專利名稱：農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物遺傳育種，尤其涉及一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
任何一種基因轉(zhuǎn)化方法都應(yīng)選擇處于感受態(tài)的細(xì)胞作為受體，這樣才使基因轉(zhuǎn)化的效率有所提高。已有研究認(rèn)為，正在萌發(fā)的花粉管頂部有一個(gè)無細(xì)胞壁的小孔，外源物質(zhì)可以由此被吸收，具有感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)。因此，當(dāng)成熟花粉萌發(fā)起始階段與外源遺傳物質(zhì)DNA相混合時(shí)，外源DNA易被花粉粒吸收，從而成為被外源基因轉(zhuǎn)化的雄配子。當(dāng)轉(zhuǎn)化后的雄配子與雌配子融合后，受精卵細(xì)胞通過分化和發(fā)育過程，形成轉(zhuǎn)基因胚。
由于在植物花粉粒上有許多花粉管萌發(fā)孔，采用適當(dāng)細(xì)胞滲透壓的花粉萌發(fā)培養(yǎng)液，使剛起始萌發(fā)的花粉易被農(nóng)桿菌感染。又由于多數(shù)花粉粒有很多密集的刺狀突起，加Tween-20表面活性劑和抽真空處理，可突破培養(yǎng)液中的水分子在刺狀突起間的表面張力，促進(jìn)農(nóng)桿菌與花粉萌發(fā)孔處花粉管接觸，提高轉(zhuǎn)化效率農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化是目前在轉(zhuǎn)化機(jī)理上比較清楚和在技術(shù)上較為成熟的方法。因此，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的以剛起始萌發(fā)的花粉為受體細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化方法，可獲得轉(zhuǎn)化花粉，將其授粉于雌蕊柱頭上，利用花粉自然受精過程，獲得轉(zhuǎn)化種子。依此技術(shù)路線，一方面可省略傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法所要求的組織培養(yǎng)過程，另一方面具有單細(xì)胞特性的花粉作為轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞可避免農(nóng)桿菌感染多細(xì)胞組織時(shí)存在的轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞間的嵌合現(xiàn)象問題。而且該方法所具有的操作簡(jiǎn)捷，費(fèi)用較低，以及直接得到轉(zhuǎn)化種子等的優(yōu)點(diǎn)，使以花粉作為轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的應(yīng)用前景十分誘人。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法。方法的步驟如下1)、采用花粉人工萌發(fā)的方法，將采集的花粉在花粉萌發(fā)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以蔗糖作為調(diào)節(jié)花粉滲透壓的調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)滲透壓使花粉萌發(fā)；2)、將采集的花粉培養(yǎng)在含有農(nóng)桿菌的花粉萌發(fā)培養(yǎng)液中，加Tween-20的表面活性劑，并抽真空；3)、將經(jīng)農(nóng)桿菌感染處理的花粉及培養(yǎng)液授于已去雄的雌蕊柱頭上，套袋隔離防止其它花粉的污染，獲得轉(zhuǎn)化種子及其植株。
本發(fā)明用根癌農(nóng)桿菌在花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中感染植物花粉的方法，可獲得具有活力的轉(zhuǎn)化花粉，將其授于雌蕊柱頭，完成受精，結(jié)出正常種子，再經(jīng)抗性篩選、分子檢測(cè)和基因表達(dá)驗(yàn)證，獲得轉(zhuǎn)基因植株。本方法的受體是具有單細(xì)胞特性的花粉，不存在多細(xì)胞(組織)受體在轉(zhuǎn)化時(shí)出現(xiàn)的轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞間的嵌合現(xiàn)象，省略了傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法所要求的組織培養(yǎng)過程，也避免了諸如花粉管通道法在轉(zhuǎn)化機(jī)理上的認(rèn)識(shí)問題，轉(zhuǎn)化方法較簡(jiǎn)單和有效。
具體實(shí)施例方式
含有潮霉素抗性基因、GUS基因和外源目的基因的根癌農(nóng)桿菌在花粉培養(yǎng)液中感染植物花粉，附加抽真空處理，獲得的轉(zhuǎn)化花粉授于雌蕊柱頭上，通過受精自然結(jié)種子，轉(zhuǎn)化體再經(jīng)抗潮霉素篩選，以及GUS表達(dá)、PCR擴(kuò)增、Sothern和Northern雜交檢測(cè)和驗(yàn)證，最后獲得含有外源目的基因的植株轉(zhuǎn)基因方法。
