專利名稱：包含生理活性物質(zhì)的乳化溶液及其制備方法和給藥方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種利用脂肪球吸收作用(oil globule absorption action)給予動物口服藥品的技術(shù)，所述脂肪球吸收作用通過本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)表的報道而新近知名。更具體地，本發(fā)明是關(guān)于一種包含生理活性物質(zhì)(physiologically active material)的新型乳劑及其制備方法和給藥方法，開發(fā)該乳劑以適合特定動物消化道中脂肪球吸收作用的有效利用。
背景技術(shù)：
從古至今，為了預(yù)防哺乳動物如人、兔、鼠及家畜的特定疾病，有時建議給予對抗有關(guān)疾病的疫苗或免疫激活劑(immune activator)的方法。近來，除給予水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疫苗和具有藥理作用的物質(zhì)外，越來越多預(yù)防/治療所述疾病的試驗還通過給予多種生理活性物質(zhì)進行。
傳統(tǒng)上對除人以外的哺乳動物進行的血管注射(靜脈內(nèi)注射)為一種給藥方法，使用該給藥方法在理論上能預(yù)期到極好的效果，但是存在使有機體遭受一定程度外科入侵應(yīng)激反應(yīng)(surgical invasion stress)的缺點；此外上述的方法不容易對魚類、甲殼類和貝類動物應(yīng)用。
結(jié)果口服給藥方法成為給予魚類、甲殼類和貝類動物生理活性物質(zhì)的主要方法。由于上述原因，設(shè)計口服制劑時，考慮到要給予的一種或多種生理活性物質(zhì)及結(jié)合使用的各助劑具有不同的親和性(親水的或疏水的)的事實，并且同時考慮口服制劑的穩(wěn)定性，目前已研究多種乳劑制劑形式。
例如日本特開平11-255664公開了一項技術(shù)，其中分子量低于10000的肽聚糖(peptidoglycan)作為口服給藥免疫增強劑的有效成分，以肽聚糖本身或添加了肽聚糖的飼料的形式，給予哺乳動物、魚類和甲殼類動物(特別是黑虎蝦(Black Tiger shrimp))。
此外，日本特開平8-504811公開了一種生理可接受的藥物輸送乳劑，該乳劑包括含氟化合物(特別是全氟化碳(perfluorocarbon)如全氟萘烷(perfluorodecalin))和水包油(oil in water)的乳化粒子、表面活性劑和溶解在該乳劑中的藥物。
更確切地說，從上述兩種專利文獻中可得出一種乳劑系統(tǒng)，其中至多30重量％的液態(tài)脂肪油如甘油三酯作為基質(zhì)，至多75重量％的氟代化合物和至多20重量％的藥物溶液通過表面活性劑的作用進行分散。
同時，日本特開平7-53404公開了一種親脂-親水混合物，其中抗原物質(zhì)和一種佐劑呈親脂性，并且另外一種佐劑側(cè)(side)呈親水性。特別地，在油包水乳劑中，分散體(水滴，30重量％)通過含有在分散介質(zhì)中的乳化劑(油的70重量％)作為基質(zhì)，包含所述抗原物質(zhì)和佐劑。
然而，口服給予生理活性物質(zhì)時，以前已經(jīng)認識到的常規(guī)問題為所述生理活性物質(zhì)的給藥功效不能得到充分表現(xiàn)。例如，從上述日本特開平11-255664可以看出，該專利指出生理活性物質(zhì)的口服給藥不能在魚類中發(fā)揮充分功效。這是因為，雖然所述原因沒有得到充分闡明，但是當用與血管注射不同的口服給藥時，可能由于所述材料通過消化道吸收，因此認為與生理活性材料在吸收前被消化，或者不能在消化道里得到充分吸收有關(guān)。也就是說，一般意義上講，油(脂肪)被降解成脂肪酸和甘油，并在動物消化道內(nèi)以分子水平被吸收。
然而，本發(fā)明的發(fā)明人在魚類等的消化道中發(fā)現(xiàn)了一種令人驚奇的脂肪球吸收作用，即非常細小的脂肪球被體內(nèi)腸道上皮細胞以其本身形式被吸收，并且公開于Miyazaki等人題為《Histological study on egg yolk absorptionand nutrient intake in a digestive tract of Fry and Juvenile Pagrus major or Girellapunctata》的論文中，the First Report I，15-27頁(1998)，F(xiàn)aculty ofBioresources，Mie University，Japan。此外還發(fā)現(xiàn)新的事實同樣類型的脂肪球吸收作用也出現(xiàn)在某些哺乳動物中。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的發(fā)明人基于如下想法做出了本發(fā)明利用所述脂肪球吸收作用可能使構(gòu)建口服藥物輸送方式成為可能，由此疫苗、免疫激活劑和藥理活性物質(zhì)可以被動物以一種簡單化的方式非常高效地吸收。
