專利名稱：穩(wěn)心草的種植方法及快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)心草的種植方法及快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)又稱植物克隆，是指通過無菌操作把植物體的各類結(jié)構(gòu)材料，即外植體，包括各種器官、組織或細(xì)胞，在人工控制的環(huán)境條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過生長(zhǎng)發(fā)育的過程，產(chǎn)生可以用于繁殖的完整植株，并在數(shù)量上得到大幅度的增加。植物組織培養(yǎng)有器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)等。
組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基和小氣候環(huán)境條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生長(zhǎng)極為有利，便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。
植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長(zhǎng)較快。另外，植株也比較小，往往20～30天為一個(gè)周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級(jí)數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時(shí)提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。
植物組織培養(yǎng)是在一定的場(chǎng)所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、相對(duì)濕度、營(yíng)養(yǎng)、激素等條件，極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動(dòng)化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。
呼倫貝爾野生植物穩(wěn)心草(學(xué)名為黑點(diǎn)葉金絲桃，Hypericum attenuatttmChois.)，因當(dāng)?shù)鼐用裼糜谥委熜呐K病而得名，屬多年生草本植物。根莖肉質(zhì)、帶須，叢生3～5枝草，成熟穩(wěn)心草株高60～80厘米，草枝上對(duì)稱生長(zhǎng)枝杈，枝杈不再分杈，枝杈上對(duì)稱生長(zhǎng)草葉，草葉橢圓形，草葉紋絡(luò)對(duì)稱隨葉形，傘形花在枝杈頂端苞蕾上生、小黃花，苞蕾成熟后果內(nèi)花籽微小，針形，黑色。苞果形狀上尖底圓，中間有一道紋絡(luò)，整體外觀酷似人的心臟。穩(wěn)心草生長(zhǎng)分布在呼倫貝爾大興安嶺山脈雜木林蔭下，極為稀少罕見。穩(wěn)心草生物屬性介于草本與木本之間，有著奇特的生物現(xiàn)象，雖為綠色植物，但將其浸入水中就會(huì)立刻滲現(xiàn)出鮮血般的顏色。穩(wěn)心草每年4月末5月初返青，6月在枝杈頂端顯現(xiàn)花蕾，花蕾頂部開出黃色小花，花期可至9月霜凍時(shí)，霜凍后莖葉開始干枯，外觀由綠色變成暗紅色。
穩(wěn)心草，味甘、微澀、草香，根莖、葉、花、籽均可入藥，含有豐富的氨基酸和多種微量礦物質(zhì)元素等藥效成份，這在草本植物中是非常少見的。穩(wěn)心草能溶于水，但以白酒泡制其藥效顯著，藥力能快速入血?dú)w心，通達(dá)人體微循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)血液進(jìn)行滅菌、消毒、分解、清潔，能溶解高稠血脂、膽固醇、血栓梗質(zhì)、血小板凝固物質(zhì)等，具有快速恢復(fù)和全面提高人體免疫力等獨(dú)特功效?，F(xiàn)已有研究表明，穩(wěn)心草在治療克山病方面具有很好的療效。
穩(wěn)心草生長(zhǎng)分布稀少罕見的原因，主要是其種子進(jìn)化程度低，質(zhì)量小，不能適應(yīng)自然環(huán)境下繁衍生殖。經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室將土壤和溫濕度等調(diào)至最佳條件，其種子出苗率不足0.3％。由此可見，穩(wěn)心草是一種十分古老和進(jìn)化程度極低的瀕臨滅絕的草本藥用植物物種。
針對(duì)穩(wěn)心草在自然條件下的種子繁殖成活率極低，繁殖速度十分緩慢，現(xiàn)有資源遠(yuǎn)不能滿足人們需求，多年來人們又沒能成功的進(jìn)行人工繁殖等問題，需要研究開發(fā)一種大量地快速繁殖穩(wěn)心草的方法，使之能夠滿足需要。
迄今為止，尚沒有關(guān)于人工繁殖種植生產(chǎn)穩(wěn)心草的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種穩(wěn)心草的種植方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種穩(wěn)心草的快速繁殖方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)目的，本發(fā)明提供的種植方法能夠很好的適用于穩(wěn)心草，采用種子催芽、播種繁育、莖尖組織培養(yǎng)、移栽種植等綜合技術(shù)，實(shí)現(xiàn)全年連續(xù)的快速繁育，以滿足大面積種植時(shí)對(duì)穩(wěn)心草幼苗的需求。