農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法的具體步驟如下1、根癌農(nóng)桿菌的制備從新鮮平板上挑取帶有雙元質(zhì)粒載體(含潮霉素抗性基因、GUS基因和外源目的基因)的農(nóng)桿菌菌株的單菌落，接入含慶大霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB細(xì)菌培養(yǎng)基中，在恒溫箱中震蕩培養(yǎng)過夜(28℃、200r/min、約17～18h)，次日以1∶10的比例接入新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5-6h，備用于轉(zhuǎn)化。
2、花粉培養(yǎng)基的配制采用花粉萌發(fā)液體培養(yǎng)基，內(nèi)含有0.1％H3BO3、0.3％Ca(NO3)2-4H2O、0.2％MgSO4-7H2O、0.1％KNO3和蔗糖，其中蔗糖作為調(diào)節(jié)花粉滲透壓的調(diào)節(jié)劑，花粉萌發(fā)最適蔗糖濃度為45％-50％。
3、農(nóng)桿菌感染花粉將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌于3000rpm離心10min，收集菌體，重懸于上述所配制的花粉萌發(fā)培養(yǎng)液中，并加一滴表面活性劑(Tween-20，濃度約為1‰)；收集的新鮮花粉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，并抽真空(壓力-80Pa，時(shí)間20min-30min)，然后授粉于前一天傍晚去雄套袋隔離的柱頭上。
4、轉(zhuǎn)化種子的獲得植物柱頭經(jīng)上述花粉授粉后，花粉在柱頭上萌發(fā)，花粉管在花柱中伸展，精卵細(xì)胞融合，子房膨大成果實(shí)，成熟后收獲其中的轉(zhuǎn)化種子。
5、轉(zhuǎn)化體的篩選、檢測(cè)和驗(yàn)證1)、用抗菌素篩選轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化種子經(jīng)硫酸脫絨和升汞滅菌消毒后，置于含50mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長(zhǎng)，以非轉(zhuǎn)化種子為對(duì)照，觀察種子萌發(fā)和生長(zhǎng)時(shí)的抗潮霉素情況，淘汰非抗性苗，保留抗性苗(陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體)。為進(jìn)一步淘汰假陽(yáng)性苗，可再用500mg/L潮霉素溶液涂抹植物幼葉，5-8天后根據(jù)被涂抹幼葉的抗性反應(yīng)，淘汰抗性差的苗，保留抗性強(qiáng)的苗。
2)、用組織化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中GUS基因的表達(dá)經(jīng)潮霉素抗性篩選后的轉(zhuǎn)化體，取其組織，將它們置于Eppendorf管中，加2倍于組織體積的GUS染色液，抽真空，37℃保溫過夜，染色后的組織于FAA脫色液中進(jìn)行脫色至非轉(zhuǎn)化體(對(duì)照)材料呈現(xiàn)白色為止，觀察轉(zhuǎn)化體組織GUS反應(yīng)，或制成石蠟切片進(jìn)行觀察，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體組織細(xì)胞顯示藍(lán)色反應(yīng)。
3)、用PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中目的基因的整合用于PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)化體DNA用CTAB法提??；PCR擴(kuò)增引物為外源目的基因的特異序列P1(上游)和P2(下游)，反應(yīng)體系內(nèi)含有2×GC buffer I 12.5μl，dNTP(濃度為2.5mmol)4μl，P1和P2(濃度為10mmol)各1μl，TaqaLA 0.2μl，模板DNA1μl，加ddH2O至25μl；反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃30s、55℃1min和72℃2min的30個(gè)循環(huán)，然后72℃10min延伸和4℃保存。以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的PCR產(chǎn)物含有外源基因的DNA序列片段。
4)、用Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中目的基因的整合從轉(zhuǎn)化體中提取DNA，以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶消化后，在瓊脂糖凝膠中分離，分離后的DNA片段轉(zhuǎn)印于尼龍膜上，以同位素標(biāo)記的外源目的基因作為探針，與尼龍膜上的DNA雜交，經(jīng)X光片放射自顯影，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體因含有目的基因顯示出雜交信號(hào)帶。
