專利名稱：培養(yǎng)微生物的致密培養(yǎng)基的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)微生物的緻密培養(yǎng)基的制備方法，這種培養(yǎng)基以聚丙烯酰胺凝膠為基礎(chǔ)的。
按本發(fā)明方法制備的緻密培養(yǎng)基可用于醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)。
培養(yǎng)微生物的緻密培養(yǎng)基的已知制備方法是通過重量比為15.0～20.0∶0.019～0.132的丙烯酰胺與N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，在有引發(fā)劑存在時(shí)，在生理溶液中進(jìn)行共聚合直到形成凝膠，洗滌，在50～60℃的溫度下，于生理溶液中溶脹16～20小時(shí)，然后用營養(yǎng)基質(zhì)浸潤。
這種緻密的培養(yǎng)基具有近似于瓊脂培養(yǎng)基的緻密性，有彈性并且是透明的。它保證在微生物接種和剝離時(shí)細(xì)菌環(huán)很好地滑動(dòng)而且不損傷其表面，這種良好的滑動(dòng)是通過長時(shí)間的溶脹步驟(16～20小時(shí))而獲得的，這樣，從整體來說實(shí)際上延長了整個(gè)工藝過程。
培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的已知制備方法，包括重量比為0.5～40.0∶2.5～12的丙烯酰胺和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在有引發(fā)劑存在時(shí)，在生理溶液中進(jìn)行共聚合。將所制得的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行洗滌并用營養(yǎng)基質(zhì)浸潤(SU.A.977466)。所說的致密培養(yǎng)基在浸潤、消毒和在微生物接種時(shí)具有高的損傷。用細(xì)菌環(huán)從這種培養(yǎng)基表面上剝離某些種類微生物是有困難的。
上述方法中共聚合工藝是在沒有空氣進(jìn)入的專門的成形設(shè)備中進(jìn)行的，以使在形成聚丙烯酰胺凝膠時(shí)避免出現(xiàn)不光滑的表面，而有礙于在培養(yǎng)基制備中使用。這樣的工藝難以大量制備培養(yǎng)基，例如，在培養(yǎng)皿或其他實(shí)驗(yàn)室器皿中。
本發(fā)明的任務(wù)是提供培養(yǎng)微生物的緻密培養(yǎng)基的制備方法，該方法在共聚合時(shí)使用結(jié)構(gòu)劑，因而保證了培養(yǎng)基在微生物接種時(shí)具有類似于瓊脂培養(yǎng)基的良好的細(xì)菌環(huán)的滑動(dòng)效應(yīng)特性。
任務(wù)是這樣解決的，本發(fā)明推薦的培養(yǎng)微生物的緻密培養(yǎng)基的制備方法包括丙烯酰胺和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在生理溶液中，在有引發(fā)劑存在時(shí)進(jìn)行共聚合，直到形成凝膠，洗滌，并用營養(yǎng)基質(zhì)浸潤凝膠，按照本發(fā)明，其中丙烯酰胺和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚合是在平均分子量為7.2×104的支化聚丙烯酰胺存在時(shí)進(jìn)行的，他們之間的相應(yīng)重量比為7.0～15.0∶0.11～0.21∶0.028～0.11。
本發(fā)明的方法在簡化工藝時(shí)保證培養(yǎng)基有良好的性質(zhì)。由于有結(jié)構(gòu)劑，共聚合易于在空氣中進(jìn)行而不需用特殊裝置。
為了加速共聚反應(yīng)要求使用所說的支化聚丙烯酰胺的水溶液。在浸潤聚丙烯酰胺凝膠時(shí)適于使用含有0.02～0.2克/升的聚氧化乙烯的營養(yǎng)基質(zhì)。在培養(yǎng)基上它促進(jìn)形成表面單層，這保證了在微生物接種時(shí)細(xì)菌環(huán)的滑動(dòng)有很明顯的效果。
根據(jù)本發(fā)明的方法，培養(yǎng)微生物的緻密培養(yǎng)基按以下方法制備。
準(zhǔn)備反應(yīng)混合物，該混合物含有原料單體溶液，分子量為7.2×104的支化聚丙烯酰胺和在生理溶液中的引發(fā)劑溶液?？梢允褂盟f的支化聚丙烯酰胺的水溶液。在反應(yīng)混合物中丙烯酰胺和支化聚丙烯酰胺的比例為7.0～15.0∶0.028～0.11。