所述穩(wěn)心草的種植方法可主要包括下述步驟
A1、將采自內(nèi)蒙古的穩(wěn)心草種子種在作為基質(zhì)的腐殖質(zhì)土中，無直射光照，直至長(zhǎng)出能夠用于莖尖組織培養(yǎng)的穩(wěn)心草幼苗，作為穩(wěn)心草外植體；或者選取自然生長(zhǎng)的穩(wěn)心草嫩莖，作為穩(wěn)心草外植體；A2、從經(jīng)消毒處理的穩(wěn)心草外植體上切取莖尖，接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至分化出叢生芽；或者從經(jīng)消毒處理的穩(wěn)心草外植體上切取莖尖，接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至在芽基部周圍形成愈傷組織，將愈傷組織切下來接種在分化培養(yǎng)基上，直至分化出叢生芽；A3、當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至3～5厘米時(shí)單株切下，接種至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出根系，得到穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗；A4、將由步驟A3得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗向室外種植地進(jìn)行移栽種植，移栽時(shí)按行間距20～60厘米，移栽在每年的無霜期內(nèi)進(jìn)行，種植地為腐殖質(zhì)多的草地或雜木林地，作遮陽和保濕管理。
本發(fā)明所涉及的部分術(shù)語說明如下所述“外植體”為從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的材料。
所述“叢生芽”為在植株體同一處著生的許多芽。
所述“莖尖”為帶頂芽的莖段。
所述“無直射光照”為有光照，但無直射陽光。
所述“分化”為細(xì)胞在分裂過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變，從而在發(fā)育中形成各類組織和器官，完成整個(gè)生活周期。
所述“愈傷組織”為在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團(tuán)不規(guī)則細(xì)胞，多在外植體切面上產(chǎn)生。
所述“胚狀體”對(duì)應(yīng)于胚，為在離體培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一種形似胚(具有明顯的根端和芽端)，功能與胚相同的結(jié)構(gòu)。
在上述方法中，所述穩(wěn)心草的外植體可以是穩(wěn)心草的某個(gè)器官，如莖、根或葉，也可以是穩(wěn)心草的組織、細(xì)胞等。
優(yōu)選的，所述穩(wěn)心草的外植體為經(jīng)人工播種繁育出的穩(wěn)心草幼苗，或者為在生長(zhǎng)季節(jié)，選取自然生長(zhǎng)的穩(wěn)心草嫩莖。
進(jìn)一步的，在上述方法中，在步驟A1中，溫度為20～30℃，相對(duì)濕度為60～80％；
在步驟A2中，溫度為24～28℃，相對(duì)濕度為60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，用于光照的光源為日光燈或散射日光；在步驟A3中，溫度為24～28℃，相對(duì)濕度為60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，用于光照的光源為日光燈或散射日光。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在植株的組織培養(yǎng)中，溫度、相對(duì)濕度、光照等培養(yǎng)條件對(duì)植株生長(zhǎng)的影響很大。如果溫度、相對(duì)濕度等選擇不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖率下降，甚至?xí)霈F(xiàn)試管苗的玻璃化現(xiàn)象。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)摸索，確定出上述方法中所采用的培養(yǎng)條件是穩(wěn)心草組織培養(yǎng)的較佳條件。
在上述方法中，叢生芽可由穩(wěn)心草的外植體直接產(chǎn)生；也可是在外植體上誘導(dǎo)出的愈傷組織形成胚狀體，再分化成芽，這兩種途徑均可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
對(duì)外植體的消毒，可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法。優(yōu)選的，可以用無菌水洗凈用于組織培養(yǎng)的外植體表面，再用70％酒精消毒。在上超凈臺(tái)后用0.1％氧化汞作表面消毒，再用無菌水清洗。例如，用無菌水洗凈表面，在70％酒精中浸泡8～30秒(或用70％酒精擦拭)，在上超凈臺(tái)后，在0.1％的氧化汞溶液中消毒3～5分鐘，用無菌水沖洗3～5次，然后在無菌條件下接種在培養(yǎng)基上。
在滅菌消毒后，可用血清學(xué)檢測(cè)法等常規(guī)方法判斷外植體是否已被消毒。
在上述方法中，培養(yǎng)材料的接種操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，如在無菌培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，接種前要對(duì)室內(nèi)及所用工具、材料等提前消毒。
