](供試微生物)供試微生物使用蠟蚧輪枝菌B-2株(Verticillium lecanii B-2)。
(溫室內(nèi)的接種實驗)在該實驗中，使用在盆內(nèi)生長的胡瓜葉3片作為供試植物。在供試植物根周圍土壤中，使用蠟蚧輪枝菌B-2株孢子(孢子濃度為1×107/ml)，以1株用10ml或50ml的量處理。對照區(qū)(控制)使用未處理。對于用蠟蚧輪枝菌B-2株孢子處理的植物，處理后，24小時后在葉面上散布胡瓜白粉病菌孢子(104的分生孢子/ml)，接種(接種葉)，接種后，2-4周后觀察病癥變化。另外，同樣地，對于對照區(qū)植物，在葉面上散布胡瓜白粉病菌孢子(104的分生孢子/ml)，接種，接種后，2-4周后觀察病癥變化。進一步地，對于用蠟蚧輪枝菌B-2株孢子處理的植物和對照區(qū)植物，進行胡瓜白粉病菌孢子接種(未接種葉)，2-4周后觀察病癥變化(通過白粉病菌空氣污染的患病觀察)。
(病癥的變化)上述接種實驗的結(jié)果如圖16和圖17所示。在圖16中，胡瓜白粉病菌接種后，在圖表中病癥指數(shù)表示2-4周后病癥變化。由圖16可知其與對照區(qū)有顯著差別。在圖17中，對于對照區(qū)與蠟蚧輪枝菌B-2株(50ml處理區(qū))，照片顯示其3周后第3葉的患病狀況。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明含蠟蚧輪枝菌的微生物農(nóng)藥通過施于植物抑制地上部植物病原菌生長，同樣，本發(fā)明含蠟蚧輪枝菌的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥通過施于植物根附近也抑制土壤病害鐮刀菌病(Fusarium病)、黃萎病(Verticillium病)等發(fā)病、防治植物生長的周圍環(huán)境中的病害。
權(quán)利要求
1.一種微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有對植物病原菌具有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作為有效成分。
2.一種如權(quán)利要求1記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，蠟蚧輪枝菌菌株是具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株。
3.一種如權(quán)利要求2記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)。
4.一種如權(quán)利要求2記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)。
5.一種如權(quán)利要求2記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)。
6.一種如權(quán)利要求1-5任一記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，植物病原菌是蔬菜、果實的白粉菌、灰霉菌、枯萎病菌或黃萎病菌。
7.一種如權(quán)利要求4或6記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有對草莓灰霉菌具有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)作為有效成分。
8.一種植物病害抑制方法，其特征在于將權(quán)利要求1-7任一記載的微生物農(nóng)藥散布于植物葉面。
9.一種土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有對土壤病害菌有生長抑制作用的蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作為有效成分。
10.一種如權(quán)利要求9記載的微生物農(nóng)藥，其特征在于，蠟蚧輪枝菌菌株是具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株。
11.一種如權(quán)利要求10記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)。
12.一種如權(quán)利要求10記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌B-2株(MAFF238429)。
13.一種如權(quán)利要求10記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株是蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)。
14.一種如權(quán)利要求9-13記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，土壤病原菌是枯萎病菌或黃萎病菌。
15.一種如權(quán)利要求11或14記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有抑制黃瓜枯萎病菌引起的土壤病害的蠟蚧輪枝菌A-2株(MAFF238426)作為有效成分。
16.一種如權(quán)利要求13或14記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥，其特征在于，含有抑制番茄黃萎病菌引起的土壤病害的蠟蚧輪枝菌C-1株(MAFF238430)作為有效成分。
17.一種土壤病害的抑制方法，其特征在于，將權(quán)利要求9-16任一記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥施于植物根附近。
18.一種土壤改良劑，其特征在于，含有權(quán)利要求9-16記載的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥作為主要成分。
19.一種土壤改良方法，其特征在于，將權(quán)利要求18記載的土壤改良劑施于土壤。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過將含有對植物病原菌具有生長抑制作用的絲狀菌蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)的微生物農(nóng)藥散布于水果、蔬菜等植物上進行植物病害防治的微生物農(nóng)藥，以及在土壤中使用含有絲狀菌蠟蚧輪枝菌的土壤病害抑制用微生物農(nóng)藥達到土壤改良效果的土壤改良劑。由于絲狀菌蠟蚧輪枝菌優(yōu)選具有植物體表面固著能力的菌株和/或具有植物體根表面和/或根際內(nèi)固著能力的菌株作為微生物農(nóng)藥應用于植物，其對于附于植物的害蟲所有植物病原菌的生長具有顯著抑制作用，而且，通過施于土壤，起到對植物根莖及其根際的病原菌的生長抑制作用，在移栽后的土壤中也沒有病原菌發(fā)生，從而改良土壤。
文檔編號A01N63/00GK1946298SQ200580013349
公開日2007年4月11日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月28日
發(fā)明者小池正德, 吉田早苗, 阿部倫子, 淺野健治 申請人:獨立行政法人科學技術(shù)振興機構(gòu)