作為生理溶液可使用0.5%或0.9%的氯化鈉水溶液，5%葡萄糖水溶液，林格-羅加溶液，漢薩溶液，愛拉溶液(PacTBOPPuHZeP-Лока，ХЗНкСа，ЗРла)和其他。共聚作用在空氣中于培養(yǎng)皿或由不同材料制成的其他容器內(nèi)進(jìn)行。
在上述比例的支化聚丙烯酰胺存在時(shí)進(jìn)行共聚合促使制得的聚丙烯酰胺凝膠具有接近瓊脂培養(yǎng)基的緻密度。此外，使用支化聚丙烯酰胺導(dǎo)致聚丙烯酰胺凝膠的補(bǔ)充結(jié)構(gòu)，這就可能在培養(yǎng)皿中于空氣中聚合時(shí)得到具有平滑表面的凝膠。以前要達(dá)到這種效能只能在使用惰性氣體的專門設(shè)備中于無空氣進(jìn)入情況下進(jìn)行聚合。按本申請的方法在制備培養(yǎng)基的過程中去掉了溶脹凝膠16～20小時(shí)的步驟。
全部上述的優(yōu)點(diǎn)大大簡化了制備培養(yǎng)基的工藝。
聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)洗滌后，用加熱、輻照或化學(xué)方法進(jìn)行消毒。所說凝膠用培養(yǎng)微生物的基質(zhì)浸潤，這可以在消毒之前或之后進(jìn)行。推薦使用含有0.02～0.2的分子量在500000以上的聚氧化乙烯營養(yǎng)基質(zhì)。
基質(zhì)成分取決于微生物和細(xì)胞的具體的組或種的需要。
用一般的研究方法測定培養(yǎng)基的性質(zhì)及研究微生物的生物性質(zhì)。
以下列出實(shí)施本發(fā)明方法的具體實(shí)施例。
例1.
為制備凝膠按以下方法準(zhǔn)備5種溶液A、B、C、D、E(所指的組成量是以100毫升溶液計(jì)算的)。
1.制備溶液A0.5毫升N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMEд)溶解在99.5毫升生理溶液中。
2.制備溶液B0.735克N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MБA)溶解在50毫升生理溶液中，加熱到60℃，加入24.5克丙烯酰胺(AA)，攪拌直到完全溶解，將所得溶液過濾并用生理溶液加到100毫升。
3.制備溶液C0.2克過硫酸銨(ПA)溶解在50毫升生理溶液中，并加到100毫升體積。
4.制備溶液D將10.0克分子量為7.2×104的支化聚丙烯酰胺(PПA)在50～60℃溫度下溶解在50毫升生理溶液中。將溶液體積加到100毫升。
5.制備溶液E將0.5毫升溶液D與99.5毫升溶液C混合，并仔細(xì)攪拌。
由比例A∶B∶E＝1∶2∶4的三種溶液制備反應(yīng)混合物，該比例相當(dāng)于丙烯酰胺，N，N′-亞甲基丙烯酰胺和支化聚丙烯酰胺重量比為7.0∶0.21∶0.028?；旌衔锏谷肱囵B(yǎng)皿中，并置于空氣中。進(jìn)行共聚合10～15分鐘直到形成凝膠，然后用生理溶液洗滌凝膠1小時(shí)。
緻密的培養(yǎng)基是通過使用XOTTuHгeH胰蛋白重煮浸潤所制得的凝膠而制備的。
用金黃色葡萄球菌接種培養(yǎng)基，并在37℃溫度下培養(yǎng)24小時(shí)?？@密培養(yǎng)基具有好的粘附性質(zhì)，緻密性和透明性，彈性，具有平滑的表面，它保證在接種微生物時(shí)細(xì)菌環(huán)有效滑動(dòng)而不損傷表面。生長的微生物呈現(xiàn)出它們特有的培養(yǎng)的及形態(tài)學(xué)上的特征。
例2.
為制備聚丙烯酰胺凝膠使用與例1相同的A、B、C、D溶液。
制備溶液E
將1.0毫升溶液D加到99.0毫升溶液C中，并仔細(xì)攪拌。
反應(yīng)混合物是由按比例A∶B∶E＝1∶2∶4的溶液配制，該比例相當(dāng)于丙烯酰胺、N，N′-亞甲基丙烯酰胺和支化聚丙烯酰胺的重量比為7.0∶0.21∶0.057。將混合物倒入培養(yǎng)皿中，并放置在空氣中聚合。共聚合進(jìn)行5～10分鐘直到形成凝膠，然后將凝膠用生理溶液洗滌1小時(shí)。
所得凝膠用肉-胨湯在56℃溫度下浸潤3小時(shí)，然后消毒30分鐘。
用大腸桿菌接種培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，生長的微生物呈現(xiàn)出它們特有的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)上的特征。緻密的培養(yǎng)基具有良好的粘附性、緻密性、透明性、彈性、具有平滑的表面，保證在微生物接種時(shí)細(xì)菌環(huán)的滑動(dòng)效應(yīng)而不損傷表面。
例3.