在本發(fā)明的培養(yǎng)中，用于光照的光源應(yīng)能達(dá)到本發(fā)明所需的光強(qiáng)度，并且應(yīng)為散射光源，通?？梢圆捎梅奖阋椎玫娜展鉄艋蛏⑸淙展獾?。
在步驟A1中用作基質(zhì)的腐殖質(zhì)土可通過挖取山上雜木林蔭地表10厘米以下的腐殖土而得到。
可將腐殖質(zhì)土放入40×40×20厘米的種植培養(yǎng)盤內(nèi)，自然pH值，不作滅菌處理，以保持自然的營(yíng)養(yǎng)成分和利于生命力強(qiáng)的種子長(zhǎng)出。
點(diǎn)種穩(wěn)心草種子時(shí)，相鄰種子的間距為2～5厘米，深度為0.3～0.7厘米。
優(yōu)選的，將種子按3×3×3厘米的品字形點(diǎn)種，深度0.5厘米左右，然后置無直射光的培養(yǎng)室架上培養(yǎng)。
在所述培養(yǎng)條件下，通常經(jīng)5天左右出苗，25～30天左右株高長(zhǎng)至15～20厘米，這時(shí)就可以用于莖尖組織培養(yǎng)。
由于穩(wěn)心草不能忍受強(qiáng)烈的直射光線，在適度的遮蔽下才能生長(zhǎng)良好，因此在穩(wěn)心草幼苗的生長(zhǎng)過程中，采用的光照為無直射光照。
在上述步驟A2中切取的莖段長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)確保正常的分化出叢生芽，或者應(yīng)當(dāng)確保正常的形成愈傷組織，通常切取2～3厘米的莖尖較為適宜。
一般來說，在所述培養(yǎng)條件下，經(jīng)20天左右便可從芽基部分分化出3～5個(gè)叢生芽，同時(shí)芽基部分可出現(xiàn)愈傷組織。在所述培養(yǎng)條件下，通常經(jīng)15天左右，愈傷組織可分化出叢生芽。
在上述步驟A3中在所述培養(yǎng)條件下，通常經(jīng)10天左右可長(zhǎng)出根系，20天左右根系發(fā)達(dá)，植株生長(zhǎng)健壯。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)基的pH值對(duì)穩(wěn)心草的組織培養(yǎng)具有一定的影響，通常略偏酸性的培養(yǎng)基更有利。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的pH值為5～6。更優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的pH值為6。
在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基的配方也是決定穩(wěn)心草繁殖率的重要因素。在本發(fā)明中，莖尖培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基可選自MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、改良的MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、heller培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基。通?？梢岳蒙鲜龀Ｓ门囵B(yǎng)基作為基礎(chǔ)配方，然后再根據(jù)穩(wěn)心草組織的生長(zhǎng)情況，選擇性添加各種植物激素(包括細(xì)胞分裂素類、生長(zhǎng)素類等)、瓊脂、蔗糖等，并調(diào)整pH值。穩(wěn)心草對(duì)激素的反應(yīng)比較敏感，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類的種類、相對(duì)比例和絕對(duì)量都能直接影響到組織培養(yǎng)的過程。所用的生長(zhǎng)素類包括萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、2，4-二氯萘氧乙酸(2，4-D)等，所用的細(xì)胞分裂素類包括6-芐基氨基嘌呤(BA)、激動(dòng)素(KT)、玉米素(ZT)等。
一般植物激素都配制成1mg/ml的濃度。在配培養(yǎng)基時(shí)，按培養(yǎng)基配方中數(shù)值的10倍來量取。如某培養(yǎng)基配方為MS+BA0.5，其意義為在每升MS基本培養(yǎng)基中加入BA0.5mg。按照我們先前配制的激素儲(chǔ)藏液的濃度，我們只需量取0.5ml儲(chǔ)藏液注入培養(yǎng)基即可滿足0.5mg/L的要求。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，穩(wěn)心草莖尖組織培養(yǎng)所用的分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基等均為MS培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果表明，叢生芽的誘導(dǎo)率約為85％以上，愈傷組織的誘導(dǎo)率為60％以上，生根率為95％以上，說明該培養(yǎng)基適用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，穩(wěn)心草莖尖組織培養(yǎng)所用的分化培養(yǎng)基為MS+BA 0.3mg/L+NAA 0.4mg/L，生根培養(yǎng)基為MS+IAA 0.5mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS+BA2.5mg/L+NAA 0.2mg/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，叢生芽的誘導(dǎo)率約為90％以上，愈傷組織的誘導(dǎo)率為55％以上，生根率為90％以上。