5)、用Northern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中目的基因的表達(dá)從外源目的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或組織中提取RNA，以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，RNA在甲醛變性瓊脂糖凝膠中分離，分離后的RNA轉(zhuǎn)印于尼龍膜上，以同位素標(biāo)記的外源目的基因作為探針，與尼龍膜上的RNA雜交，經(jīng)X光片放射自顯影，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體因目的基因的表達(dá)顯示出雜交信號(hào)帶。
實(shí)施例下面結(jié)合棉花轉(zhuǎn)基因育種的實(shí)例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明1、轉(zhuǎn)化所需的基本材料1)、植物棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)系“G007”，纖維呈棕色。
2)、花粉取自棉花恢復(fù)系“G007”當(dāng)天開花花朵的新鮮花藥中的花粉粒。
3)、農(nóng)桿菌菌株帶有雙元載體pCAMBIA1301的GV3101根癌農(nóng)桿菌，該載體帶有T-DNA左右臂，左右臂間含1個(gè)報(bào)告基因(GUS基因)、1個(gè)選擇標(biāo)記基因(潮霉素抗性基因，hpt)和2個(gè)外源目的基因[木質(zhì)醋桿菌的纖維素合成酶(cellulose synthetase in Acetobacter xylinum)基因，acsA+acsB]序列；基因表達(dá)由CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，且GUS基因還含有內(nèi)含子，只能在真核生物中表達(dá)。
4)、農(nóng)桿菌培養(yǎng)基含慶大霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB細(xì)菌培養(yǎng)基。
5)、花粉萌發(fā)培養(yǎng)基含有0.1％H3BO3、0.3％Ca(NO3)2-4H2O、0.2％MgSO4-7H2O、0.1％KNO3和45％蔗糖的液體培養(yǎng)基。其中蔗糖作為花粉粒滲透壓的調(diào)節(jié)劑，適當(dāng)濃度蔗糖可使花粉粒處于完整和活性狀態(tài)。
2、轉(zhuǎn)化的方法1)、農(nóng)桿菌感染花粉從固體平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落，在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD600值為0.5-0.8時(shí)，離心(3000rpm，10min)收集菌體，重懸于的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中，加一滴表面活性劑(Tween-20，濃度約為1‰)；新鮮花粉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，并抽真空(壓力-80Pa)，持續(xù)時(shí)間30min，獲得轉(zhuǎn)化的棉花花粉。
棉花花粉粒表面有很多密集的刺狀突起，加Tween-20表面活性劑和抽真空處理，可突破培養(yǎng)液中的水分子在刺狀突起間的表面張力，促進(jìn)農(nóng)桿菌與花粉萌發(fā)孔處花粉管接觸，提高轉(zhuǎn)化效率。
轉(zhuǎn)化后的花粉是否具有生活力，用三種方法鑒定。其一，用聯(lián)苯胺-甲萘酚染色法，凡被聯(lián)苯胺-甲萘酚染色深且形態(tài)正常的花粉為有生活力的花粉，染色淺、無色或形態(tài)異常的花粉為弱生活力和無生活力的花粉；其二，用棉藍(lán)-乳酸-酚染色法，花粉授于柱頭后萌發(fā)，長(zhǎng)出花粉管并向胚囊伸展，取這時(shí)的花柱經(jīng)棉藍(lán)-乳酸-酚染色，有活力的花粉顯示出染成藍(lán)色花粉管(其它組織細(xì)胞為無色或淡黃色)在花柱中正常伸展；其三，有生活力的花粉授于柱頭后，能促使子房膨大，結(jié)出正常種子。
2)、轉(zhuǎn)化花粉的授粉將上述處理后的棉花花粉授于已去雄套袋隔離的柱頭上，繼續(xù)套袋隔離，以防止其它花粉的污染；為提高結(jié)鈴率，可用100ppm的赤霉素涂抹授粉后的子房；同時(shí)對(duì)同一棉株上未授粉處理過的花朵進(jìn)行自交，作為陰性對(duì)照；為標(biāo)記和區(qū)分授粉處理和自交處理的花朵及其以后結(jié)的棉鈴，在花柄上掛有記載的牌子。
3)、轉(zhuǎn)化種子的收獲根據(jù)牌子的記載，分別從授粉處理和自交處理的吐絮棉鈴中收獲種子；其中，從授粉處理的棉鈴中收獲的種子為轉(zhuǎn)化種子，從自交處理的棉鈴中收獲的種子為自交種子(非轉(zhuǎn)化種子，對(duì)照)；種子曬干后備用。