為了制備聚丙烯酰胺凝膠按下面的方法準(zhǔn)備A、B、C三種溶液。
1.制備溶液A將0.23毫升N，N，N′，N′-四甲基乙二胺溶解在50毫升生理溶液中并加到100毫升。
2.制備溶液B將0.4克N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺溶解在50毫升生理溶液中，加熱到60℃，加入53克丙烯酰胺，攪拌直到完全溶解。將所得溶液過濾并加到100毫升。
3.溶液C和D的制備同例1。
4.制備溶液E將2毫升溶液D倒入98毫升溶液C中，仔細(xì)攪拌。
由制備好的溶液準(zhǔn)備反應(yīng)混合物，為此將溶液按A∶B∶E＝1∶2∶4的比例混合，這相當(dāng)于丙烯酰胺，N，N′-亞甲基丙烯酰胺和支化聚丙烯酰胺的重量比為15.0∶0.11∶0.11，倒入培養(yǎng)皿。在空氣中進(jìn)行共聚合10～15分鐘直到形成凝膠。所得凝膠用生理溶液洗滌1小時(shí)。用肉-胨湯在50～60℃溫度下將凝膠浸潤3小時(shí)，消毒后接種孢子培養(yǎng)物。
制得的培養(yǎng)基是緻密的，具有良好的粘附性、彈性、緻密性、透明性、平滑表面，用細(xì)菌環(huán)接種微生物時(shí)具有明顯的良好滑動(dòng)效應(yīng)。培養(yǎng)物生長是標(biāo)準(zhǔn)的。
例4.
聚丙烯酰胺凝膠的制備與例1相同，而浸潤是在含有0.2克/升聚氧化乙烯的XuTTuHгeP胰蛋白重煮中于56℃下進(jìn)行3小時(shí)。浸潤過的凝膠消毒30分鐘并接種金黃色葡萄球菌。
所得的緻密培養(yǎng)基具有良好的粘附性，彈性、緻密性、透明性，用細(xì)菌環(huán)接種微生物時(shí)有明顯的滑動(dòng)效應(yīng)而不損傷表面。培養(yǎng)物生長是標(biāo)準(zhǔn)的。
例5.
聚丙烯酰胺凝膠如例3制備，而浸潤是用肉-胨湯(該肉胨湯含有0.02克/升的聚氧化乙烯)在56℃下進(jìn)行3小時(shí)，然后消毒30分鐘。
制得的緻密培養(yǎng)基具有良好的粘附性，彈性、緻密性、透明性，用細(xì)菌環(huán)接種微生物時(shí)有明顯的滑動(dòng)效應(yīng)而不損傷培養(yǎng)基表面。
用大腸桿菌作為試驗(yàn)微生物。
培養(yǎng)物是以標(biāo)準(zhǔn)菌落型生長。
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)微生物的致密培養(yǎng)基的制備方法，包括丙烯酰胺和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在生理溶液中有引發(fā)劑存在時(shí)進(jìn)行共聚合直到形成凝膠，洗滌并用營養(yǎng)基質(zhì)浸潤，其特征在于，丙烯酰胺和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚合是在有平均分子量為7.2×104的支化聚丙烯酰胺存在時(shí)進(jìn)行的，它們相應(yīng)的重量比為7.0～15.0∶0.11～0.21∶0.028～0.11。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用所說聚丙烯酰胺的水溶液。
3.按照權(quán)利要求1-2的方法，其特征在于，浸潤所說的凝膠是用含有0.02～0.2克/升的聚氧化乙烯的營養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行的。
全文摘要
培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的制備方法，包括丙烯酰胺，N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺在有平均分子量為7.2×10
文檔編號C08F220/56GK1030428SQ88106010
公開日1989年1月18日 申請日期1988年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1987年6月25日
發(fā)明者弗拉基米爾·弗拉迪斯拉弗維奇·蓋新斯基, 弗拉基米爾·佩夫洛維奇·新諾包可夫, 尼古拉·尼古拉伊維奇·馬琴科, 萬萊利·格里高利伊維奇·弗伊技柴可夫斯基, 泰地安娜·伊萬諾夫娜·可萊茵尤可娃, 弗拉基米爾·維克多羅維奇·奧尼斯琴科 申請人:包格奠爾茲院士基輔醫(yī)學(xué)院