在本發(fā)明的還一個(gè)具體實(shí)施方式
中，穩(wěn)心草莖尖組織培養(yǎng)所用的分化培養(yǎng)基為N6+4-D 0.1mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS，增殖培養(yǎng)基為N6+KT 1.5mg/L+IBA 0.1mg/L。試驗(yàn)結(jié)果表明，叢生芽的誘導(dǎo)率約為70％左右，愈傷組織的誘導(dǎo)率為40％左右，生根率為75％左右。
由于MS培養(yǎng)基為植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，方便易得，更符合工業(yè)化生產(chǎn)的需要，因此，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基優(yōu)選為MS培養(yǎng)基。
將分裝好的培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，取出滅菌后的培養(yǎng)基要及時(shí)用皮套系緊，放試驗(yàn)臺(tái)上冷卻凝固備用。
在上述方法中，將叢生芽切下后可先進(jìn)行增殖培養(yǎng)，然后再進(jìn)行生根培養(yǎng)。因此，在上述步驟A1后，還可進(jìn)一步包括下述增殖培養(yǎng)步驟將叢生芽切下來接種至增殖培養(yǎng)基上，溫度26～28℃，相對(duì)濕度60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，直至增殖分化出叢生芽。
在上述步驟中，切取的莖段長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)確保正常的分化出叢生芽，通常經(jīng)15天左右增殖分化出5～6倍的叢生芽。
優(yōu)選的，所用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
進(jìn)一步的，所述穩(wěn)心草的種子可首先進(jìn)行催芽培養(yǎng)處理，以加快出芽速度，并提高出芽率。所述催芽步驟如下將經(jīng)消毒的種子用40～50℃的溫水浸泡15～30小時(shí)，然后取出種子，溫度26～28℃，相對(duì)濕度70～80％，培養(yǎng)2～4天。
在上述步驟中，通常應(yīng)選用籽粒飽滿的種子，用70％的酒精漂洗消毒。
在溫水中浸泡的時(shí)間優(yōu)選為24小時(shí)，浸泡24小時(shí)后，在顯微鏡下可見種子濕潤(rùn)膨大。
培養(yǎng)時(shí)，為了能夠保持溫度恒定，通常將種子置于恒溫箱中，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為3天左右，此時(shí)，在顯微鏡下可見種子尖部生出白色小芽，出芽率可為65％以上。該催芽方法簡(jiǎn)便易行，在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可降低生產(chǎn)成本。
穩(wěn)心草每年8～9月份種子成熟，這時(shí)選擇植株高而粗壯的采摘其苞果，掰開苞果將里面的種子倒入密封的瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆?，作為用于催化培養(yǎng)的種子。
進(jìn)一步的，上述方法還包括如下的移栽種植步驟將由上述方法的步驟A3得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗向室外種植地進(jìn)行移栽種植，移栽在每年的無霜期內(nèi)進(jìn)行，種植地為腐殖質(zhì)多的土地，作遮陽和保濕管理。
在上述步驟中，在每年5月中旬至8月末的無霜期內(nèi)均可進(jìn)行移栽。移栽地宜選擇腐殖質(zhì)多的草地或雜木林地，土地不需作翻耕和除草處理，因?yàn)榉€(wěn)心草具有在和其它植物共生條件下轉(zhuǎn)化吸收各種營(yíng)養(yǎng)成分的生物特性，同時(shí)其它植物可起到遮陽和保持蔭濕環(huán)境的作用。
移栽時(shí)按行間距20～60厘米，將連帶培養(yǎng)土的苗栽種至坑穴內(nèi)，然后培土踏實(shí)并一次性澆透水即可。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，移栽時(shí)的行間距為40×40厘米，所挖坑穴的大小為8×10厘米。
穩(wěn)心草喜在蔭濕環(huán)境生長(zhǎng)，因而種植地要做好遮陽和保濕管理，有條件的可搭架遮陽和鋪設(shè)噴灌設(shè)施，還可在種植地按東西向間距30米左右栽種速生楊等林木，以增強(qiáng)抗風(fēng)、遮陽和保濕等自然調(diào)節(jié)能力，同時(shí)還要加強(qiáng)防范牲畜踐踏和采食以及春秋兩季防火等管防工作。
由于通過上述方法得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗是在無菌、高濕、恒溫環(huán)境下生長(zhǎng)和發(fā)育的，既不保濕也不能防止雜菌侵染，因此，還需經(jīng)過馴化培養(yǎng)以適應(yīng)移栽至自然環(huán)境下的正常生長(zhǎng)。所述馴化培養(yǎng)步驟如下將由上述方法的步驟A3得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗移栽至以自然腐殖土質(zhì)作為基質(zhì)的種植培養(yǎng)盤內(nèi)，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～60％，散射日光照，馴化培養(yǎng)15～25天。