其中，所述想法具有兩個基本必要條件其一，應(yīng)用的對象應(yīng)當限于在其消化道中證實有脂肪球吸收作用的動物；其二，口服給予相關(guān)動物的細小脂肪球應(yīng)當具有預(yù)先確定的粒子直徑，以使脂肪球吸收作用能夠發(fā)生。包括上述日本專利公開的現(xiàn)有技術(shù)都沒有公開和考慮所述必要條件。
此外，即使本發(fā)明發(fā)明人的上述日本文獻報道了脂肪球吸收作用，也沒有提及脂肪球吸收作用可用于口服藥物輸送方式，并且沒有明確的實現(xiàn)方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了一種包含生理活性物質(zhì)的水包油乳劑，其中，細脂肪球作為動物消化道中脂肪球吸收作用靶標分散在所述乳劑中；所述生理活性物質(zhì)包含在其中分散有細脂肪球的乳劑的油滴中；并且所述生理活性物質(zhì)通過細脂肪球中存在的油溶性乳化劑的作用，以其本身或與少量水一起的非常細的分散相形式包埋于油相中。
根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供了一種包含生理活性物質(zhì)的水包油乳劑，其中，細脂肪球作為動物消化道中脂肪球吸收作用靶標分散在乳劑中；所述生理活性物質(zhì)包含在其中分散有細脂肪球的乳劑的油滴中；并且所述生理活性物質(zhì)親脂性地溶解或懸浮于細脂肪球中。
根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供了一種包含生理活性物質(zhì)的水包油乳劑，其中，細脂肪球作為動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用靶標分散在所述乳劑中；所述生理活性物質(zhì)包含在其中分散有細脂肪球的乳劑的油滴中；并且所述生理活性物質(zhì)以封入細脂肪球內(nèi)的形式存在，所述細脂肪球具有由脂質(zhì)雙分子層形成的膠團結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，提供了一種包含生理活性物質(zhì)的乳劑的制備方法，該方法包括將生理活性物質(zhì)、生理活性物質(zhì)的水溶液或生理活性物質(zhì)的水懸浮液與添加有油溶性乳化劑的乳劑混合并乳化，以制備油性乳化相；并且將所述油性乳化相與加入到其中的含有水溶性乳化劑的水混合并乳化，以制備水包油乳劑，在該乳劑中油性乳化相在水中分散成作為動物消化道中脂肪球吸收作用靶標的細脂肪球。
根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，提供了一種給予包含生理活性物質(zhì)的乳劑的方法，該方法包括給動物口服包含生理活性物質(zhì)并且其中分散有細脂肪球的乳劑，其中制備所述細脂肪球，以便乳劑的油滴中包含生理活性物質(zhì)，并且與此同時，所述細脂肪球成為動物消化道中脂肪球吸收作用的靶標。
根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，提供了一種給予包含生理活性物質(zhì)的乳劑的方法，該方法包括將包含生理活性物質(zhì)并且其中分散有細脂肪球的乳劑含浸到飼料或飼料顆粒中；并且使動物攝取所述含浸的物質(zhì)，其中，制備所述細脂肪球，以便乳劑的油滴中包含生理活性物質(zhì)，并且與此同時，所述細脂肪球成為動物消化道中脂肪球吸收作用的靶標。
具體實施例方式
現(xiàn)在描述完成本發(fā)明第一至第六方面的具體實施方式
，包括最佳方式。
包含生理活性物質(zhì)的乳劑根據(jù)本發(fā)明第一至第三個方面，與所述包含生理活性物質(zhì)的乳劑有關(guān)，在水包油乳劑中分散有平均直徑適合于動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用的細脂肪球，所述生理活性物質(zhì)通過油溶性乳化劑作用，以其本身或與少量水一起的非常細的分散相形式在各細脂肪球中包埋于油相中。