3、轉(zhuǎn)化體的篩選1)種子萌發(fā)時(shí)對(duì)潮霉素抗性的篩選轉(zhuǎn)化種子經(jīng)硫酸脫絨和升汞滅菌消毒后，置于含50mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長(zhǎng)，以非轉(zhuǎn)化種子為對(duì)照，觀察種子萌發(fā)和生長(zhǎng)時(shí)對(duì)潮霉素抗性的情況，淘汰非抗性苗，保留抗性苗；抗性苗移栽至土壤。
2)移栽后轉(zhuǎn)化體的抗性篩選為進(jìn)一步淘汰假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體，再用500mg/L潮霉素溶液涂抹幼葉進(jìn)行第二次抗性篩選；以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化體棉株的倒3葉用潮霉素溶液涂抹，5-8天后根據(jù)被涂抹幼葉的抗性反應(yīng)，淘汰抗性差的植株，保留抗性強(qiáng)的植株?？剐詮?qiáng)的植株備用于轉(zhuǎn)化體的DAN分子檢測(cè)和驗(yàn)證。
4、轉(zhuǎn)化體的DAN分子檢測(cè)和驗(yàn)證1)、用組織化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中GUS基因的表達(dá)經(jīng)潮霉素抗性篩選后的轉(zhuǎn)化體，取其開花后5-10天的胚珠及其纖維，將它們置于Eppendorf管中，加2倍于組織體積的GUS染色液，抽真空，37℃保溫過夜，染色后的組織于FAA脫色液中進(jìn)行脫色至非轉(zhuǎn)化體(對(duì)照)材料呈現(xiàn)白色為止，觀察轉(zhuǎn)化體組織GUS反應(yīng)，或制成石蠟切片進(jìn)行觀察，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體組織細(xì)胞顯示藍(lán)色反應(yīng)。
2)、用PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中目的基因的整合用于PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)化體DNA用CTAB法從棉葉中提??；PCR擴(kuò)增引物為外源目的基因(acsA+acsB)的特異序列P1(上游)和P2(下游)，其中acsA基因P15‘GCGCGGATCCGAACCGTGAAAATGGTTTCG3’，P25‘CCCCAAGCTTTCGTTTATGGGTCACGACTT3’；acsB基因P15‘GCGCGGATCCGAACCGTGAAAATGGTTTCG3’，P25‘CCCCAAGCTTTCGTTTATGGGTCACGACTT3’。
反應(yīng)體系內(nèi)含有2×GC buffer I 12.5μl，dNTP(濃度為2.5mmol)4μl，P1和P2(濃度為10mmol)各1μl，TaqaLA 0.2μl，模板DNA1μl，加ddH2O至25μl；反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃30s、55℃1min和72℃2min的30個(gè)循環(huán)，然后72℃10min延伸和4℃保存。以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)化體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體的PCR產(chǎn)物含有外源基因的DNA序列片段。
3)用Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中目的基因的整合從轉(zhuǎn)化體中提取DNA，以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，取10μg DNA分別用HindIII和BamHI于37℃酶切過夜，經(jīng)酶切后的DNA在0.9％的瓊脂糖凝膠中分離，并轉(zhuǎn)印于尼龍膜上，以同位素32P標(biāo)記的目的基因(acsA或acsB)作為探針，與尼龍膜上的DNA雜交，經(jīng)X光片放射自顯影，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體因含有目的基因顯示出雜交信號(hào)帶。
4)用Northern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)化體中目的基因的表達(dá)從轉(zhuǎn)化體開花后10天的胚珠中提取總RNA，以非轉(zhuǎn)化體為對(duì)照，RNA在1.2％甲醛變性的瓊脂糖凝膠中分離，分離后的RNA轉(zhuǎn)印于尼龍膜上，以同位素32P標(biāo)記的目的基因(acsA或acsB)作為探針，與尼龍膜上的RNA雜交，經(jīng)X光片放射自顯影后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體因目的基因的表達(dá)顯示出雜交信號(hào)帶。