在上述步驟中，植株之間應(yīng)保持一定的行間距，通常為10～20厘米，優(yōu)選為15×15厘米，經(jīng)20天左右馴化培養(yǎng)后，即可向室外種植地移栽種植。
穩(wěn)心草每年9月份霜凍后生長(zhǎng)期結(jié)束，收獲后可在立秋后20天左右進(jìn)行。收獲時(shí)用鐮刀從穩(wěn)心草貼根處割下，然后打成捆裝入透氣性好的袋中，防止草葉或枝杈掉失，運(yùn)回后要放置在蔭涼通風(fēng)層架上保管，以防霉變。
加工時(shí)先將雜草挑出，再用粉碎機(jī)粉碎成末后裝入密封的容器內(nèi)，以備深加工成為各種溶液劑、注射劑、沖劑、片劑、膠囊、丸及酊劑等藥品和從中提取藥效成分及加工成為其它功能性產(chǎn)品時(shí)使用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)心草的快速繁殖方法，其包括下述步驟B1、將采自內(nèi)蒙古的穩(wěn)心草種子種在作為基質(zhì)的腐殖質(zhì)土中，無直射光照，直至長(zhǎng)出15～20的穩(wěn)心草幼苗，作為穩(wěn)心草外植體；或者選取自然生長(zhǎng)的穩(wěn)心草嫩莖，作為穩(wěn)心草外植體；B2、從經(jīng)消毒處理的穩(wěn)心草外植體上切取2～3厘米的莖尖，接種在pH值為5～6的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至分化出叢生芽；或者從經(jīng)消毒處理的穩(wěn)心草外植體上切取莖尖，接種在pH值為5～6的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至在芽基部周圍形成愈傷組織，將愈傷組織切下來接種在pH值為5～6的分化培養(yǎng)基上，直至分化出叢生芽；B3、當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至3～5厘米時(shí)單株切下，接種至pH值為5～6的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出根系，得到穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗。
進(jìn)一步的，在步驟B1中，溫度為20～30℃，相對(duì)濕度為60～80％；在步驟B2中，溫度為24～28℃，相對(duì)濕度為60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，用于光照的光源為日光燈或散射日光；在步驟B3中，溫度為24～28℃，相對(duì)濕度為60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，用于光照的光源為日光燈或散射日光。
進(jìn)一步的，對(duì)所述穩(wěn)心草外植體的消毒處理步驟為用無菌水洗凈用于組織培養(yǎng)的外植體表面，再用70％酒精消毒8～30秒，在上超凈臺(tái)后用0.1％氧化汞作表面消毒3～5分鐘，再用無菌水清洗3～5次。
所述穩(wěn)心草的種子可首先通過下述步驟進(jìn)行催芽培養(yǎng)處理將經(jīng)消毒的種子用40～50℃的溫水浸泡15～30小時(shí)，然后取出種子，溫度24～28℃，相對(duì)濕度70～80％，培養(yǎng)2～4天。
在步驟A2后，可進(jìn)一步包括下述步驟將叢生芽切下來接種至pH值為5～6的增殖培養(yǎng)基上，溫度24～28℃，相對(duì)濕度60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，直至增殖分化出叢生芽。
所述方法還可進(jìn)一步包括下述步驟將由步驟A3得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗移栽至以自然腐殖上質(zhì)作為基質(zhì)的種植培養(yǎng)盤內(nèi)，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～60％，散射日光照，馴化培養(yǎng)15～25天；將經(jīng)馴化培養(yǎng)的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗向室外種植地進(jìn)行移栽種植，移栽在每年的無霜期內(nèi)進(jìn)行，種植地為腐殖質(zhì)多的土地，作遮陽和保濕管理。
本發(fā)明提供了野生草本藥用植物穩(wěn)心草的人工繁殖方法和種植方法，從而可以實(shí)現(xiàn)人工種植生產(chǎn)，在挽救這一珍奇的瀕臨滅絕的草本藥用植物物種的同時(shí)，為人類大量提供能夠加工生產(chǎn)成為具有很高價(jià)值的藥品的草本藥用植物資源。本發(fā)明的穩(wěn)心草種植技術(shù)，目前尚未出現(xiàn)過報(bào)道，所以本發(fā)明屬國(guó)內(nèi)外首創(chuàng)，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外對(duì)野生草本藥物植物穩(wěn)心草進(jìn)行人工繁殖種植的空白。
本發(fā)明人多年民間臨床近80余例各類重病患者試驗(yàn)，均取得良好療效，無任何副作用。穩(wěn)心草可以治療各種心臟病、心腦血管病、腦栓梗塞病、肺、肝、胃、腎、膽病及糖尿病、前列腺病、白血病等各種癌癥等，一般用藥后均可在1～3個(gè)月治愈，且不出現(xiàn)反復(fù)。經(jīng)試驗(yàn)和研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)心草并非是包治百病的神藥，只因其具有貫通氣血、固本扶正和治本清源的獨(dú)特功效，才使其具有可以醫(yī)治百病的神奇療效。相信以穩(wěn)心草固本清源的獨(dú)特療效和未來更加深入的科學(xué)研究，一定會(huì)開發(fā)成為一種可以突破和醫(yī)治包括艾滋病在內(nèi)的嚴(yán)重威脅人類生命疾病的一種全新概念的、純天然生態(tài)化的、無任何毒副作用和依賴性的，能夠極大的提高人類生命質(zhì)量和壽命的全科藥物。