在細脂肪球中，非常細的生理活性物質(zhì)(或生理活性物質(zhì)和少量水之間)分散相以將油溶性乳化劑保持與分散體的界面上的狀態(tài)穩(wěn)定地分散在作為分散體的脂肪球油相中。并且，各細脂肪球穩(wěn)定分散于作為分散體的水中，同時將水溶性乳化劑保持在與分散體(水)的界面上。
由于所述包含生理活性物質(zhì)的乳劑為水包油型，細脂肪球作為油滴的分散狀態(tài)穩(wěn)定，并且由于細脂肪球的平均粒子直徑適合作為動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用的靶標，因而可以利用感興趣動物消化道內(nèi)的脂肪球吸收作用，并且可以在動物體內(nèi)高效攝入。此外，通過油溶性乳化劑在細脂肪球中的作用，生理活性物質(zhì)本身或者與少量水一起形成非常細的分散相，這樣被包埋到油相中。因此對于動物腸道內(nèi)的脂肪酶接受作用(receiving action)，雖然部分細脂肪球表面被消化，但是與膠團結(jié)構(gòu)不同，細脂肪球的粒子結(jié)構(gòu)仍然維持沒有瓦解，因此有利于通過腸上皮細胞吸收。另外，由于生理活性物質(zhì)通過油溶性乳化劑的作用分散于油中，因此不管它們的親和性(親水性或親脂性)如何，它們能以非常細微的分散狀態(tài)包埋在脂肪球中，此外很容易制備具有預(yù)先確定的細平均粒子直徑的脂肪球。
更具體地，可以使用任何生理活性物質(zhì)，只要它們的親和性為水溶性、親水性、油溶性和親脂性。優(yōu)選作為上位概念分類，生理活性物質(zhì)可以是選自疫苗、免疫激活劑、營養(yǎng)物質(zhì)、藥理活性物質(zhì)、天然色素和礦物所組成的組中的至少一種。例如，所述物質(zhì)可以得自疫苗例如病原病毒、或者細菌或寄生蟲的粉碎物質(zhì)，以及免疫激活劑如葡聚糖、巖藻依聚糖(fucoidan)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。此外還可能應(yīng)用生理活性多肽例如抗體，營養(yǎng)物質(zhì)如維生素，或藥理活性物質(zhì)如抗生素、激素和干擾素。為了賦予感興趣的動物所需的顏色，還可能利用天然色素或礦物如有機或無機的鈣、鐵和鎂。
同時，在包含生理活性物質(zhì)的乳劑中所含的細脂肪球的特征在于，所述生理活性物質(zhì)通過油溶性乳化劑的作用，在細脂肪球中形成非常細的分散相(即被包埋在油相中)。同樣，由于生理活性物質(zhì)本身或與少量水一起分散得非常精細，生理活性物質(zhì)在細分散相中的濃度即使不是100％，也非常高，并且因此藥物的崩解效果也顯著增強。
基于上述特征的比較，(1)的結(jié)構(gòu)為本發(fā)明的發(fā)明人創(chuàng)造的粒子結(jié)構(gòu)，用于有效實現(xiàn)第一發(fā)明，并且其詳細的描述在第七發(fā)明中討論，但是甚至動物腸脂肪酶不能瓦解細脂肪球的粒子結(jié)構(gòu)，并且，進一步地，不管它們的親和性如何，生理活性物質(zhì)可能非常細地分散在脂肪球中。
同時，雖然適合于脂肪球吸收作用的細脂肪球的平均粒子直徑不能相對于感興趣動物的種類而統(tǒng)一確定，但是優(yōu)選在1-60微米范圍內(nèi)，更優(yōu)選1-20微米。也不可能明確限定脂肪球的粒度分布(各種細脂肪球的粒子直徑等級)，但是在上述平均粒子直徑范圍內(nèi)，粒度分布越窄越理想。
此外，如果細脂肪球在適合脂肪球吸收作用范圍內(nèi)，無需限定具體的粒子結(jié)構(gòu)，但是下列三種粒子結(jié)構(gòu)可以更理想地舉例說明(1)生理活性物質(zhì)本身或與少量水一起通過油溶性乳化劑，在細脂肪球中形成非常細的分散相；(2)親脂性生理活性物質(zhì)溶解或懸浮于細脂肪球中；(3)細脂肪球具有由脂質(zhì)雙分子層形成的膠團結(jié)構(gòu)，并且將生理活性物質(zhì)置于其內(nèi)部。
三者之中，第二種結(jié)構(gòu)通過在乳劑中溶解或精細懸浮生理活性物質(zhì)并通過使用所得的乳劑和水(優(yōu)選再使用乳化劑)制得，組成水包油乳劑。
第三種結(jié)構(gòu)是由脂質(zhì)雙分子層在水中形成的膠團結(jié)構(gòu)構(gòu)造(生理活性物質(zhì)的水溶液置于膠團結(jié)構(gòu)內(nèi))。制備第二種和第三種粒子結(jié)構(gòu)，或制備具有所述粒子結(jié)構(gòu)分散其中的包含細脂肪球的乳劑可以用選自己知或公知的適合方法很容易地完成。