表1轉(zhuǎn)基因棉花株系的纖維品質(zhì)指標(biāo)纖維品質(zhì)指標(biāo)基因型 年分(世代) 長(zhǎng)度比強(qiáng)度 馬克隆值 纖維素含(mm) (gf/tex)(μg/in)量(％)2001(T1) 28.3±1.1 24.29±0.5 3.5±0.2 87.6±2.1轉(zhuǎn)基因株系2002(T2) 29.4±1.4 24.05±0.8 4.0±0.2 89.2±3.0平均 28.85 24.173.75 88.402001 24.6±0.8 21.04±0.4 4.4±0.2 80.02±1.2非轉(zhuǎn)基因株系(對(duì)照)2002 25.5±1.1 20.14±0.5 4.1±0.3 85.12±1.3平均 25.05 20.594.25 82.57差值3.80*3.58*-0.50 5.83*比對(duì)照增減(％) 15.17 17.38-11.76 7.06*表示在0.05概率水平上的差異顯著經(jīng)上述對(duì)本發(fā)明的實(shí)施，將木質(zhì)醋桿菌的纖維素合成酶基因acsA和acsB，通過農(nóng)桿菌真空滲透法感染棕色棉花恢復(fù)系的花粉，感染后的花粉授粉于棉花柱頭上，獲得轉(zhuǎn)化種子，經(jīng)抗生素的篩選，以及GUS表達(dá)、PCR擴(kuò)增和Southern雜交等的檢測(cè)和驗(yàn)證，最終獲得了纖維品質(zhì)有所改良的轉(zhuǎn)基因棉花(表1)，這表明這一方法是可行性。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法，方法的步驟如下1)花粉離體培養(yǎng)將采集的花粉在花粉萌發(fā)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以蔗糖作為調(diào)節(jié)花粉滲透壓的調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)滲透壓使花粉萌發(fā)；2)農(nóng)桿菌感染花粉處理將經(jīng)離體培養(yǎng)的花粉與農(nóng)桿菌在花粉萌發(fā)培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，加Tween-20的表面活性劑，并抽真空；3)授粉將經(jīng)農(nóng)桿菌感染處理的花粉授于已去雄的雌蕊柱頭上，套袋隔離，獲得轉(zhuǎn)化種子及其植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所說的花粉萌發(fā)培養(yǎng)液的重量百分比為0.1％～0.12％H3BO3、0.3％～0.4％Ca(NO3)2-4H2O、0.2％～0.23％MgSO4-7H2O、0.1％～0.12％KNO3、45％～50％蔗糖、其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所說的農(nóng)桿菌為帶有Ti質(zhì)粒載體的工程根癌農(nóng)桿菌，載體帶有GUS基因(β-glucuronidase gene)、潮霉素抗性基因(Hygromycin phosphotransferase(HPT)gene)和外源目的基因；基因表達(dá)由CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；GUS基因含有內(nèi)含子，能在真核生物細(xì)胞中表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于所說Tween-20的濃度約為1～2‰，所抽真空的壓力為-70～-80Pa，時(shí)間為20min～30min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌真空滲透法轉(zhuǎn)化植物花粉的轉(zhuǎn)基因方法。它是利用根癌農(nóng)桿菌在花粉培養(yǎng)基中感染植物花粉，附加抽真空處理提高感染效果，將轉(zhuǎn)化后的花粉授于待改良品種的雌蕊柱頭上，獲得轉(zhuǎn)化種子及其植株；轉(zhuǎn)化體經(jīng)抗生素篩選，以及GUS表達(dá)、PCR擴(kuò)增、Southern和Northern雜交等的檢測(cè)和驗(yàn)證，獲得含有外源目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。本方法省略了傳統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化方法所要求的組織培養(yǎng)過程，避免了農(nóng)桿菌感染植物組織時(shí)存在的轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞間的嵌合現(xiàn)象問題，使整個(gè)轉(zhuǎn)化過程較為經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單和有效。
文檔編號(hào)A01H1/02GK1640241SQ20041008469
公開日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者王學(xué)德, 李曉, 朱偉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)