為了更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，下面通過對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述，詳細(xì)說明但不限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)材料，如無特別說明，均為市售產(chǎn)品。
穩(wěn)心草的快速繁殖及種植方法實(shí)施例11、種子采集穩(wěn)心草每年8～9月份種子成熟，這時(shí)在內(nèi)蒙古呼倫貝爾選擇高而粗壯的植株，采摘其苞果，掰開苞果將里面的種子倒入密封的瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆谩?br> 2、催芽培養(yǎng)挑選籽粒飽滿的種子，先用70％酒精漂洗消毒，然后用40～50℃的溫水浸泡24小時(shí)，在顯微鏡下可見種子濕潤(rùn)膨大，這時(shí)撈出放入瓶?jī)?nèi)置溫度26～28℃，相對(duì)濕度70～80％恒溫箱培養(yǎng)3天左右，在顯微鏡下可見種子尖部生出白色小芽，出芽率為65％以上。
3、播種繁育挖取山上雜木林蔭地表10厘米以下腐殖土作基質(zhì)，放入40×40×20厘米種植培養(yǎng)盤內(nèi)，pH值自然，不作滅菌處理，以保持自然營(yíng)養(yǎng)成分和利于生命力強(qiáng)的種子長(zhǎng)出。將經(jīng)催芽培養(yǎng)的種子按3×3×3厘米的品字形點(diǎn)種，深度0.5厘米左右，然后置無直射光的培養(yǎng)室架上培養(yǎng)，溫度25℃左右，相對(duì)濕度60～70％，經(jīng)5天左右出苗，25～30天左右株高長(zhǎng)至15～20厘米，這時(shí)就可以用于莖尖組織培養(yǎng)。
4、外植體準(zhǔn)備將用于組織培養(yǎng)的外植體，即催芽播種繁育出的穩(wěn)心草幼苗(也可取自然生長(zhǎng)的嫩莖)，用無菌水洗凈表面，在70％酒精中浸泡8～12秒(或用70％酒精擦拭)，在上超凈臺(tái)后，在0.1％的氧化汞溶液中消毒3～5分鐘，用無菌水沖洗3～4次，然后在無菌條件下接種在培養(yǎng)基上。
5、初級(jí)培養(yǎng)從經(jīng)消毒處理的外植體切取2～3厘米帶頂芽的莖段在無菌條件下接種在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溫度26～28℃，相對(duì)濕度60～70％，每天日光燈或散射光照12小時(shí)，光照度約為1500～2000lx。經(jīng)20天左右從芽的基部分化出3～5個(gè)叢生芽，同時(shí)在芽基部周圍可出現(xiàn)愈傷組織。這時(shí)將愈傷組織切下來接種在新的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)15天左右可分化出叢生芽。叢生芽的誘導(dǎo)率約為85％以上，愈傷組織的誘導(dǎo)率為60％以上。
6、增殖培養(yǎng)將叢生芽切下來接種至MS培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，溫度26～28℃，相對(duì)濕度60～70％，每天日光燈或散射光照12小時(shí)，光照度約為1500～2000lx。經(jīng)15天左右增殖分化出5～6倍叢生芽。
7、生根培養(yǎng)當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至3～5厘米時(shí)單株切下，接種至MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，溫度26～28℃，相對(duì)濕度60～70％，每天日光燈和散射光照12小時(shí)，光照度約為1500～2000lx。經(jīng)10天左右即可長(zhǎng)出根系，生根率為95％以上，20天左右根系發(fā)達(dá)，植株生長(zhǎng)健壯。
8、馴化培養(yǎng)將生根培養(yǎng)的植株移栽至以自然腐殖土作基質(zhì)的種植培養(yǎng)盤內(nèi)，行間距15×15厘米，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～60％，散射日光照，經(jīng)20天左右馴化培養(yǎng)后，即可向室外種植地移栽種植。
9、移栽種植每年5月中旬至8月末無霜期內(nèi)均可進(jìn)行移栽。移栽地宜選擇腐殖質(zhì)多的草地或雜木林地，土地不需作翻耕和除草處理，因?yàn)榉€(wěn)心草具有在和其它植物共生條件下轉(zhuǎn)化吸收各種營(yíng)養(yǎng)成分的生物特性，同時(shí)其它植物可起到遮陽和保持蔭濕環(huán)境的作用。
移栽時(shí)按行間距40×40厘米，挖8×10厘米的坑穴，將連帶培養(yǎng)土的苗栽種至坑穴內(nèi)，然后培土踏實(shí)并一次性澆透水即可。穩(wěn)心草的移栽成活率為90％以上，移栽后穩(wěn)心草植株生長(zhǎng)健壯。
10、種植地保管穩(wěn)心草喜在蔭濕環(huán)境生長(zhǎng)，因而種植地要做好遮陽和保濕管理，有條件的可搭架遮陽和鋪設(shè)噴灌設(shè)施，還可在種植地按東西向間距30米左右栽種速生楊等林木，以增強(qiáng)抗風(fēng)、遮陽和保濕等自然調(diào)節(jié)能力，同時(shí)還要加強(qiáng)防范牲畜踐踏和采食以及春秋兩季防火等管防工作。