雖然沒有限制作為脂肪球吸收作用靶標的脂肪球的種類或粒子結(jié)構(gòu)，但是例如結(jié)構(gòu)(1)至(3)有代表性的舉例說明了能夠預(yù)期的脂肪球分散穩(wěn)定性。根據(jù)粒子結(jié)構(gòu)(1)至(3)的相對評價，第三種結(jié)構(gòu)具有一般稱為核糖體的囊泡粒子結(jié)構(gòu)，但是當限定的膜(脂質(zhì)雙分子層)通過動物消化道的脂肪酶的作用瓦解時，存在所述結(jié)構(gòu)不能維持脂肪球結(jié)構(gòu)和脂肪球吸收作用不能被應(yīng)用的缺點。在第二種結(jié)構(gòu)的情況下，由于它是脂肪球(油球)，所述脂肪球結(jié)構(gòu)不容易被脂肪酶作用瓦解，但是缺點在于除了油溶性生理活性物質(zhì)溶解在脂肪球中的情況，該結(jié)構(gòu)通常很難精細地將生理活性物質(zhì)分散在脂肪球中，此外很難構(gòu)建具有預(yù)先確定的平均粒子直徑的細脂肪球。
現(xiàn)在，在能夠提供所述生理活性物質(zhì)的高濃度或精細分散狀態(tài)的包含生理活性物質(zhì)的乳劑之中，制備第一種粒子結(jié)構(gòu)的方法將得到詳細描述。
制備包含生理活性物質(zhì)的乳劑的方法主要包括第一乳化步驟和第二乳化步驟，假設(shè)除第一和第二步驟外可以加入任何可選擇的預(yù)處理步驟、中間步驟或后處理(post-treatment)步驟。
在第一乳化步驟中，將生理活性物質(zhì)、生理活性物質(zhì)的水溶液或生理活性物質(zhì)的水性懸浮液與添加有油溶性乳化劑的乳劑混合并乳化，以制備包埋到油相中的油性乳化相。即根據(jù)第一乳化步驟，制備所述油性乳化相，其中生理活性物質(zhì)以其本身或與少量水一起的非常細的分散相形式包埋于油相。
同時，當所述生理活性物質(zhì)用作其水溶液或水性懸浮液時，在第一乳化步驟中，優(yōu)選使水含量最小化(即生理活性物質(zhì)的高濃度水溶液或高密度水性懸浮液)。
此外，第一乳化步驟的重要技術(shù)點在于生理活性物質(zhì)及其水溶液(相a)通過與添加有油溶性乳化劑的乳劑(相b)混合而乳化。這里，相a和相b的混合比例無需統(tǒng)一限定，但是該比例可以在相a與相b的重量比為1∶99至99∶1的范圍內(nèi)任選。如果相a與相b的重量比超出上述范圍或相b中不加入油溶性乳化劑，可能制備不出如上所述包埋生理活性物質(zhì)的細脂肪球。這里，加入相b的油溶性乳化劑的量優(yōu)選在1-5重量％范圍內(nèi)。
雖然對油溶性乳化劑的種類沒有特別的限制，只要它們不造成與毒性和生理安全有關(guān)的問題即可，但是優(yōu)選親水親油平衡(Hydrophilic LipophilicBalance，HLB)值小于6的油溶性乳化劑，更優(yōu)選小于2的油溶性乳化劑。另外，所述乳化劑優(yōu)選為非離子表面活性劑。
作為滿足所述條件的優(yōu)選油溶性乳化劑，可以由六甘油基亞油酸酯(hexaglyceryllinoleate)、聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylenelaurylether)、卵磷脂和聚氧乙烯油醚(polyoxyethyleneoleylether)制得。
在第二乳化步驟中，將在第一乳化步驟所得的油性乳化相與添加有水溶性乳化劑的水混合并乳化，以制備水包油乳劑，由此所述油性乳化相具有適合動物消化道脂肪球吸收作用靶標的平均粒子直徑，并且作為細脂肪球分散在水中。
第二乳化步驟中的技術(shù)點在于添加有水溶性乳化劑的水(相d)與第一乳化步驟制備的油性乳化相(相c)混合并乳化。這里，相c和相d的混合比例無需指定，但是該比例可以在相c與相d的重量比為3∶1至1∶3的范圍內(nèi)任選。
如果相c與相d的重量比超出上述范圍或相d中不加入水溶性乳化劑，可能制備不出涉及本發(fā)明的含有生理活性物質(zhì)的乳劑。這里，加入相d的水溶性乳化劑的量優(yōu)選在0.5-1.3重量％范圍內(nèi)。
雖然對水溶性乳化劑的種類沒有特別的限制，只要它們不造成與毒性和生理安全有關(guān)的問題即可，優(yōu)選親水親油平衡(Hydrophilic LipophilicBalance，HLB)值大于10的水溶性乳化劑，更優(yōu)選大于12的水溶性乳化劑。另外，關(guān)于乳化劑類型，如上所述，優(yōu)選非離子表面活性劑。作為滿足所述條件的理想的水溶性乳化劑，可以由十甘油二硬脂酸酯(decaglyceryldi-stearate)、甘油異硬脂酸酯(glyceryl isostearate)、十甘油單異硬脂酸酯(decaglyceryl monoisostearate)和乙二醇單油酸酯(ethyleneglycolmonooleate)制得。
在第一和第二乳化步驟中，乳化操作可以通過使用公知的超聲波處理、均質(zhì)器或攪拌器完成。在乳化操作中，包含生理活性物質(zhì)的乳劑中的細脂肪球粒子直徑和所述生理活性物質(zhì)在細脂肪球中的精細分散程度可以通過適當選擇乳化方法的操作條件進行調(diào)整。
同時，如上所述，首先將所述生理活性物質(zhì)或其水溶液與乳劑混合，然后向所得的乳劑中加入所述油溶性乳化劑，以形成油性乳化相，其中，通過利用公知的乳劑形成方法如超聲波處理和應(yīng)用均質(zhì)器，生理活性物質(zhì)以其本身或與少量水一起的非常精細分散相的形式包埋于油相中。
生理活性物質(zhì)的給藥方法在與本發(fā)明有關(guān)的生理活性物質(zhì)的給藥方法中，制備細脂肪球，其中水包油乳劑中的油滴包含生理活性物質(zhì)，同時細脂肪球具有適合動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用靶標的平均粒子直徑，并且將所得乳劑口服給予除人以外消化道表現(xiàn)脂肪球吸收作用的動物。
就此而論，假設(shè)這里用到的各種物質(zhì)應(yīng)當都是對實驗動物無毒的或生理安全的。所述物質(zhì)例如構(gòu)建油滴的乳劑、用于形成乳劑的表面活性劑(用于制備上述包含生理活性物質(zhì)的乳劑的油溶性乳化劑和水溶性乳化劑)或飼料小球。此外，優(yōu)選使用在營養(yǎng)上對實驗動物有益的物質(zhì)。
在與本發(fā)明有關(guān)的生理活性物質(zhì)的給藥方法中，無需具體限定水包油乳劑的口服給藥方法。例如，可以使用注射器將所述生理活性物質(zhì)注射到口腔中，并且在哺乳動物情況下，溶液自身就可以被吸收。此外生理活性物質(zhì)可以混入并且吸進動物飼料中。在這些方法中，更優(yōu)選將生理活性物質(zhì)含浸到動物飼料小球(多孔飼料小球更加理想)中并直接攝取或干燥后攝取。作為飼料小球，各種商業(yè)可供產(chǎn)品均可隨意應(yīng)用。
關(guān)于所述口服給藥方法，沒有由于血管注射除人以外的動物作為給藥對象引起的外科入侵應(yīng)激反應(yīng)(surgical invasion stress)，并且因而很容易對魚類、甲殼類和貝類動物應(yīng)用。
同時，如上所述，通過滿足兩個必要條件，即其一，應(yīng)用的對象限于在其消化道中證實有脂肪球吸收作用的動物；其二，口服給予實驗動物的細脂肪球應(yīng)當具有適于脂肪球吸收作用的預(yù)先確定的粒子直徑，同時通過將生理活性物質(zhì)即所需的藥物輸送材料包含在作為為水包油乳劑的油滴的細脂肪球中，包含生理活性物質(zhì)的細脂肪球在口服給藥的實驗動物的消化道內(nèi)被機體在腸上皮以其自身原有形式吸收，因此能夠避免常規(guī)口服方法表現(xiàn)的弊端所述生理活性物質(zhì)在吸收前被消化，或者在消化道內(nèi)不能充分吸收。因此，生理活性物質(zhì)能以簡單化的方式相當高效地被吸收到動物體內(nèi)。
同時，作為用于與本發(fā)明有關(guān)的生理活性物質(zhì)的給藥方法的實驗動物，優(yōu)選在其消化道中證實有脂肪球吸收作用的動物，即水生動物或除人以外的陸生哺乳動物。
更具體地，在其消化道中證實有脂肪球吸收作用的動物例如可能選自哺乳動物如兔、鼠、狗、貓、牛和豬，不包括人；還可以是鳥類、兩棲類、爬行類、各種魚類包括水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類或觀賞性魚類、貝類和水生甲殼類動物(蝦、蟹)。
現(xiàn)在將參考下列實施例，更加詳細地解釋本發(fā)明。這些實施例只用于解釋本發(fā)明，不應(yīng)當被解釋為是對本發(fā)明范圍和實質(zhì)的限定。
實施例1福爾馬林滅活的細菌大腸桿菌(E.coli)作為生理活性物質(zhì)，處理成包含高密度死菌的水性懸浮液(一液)。同時，在烏賊(cuttlefish)肝油的情況下，加入5重量％作為油溶性乳化劑的六甘油基亞油酸酯(Oxygen Food#818R，Taiyou Chemical Industry Co.，Ltd，Japan)以制備乳液(二液)。