11、收獲穩(wěn)心草每年9月份霜凍后生長(zhǎng)期結(jié)束，收獲后可在立秋后20天左右進(jìn)行。收獲時(shí)用鐮刀從穩(wěn)心草貼根處割下，然后打成捆裝入透氣性好的袋中，防止草葉或枝杈掉失，運(yùn)回后要放置在蔭涼通風(fēng)層架上保管，以防霉變。
12、加工加工時(shí)先將雜草挑出，再用粉碎機(jī)粉碎成末后裝入密封的容器內(nèi)，以備深加工成為各種溶液劑、注射劑、沖劑、片劑、膠囊、丸及酊劑等藥品和從中提取藥效成分及加工成為其它功能性產(chǎn)品時(shí)使用。
實(shí)施例2在實(shí)施例1的步驟5中，所用的培養(yǎng)基為MS+BA 0.3mg/L+NAA0.4mg/L；步驟6中，所用的培養(yǎng)基為MS+BA2.5mg/L+NAA 0.2mg/L；步驟7中，所用的培養(yǎng)基為MS+IAA 0.5mg/L；其它同實(shí)施例1。叢生芽的誘導(dǎo)率約為90％以上，愈傷組織的誘導(dǎo)率為55％以上，生根率為90％以上。
實(shí)施例3在實(shí)施例1的步驟5中，所用的培養(yǎng)基為N6+4-D 0.1mg/L；步驟6中，所用的培養(yǎng)基為N6+KT 1.5mg/L+IBA 0.1mg/L；步驟7中，所用的培養(yǎng)基為1/2MS；其它同實(shí)施例1。叢生芽的誘導(dǎo)率約為70％左右，愈傷組織的誘導(dǎo)率為40％左右，生根率為75％左右。
本發(fā)明所用組織培養(yǎng)基的制備實(shí)施例4MS培養(yǎng)基的配制1、培養(yǎng)基稱取稱取硝酸銨(NH4NO3)1650mg、硝酸鉀(KNO3)1900mg、氯化鈣(CaCl2·2H2O)440mg、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)370mg、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170mg、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)37.3mg、碘化鉀(KI)0.83mg、硼酸(H3BO3)6.2mg、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)8.6mg、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.25mg、硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.025mg、氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.025mg、肌醇100mg、煙酸0.5mg、甘氨酸2mg、鹽酸硫胺素0.1mg、鹽酸吡哆酸0.5mg、蔗糖30000mg、瓊脂7000mg。
2、培養(yǎng)基的配制將稱取的MS培養(yǎng)基原料加入裝有蒸餾水的容器中，適當(dāng)加溫使之充分溶解，然后倒入1L容量瓶?jī)?nèi)用蒸餾水定容。稱取10g瓊脂放鍋內(nèi)加500ml蒸餾水，加溫使瓊脂充分溶解再加入30g蔗糖攪勻，趁熱倒入1L容量瓶?jī)?nèi)用蒸餾水定容。將調(diào)配號(hào)的MS培養(yǎng)基液與瓊脂溶液混合攪拌均勻，用氫氧化鈉40g溶液調(diào)整pH值至6.5，滅菌后pH值至6。然后分裝至50ml容器內(nèi)，裝量為20ml左右，用錫箔紙封好瓶口。
3、滅菌將分裝好的培養(yǎng)基放入高壓鍋中滅菌，壓強(qiáng)1.05Mpa，溫度121℃，當(dāng)鍋內(nèi)壓力到0.5Mpa時(shí)打開放氣閥放出冷氣，以保證鍋內(nèi)上下溫度一致充分滅菌，當(dāng)壓力升至1.05Mpa時(shí)計(jì)時(shí)滅菌15分鐘。取出滅菌后的培養(yǎng)基要及時(shí)用皮套系緊，放試驗(yàn)臺(tái)上冷卻凝固備用。
實(shí)施例5N6培養(yǎng)基的配制1、培養(yǎng)基稱取稱取硝酸鉀(KNO3)2830mg、硫酸銨((NH4)2SO4)463mg、氯化鈣(CaCl2·2H2O)166mg、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)185mg、磷酸二氫鉀(KH2PO4)400mg、硫酸錳(MnSO4·4H2O)4.4mg、硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)1.6mg、硼酸(H3BO3)0.8mg、碘化鉀(KI)1.6mg、甘氨酸2mg、煙酸0.5mg、鹽酸硫胺素(維B1)1.0mg、鹽酸吡哆素(維B6)0.5mg、蔗糖50000mg、瓊脂10000mg、硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)27.8mg。
N6培養(yǎng)基的配制方法與滅菌方法參見實(shí)施例4。