然后，作為第一乳化處理，將一液和二液以重量比90∶10混合，使用超聲波儀進行充分的乳化處理，以形成包埋于油相的油性乳化相(三液)，其中福爾馬林滅活的細菌大腸桿菌高密度懸浮液形成非常精細的分散相。
接著，向水中加入1重量％作為水溶性乳化劑的十甘油二硬脂酸酯(Oxygen Food Q-182S，Taiyou Chemical Industry Co.，Ltd，Japan)(四液)。作為第二乳化處理，將三液和四液以重量比2∶1混合，使用攪拌器充分攪拌，以制備包含生理活性物質(zhì)的乳劑，其中所述油性乳化相作為細脂肪球分散于水中。
據(jù)觀測，制得的包含生理活性物質(zhì)的乳劑中所包括的細脂肪球的粒子直徑大約為5-10微米。制得的包含生理活性物質(zhì)的乳劑在冰箱里保存一周，再次觀測所述細脂肪球的粒子直徑時，其粒子直徑大約為5-10微米。此結(jié)果可以證明細脂肪球的分散狀態(tài)穩(wěn)定。
實施例2在該實施例中，使用福爾馬林滅活的細菌遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarada)，該菌是褐牙鲆(英文名Olive flounder，拉丁名Paralichthys olivaceus)的致病菌。制備濃度為107個細胞/毫升的含有死菌的水性懸浮液(一液)，然后用實施例1中所述同樣的方法制備包含生理活性物質(zhì)的乳劑。
然后，將適量制得的包含生理活性物質(zhì)的乳劑含浸到商購的多孔魚飼料小球中。用所述多孔魚飼料小球連續(xù)飼喂15尾褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)13天，保持乳劑吸收量為10微升/天/100克魚體重。
在吸收期完成后第23天，從5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)的動脈采集血液，然后通過凝集值(agglutination value)測定如此獲得的血清的遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarada)抗體的抗體滴度。
測量結(jié)果見下表1。這里“給藥組”指關(guān)于本實施例的5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，而“對照組”指關(guān)于對比例的5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)。此外，“魚”欄的數(shù)字指給藥組和對照組每組5尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)分別的樣品編號。
表1

除了測量上述凝集值外，關(guān)于本實例在吸收期完成后第23天，15尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)中剩余的10尾肌肉注射活遲鈍愛德華氏菌(注射0.3毫升含有105細胞/毫升的菌液作為激發(fā)量的細菌)，隨后進行14天的培養(yǎng)并評價生存能力。同時，作為對比例，按照與上述相同的方法，10尾沒有喂飼包含生理活性物質(zhì)的乳劑的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉注射活遲鈍愛德華氏菌，隨后進行14天的培養(yǎng)并評價生存能力。
評價結(jié)果見下表2。這里“逝去天數(shù)”欄中的數(shù)字代表活菌注射后的天數(shù)，“給藥組”指關(guān)于本實施例的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，而“對照組”指關(guān)于對比例的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，各個所示的數(shù)字指相應(yīng)天數(shù)死魚的數(shù)量。
表2

從表2可以證實，從注射活菌經(jīng)過的6天中給藥組和對照組都沒有死魚，但是在第14天時間點，相對于對照組中魚全部死亡，給藥組中的死魚總數(shù)為5尾(生存能力50％)。
從上述結(jié)果可以看出與對照組相比，所述給藥組在檢測的抗體滴度和注射活菌后的生存能力方面，都顯示出了極好的結(jié)果。
實施例3本實施例也使用福爾馬林滅活的細菌遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarada)。制備含有濃度為109個細胞/毫升的死菌的水性懸浮液(一液)，然后用實施例1中所述同樣的方法制備二液。
然后，將一液和二液以重量比99∶1混合，使用超聲波儀進行充分的乳化處理，以形成包埋于油相的油性乳化相(組1的三液)，其中福爾馬林滅活的細菌大腸桿菌高密度懸浮液形成非常精細的分散相。此外，將一液和二液以重量比90∶10混合，所得混合物經(jīng)過上述乳化處理以形成油性乳化作用相(組2的三液)。
接著，以與實施例1同樣的方法制備四液。將三液和四液以重量比2∶1混合，所述三液分別為組1的三液和組2的三液，使用攪拌器充分攪拌，以制備包含生理活性物質(zhì)的乳劑([組1的包含生理活性物質(zhì)的乳劑]和[組2的包含生理活性物質(zhì)的乳劑])，其中所述油性乳化作用相作為細脂肪球分散于水中。
之后，將適量制得的組1的包含生理活性物質(zhì)的乳劑和組2的包含生理活性物質(zhì)的乳劑含浸到商購的多孔魚飼料小球中。用所述多孔魚飼料小球連續(xù)飼喂上述的魚13天，保持乳劑吸收量為0.05毫升/天/100克魚體重。使每10尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)(平均體重100克)自由攝食3天。下文中，飼喂組1的包含生理活性物質(zhì)的乳劑的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)命名為“組A”，飼喂組2的包含生理活性物質(zhì)的乳劑的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)命名為“組B”。
之后，關(guān)于組A和組B的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)，在吸收期完成后第23天，通過凝集值(agglutination value)測定獲得的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清的遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarada)抗體的抗體滴度。所得結(jié)果示于下表3的“包埋細菌體的脂肪球給藥組”欄中?！棒~”一欄中的數(shù)字指關(guān)于組A和組B的10尾褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)的樣品編號。
同時，作為對照組，如上所述，使用與實施例3“組A”等量的福爾馬林滅活的細菌遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarada)、烏賊肝油以及油溶性乳化劑，制備簡單混合油溶液。
所述油性溶液不經(jīng)過相應(yīng)的第二乳化處理，因此不包括在關(guān)于本發(fā)明的包含生理活性物質(zhì)的乳劑之內(nèi)。
將所述油溶液含浸到上述多孔小球中并給予10尾褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)，并且測量抗體產(chǎn)物。飼喂所述油溶液的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)作為“組D”。評價結(jié)果見表3中“組D”欄。此外未以任何方式給予福爾馬林滅活的細菌遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarada)和乳劑的10尾正常褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)作為“組C”并且使用相同方法進行抗體產(chǎn)物的評價。評價結(jié)果見表3對照組的欄“組C”。
表3

從表3可以看出，組A和組B中的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)產(chǎn)生了高濃度的遲鈍愛德華氏菌抗體。另外，組C和組D之間的評價結(jié)果幾乎沒有差別，但是可以看出，與組A和組B相比，所述組C和組D的評價結(jié)果顯示出極大差異。
工業(yè)適用性如上所述，免疫激活劑和藥理活性物質(zhì)以及各種生理活性物質(zhì)可以通過簡單的方法被出現(xiàn)脂肪球吸收作用的多種水產(chǎn)養(yǎng)殖或觀賞的魚類和水生甲殼類動物或哺乳動物非常高效地吸收。
雖然為了描述的目的已經(jīng)公開本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解到，在不脫離所附權(quán)利要求書公開的本發(fā)明范圍和實質(zhì)的前提下，可能進行多種改變、添加和替換。