以上對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)心草的種植方法，其特征在于，包括下述步驟A1、將采自內(nèi)蒙古的穩(wěn)心草種子種在作為基質(zhì)的腐殖質(zhì)土中，無直射光照，直至長(zhǎng)出能夠用于莖尖組織培養(yǎng)的穩(wěn)心草幼苗，作為穩(wěn)心草外植體；或者選取自然生長(zhǎng)的穩(wěn)心草嫩莖，作為穩(wěn)心草外植體；A2、從經(jīng)消毒處理的穩(wěn)心草外植體上切取莖尖，接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至分化出叢生芽；或者從經(jīng)消毒處理的穩(wěn)心草外植體上切取莖尖，接種在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至在芽基部周圍形成愈傷組織，將愈傷組織切下來接種在分化培養(yǎng)基上，直至分化出叢生芽；A3、當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至3～5厘米時(shí)單株切下，接種至生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出根系，得到穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗；A4、將由步驟A3得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗向室外種植地進(jìn)行移栽種植，移栽時(shí)按行間距20～60厘米，移栽在每年的無霜期內(nèi)進(jìn)行，種植地為腐殖質(zhì)多的草地或雜木林地，作遮陽和保濕管理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟A1中，溫度為20～30℃，相對(duì)濕度為60～80％；在步驟A2中，溫度為24～28℃，相對(duì)濕度為60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，用于光照的光源為日光燈或散射日光；在步驟A3中，溫度為24～28℃，相對(duì)濕度為60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，用于光照的光源為日光燈或散射日光。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟A1中，所述能夠用于莖尖組織培養(yǎng)的穩(wěn)心草幼苗高度為15～20厘米；在步驟A2中，所述從穩(wěn)心草外植體上切取的莖尖長(zhǎng)度為2～3厘米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟A2和A3中，所述分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的pH值均為5～6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟A2中，對(duì)所述穩(wěn)心草外植體的消毒處理步驟為用無菌水洗凈用于組織培養(yǎng)的外植體表面，再用70％酒精消毒8～30秒，在上超凈臺(tái)后用0.1％氧化汞作表面消毒3～5分鐘，再用無菌水清洗3～5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟A2后，進(jìn)一步包括下述步驟將叢生芽切下來接種至增殖培養(yǎng)基上，溫度24～28℃，相對(duì)濕度60～80％，光照時(shí)間為10～12小時(shí)/天，光強(qiáng)度為1000～2000lx，直至增殖分化出叢生芽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述增殖培養(yǎng)基的pH值為5～6。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述穩(wěn)心草的種子通過下述步驟首先進(jìn)行催芽培養(yǎng)處理將經(jīng)消毒的種子用40～50℃的溫水浸泡15～30小時(shí)，然后取出種子，溫度24～28℃，相對(duì)濕度70～80％，培養(yǎng)2～4天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在將穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗進(jìn)行移栽種植前，進(jìn)行如下步驟將由步驟A3得到的穩(wěn)心草組織培養(yǎng)苗移栽至以自然腐殖土質(zhì)作為基質(zhì)的種植培養(yǎng)盤內(nèi)，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～60％，散射日光照，馴化培養(yǎng)15～25天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟A4中，移栽時(shí)，將連帶培養(yǎng)土的苗栽種至坑穴內(nèi)，然后培土踏實(shí)并一次性澆透水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種草本藥用植物穩(wěn)心草的種植方法和快速繁殖方法，通過選擇不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，經(jīng)過催芽培養(yǎng)、播種繁育、莖尖組織培養(yǎng)、移栽種植，并通過控制溫度、相對(duì)濕度、移栽種植及管護(hù)等，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)心草的人工繁殖種植。本發(fā)明不僅能夠挽救草本藥用植物穩(wěn)心草這一珍奇物種，而且為人類提供一種可以加工生產(chǎn)成多種醫(yī)療藥品和從中提取藥效成分并加工成為其它功能性產(chǎn)品的原料資源。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1723769SQ200510012229
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月20日
發(fā)明者方在吉 申請(qǐng)人:方在吉