權(quán)利要求
1.一種包含生理活性物質(zhì)的水包油乳劑，其中，細脂肪球作為動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用靶標分散在所述乳劑中；所述生理活性物質(zhì)包含在其中分散有細脂肪球的乳劑的油滴中；并且所述生理活性物質(zhì)通過細脂肪球中存在的油溶性乳化劑的作用，以生理活性物質(zhì)本身或與少量水一起的非常精細的分散相形式包埋在油相中。
2.一種包含生理活性物質(zhì)的水包油乳劑，其中，細脂肪球作為動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用靶標分散在所述乳劑中；所述生理活性物質(zhì)包含在其中分散有細脂肪球的乳劑的油滴中；并且所述生理活性物質(zhì)親脂性地溶解或懸浮在細脂肪球中。
3.一種包含生理活性物質(zhì)的水包油乳劑，其中，細脂肪球作為動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用靶標分散在所述乳劑中；所述生理活性物質(zhì)包含在其中分散有細脂肪球的乳劑的油滴中；并且所述生理活性物質(zhì)以封入細脂肪球內(nèi)的形式存在，所述細脂肪球具有由脂質(zhì)雙分子層形成的膠團結(jié)構(gòu)。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項所述的乳劑，其中，所述細脂肪球的平均粒子直徑在1-60微米的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1-3中任意一項所述的乳劑，其中，所述生理活性物質(zhì)為選自由疫苗、免疫激活劑、營養(yǎng)物質(zhì)、藥理活性物質(zhì)、天然色素和礦物所組成的組中的至少一種。
6.一種包含生理活性物質(zhì)的乳劑的制備方法，該方法包括將生理活性物質(zhì)、生理活性物質(zhì)的水溶液或生理活性物質(zhì)的水性懸浮液與添加有油溶性乳化劑的乳劑混合并乳化，以制備油性乳化相；并且將所述油性乳化相與加入到其中的包含水溶性乳化劑的水混合并乳化，以制備水包油乳劑，在該乳劑中所述油性乳化相在水中分散成作為動物消化道內(nèi)脂肪球吸收作用靶標的細脂肪球。
7.一種給予包含生理活性物質(zhì)的乳劑的方法，該方法包括給動物口服包含生理活性物質(zhì)并且其中分散有細脂肪球的乳劑，其中，制備所述細脂肪球，以便乳劑的油滴中包含生理活性物質(zhì)，并且與此同時，所述細脂肪球成為動物消化道中脂肪球吸收作用的靶標。
8.一種給予包含生理活性物質(zhì)的乳劑的方法，該方法包括將包含生理活性物質(zhì)并且其中分散有細脂肪球的乳劑含浸到飼料或飼料小球中；并且使動物攝取所述含浸的物質(zhì)，其中，制備所述細脂肪球，以便乳劑的油滴中包含生理活性物質(zhì)，并且與此同時，所述細脂肪球成為動物消化道中脂肪球吸收作用的靶標。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述動物為水生動物或陸生哺乳動物。
10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，所述生理活性物質(zhì)為選自由疫苗、免疫激活劑、營養(yǎng)物質(zhì)、藥理活性物質(zhì)、天然色素和礦物所組成的組中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種利用脂肪球吸收作用給予動物口服藥品的技術(shù)，所述脂肪球吸收作用通過本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)表的報道而新近知名。本發(fā)明提供了一種制備包含生理活性物質(zhì)的乳劑的方法，以有效利用特定動物消化道內(nèi)的脂肪球吸收作用，還提供了使用該方法制備的包含生理活性物質(zhì)的乳劑，因而提供了一種口服藥物輸送方法，由此包括免疫激活劑和藥理活性物質(zhì)在內(nèi)的所述生理活性物質(zhì)能通過簡單的方法非常高效地被動物吸收。
文檔編號A23K1/00GK1867319SQ200480030181
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月15日
發(fā)明者宮崎照雄 申請人:第一生物株式會社, 梶野政明, 宮崎照雄