專利名稱：一種誘發(fā)水稻抗氯磺隆體細(xì)胞突變體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高水稻抗除草劑育種效率，更具體涉及一種誘發(fā)水稻抗氯磺隆體細(xì)胞突變體的方法，是一種利用化學(xué)誘變技術(shù)與組織培養(yǎng)相結(jié)合的方法選育水稻抗除草劑新品種途徑的植物細(xì)胞工程實(shí)用方法。
背景技術(shù)：
隨著農(nóng)業(yè)除草劑迅速發(fā)展，除草劑的使用安全性問題日趨突出，已引起人們的普遍關(guān)注，從除草劑改良入手，不斷推出高效、低毒、低殘留除草劑新品種，不失為解決良好的途徑，但需要巨額投資，其研究周期長(zhǎng)；另外水稻對(duì)氯磺隆除草劑極敏感，土壤中氯磺隆含量為0.1-0.2×10-9時(shí)就抑制水稻植株生長(zhǎng)，使植株發(fā)僵，根呈雞爪狀；氯磺隆處理過的麥田，不宜作水稻秧田、直播田和小苗插秧田，因此嚴(yán)重制約了氯磺隆除草劑在長(zhǎng)江中下游麥稻輪作區(qū)的使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種誘變水稻抗氯磺隆體細(xì)胞突變體的方法，采用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)與氯磺隆除草劑復(fù)合組配篩選，并能有效地為應(yīng)用于培育水稻抗除草劑新品種提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，避免育種盲目性，該方法操作簡(jiǎn)便，效果好，適應(yīng)廣，培育一個(gè)水稻抗除草劑新品種至少比常規(guī)育種方法提前3-4年完成。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施首先采用成熟的體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，建立了一套最佳誘變劑濃度誘導(dǎo)愈傷組織與氯磺隆除草劑復(fù)合組配篩選方法。該方法利用化學(xué)誘變技術(shù)、與組織培養(yǎng)相結(jié)合，采用了離體誘導(dǎo)、繼代、篩選、分化(不含氯磺隆)、再分化(含氯磺隆)培養(yǎng)程序。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容誘發(fā)水稻抗除草劑體細(xì)胞突變體的方法由最佳操作程序和最適宜的誘變、篩選培養(yǎng)基配方組成。A、配制培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基NB培養(yǎng)基加入2mg/L二氯苯氧乙酸和20-30mg/L5-溴尿嘧啶；繼代培養(yǎng)基NB培養(yǎng)基中加入2mg/L 2，4-D和0.2mg/L6-芐基氨基嘌呤；篩選培養(yǎng)基NB培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺??；分化培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中加入2mg/6-BA和0.5mg/L萘乙酸；再分化培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆；B、培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)、繼代、篩選培養(yǎng)，將已消毒的成熟胚材料接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)，并加入5-溴尿嘧啶誘變劑培養(yǎng)18-20天；繼代培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-20天，擴(kuò)大愈傷組織抗氯磺隆細(xì)胞群體；篩選培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織切割成直徑為1.5-2.0毫米，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-20天；C、分化、再分化培養(yǎng)時(shí)間在光照條件下愈傷組織進(jìn)行再分化綠苗培養(yǎng)，12-14小時(shí)的光周期，分化培養(yǎng)，將篩選培養(yǎng)基上已成活的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-16天分化綠苗塊；15-16天后進(jìn)入再分化培養(yǎng)，將已分化的愈傷綠塊轉(zhuǎn)入再分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-16天，篩選抗氯磺隆除草劑再生植株苗；D、誘導(dǎo)、繼代、篩選、分化培養(yǎng)溫度控制在26-27℃。
五種培養(yǎng)基操作程序及培養(yǎng)方法(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)首先選取水稻健康的種子去殼，然后成熟胚置于70％乙醇中浸泡，用0.1％氯化汞溶液浸泡15-20分鐘，用無菌水沖洗4次后方能接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，將接好的成熟胚置于黑暗條件下培養(yǎng)18-20天。(2)繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的愈傷組織，再轉(zhuǎn)入愈傷繼代培養(yǎng)基上置于黑暗條件下培養(yǎng)18-20天。(3)篩選培養(yǎng)用繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織，用刀片切割愈傷組織直徑為1.5-2.0mm，再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上置于黑暗條件下培養(yǎng)18-20天。(4)分化培養(yǎng)用篩選培養(yǎng)獲得的愈傷組織，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上光照條件下分化培養(yǎng)15-16天。(5)再分化培養(yǎng)分化培養(yǎng)基上已分化的愈傷綠塊，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上并含氯磺隆50-60mg/L光照條件下培養(yǎng)15-16天。其次是誘導(dǎo)、繼代、篩選培養(yǎng)過程，是將已接種的成熟胚和已轉(zhuǎn)培的愈傷組織及愈傷篩選培養(yǎng)材料放在生化箱黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)；分化、再分化培養(yǎng)是在光照條件下進(jìn)行愈傷組織分化及再分化植株苗篩選培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度均控制在26-27℃。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.利用化學(xué)劑適宜濃度處理可提高愈傷組織誘發(fā)突變頻率10-100倍，而植物體細(xì)胞離體自發(fā)突變頻率極低，約為10-6-10-7。因此本方法可大大提高水稻抗除草劑細(xì)胞突變體的選擇效率。
2.采用了最佳劑量誘導(dǎo)愈傷組織和抗氯磺隆復(fù)合組配篩選程序，既可以在較小的空間內(nèi)篩選數(shù)額巨大的抗氯磺隆除草劑細(xì)胞系群體，又可以節(jié)約大量的人力、物力資源；比常規(guī)育種程序簡(jiǎn)便、實(shí)用、效果更佳。
3.通過體細(xì)胞培養(yǎng)獲得的變異的再生植株在育種中具有穩(wěn)定快的優(yōu)點(diǎn)，便于大田抗除草劑育種優(yōu)良性狀的選擇。
4.適應(yīng)性廣，可廣泛適合于農(nóng)業(yè)科研單位從事水稻抗逆境育種研究，應(yīng)用化學(xué)誘變技術(shù)與植物細(xì)胞工程技術(shù)相結(jié)合的方法創(chuàng)造水稻抗除草劑新的種質(zhì)材料。
具體實(shí)施例方式
1.培養(yǎng)基的配制。誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(NB)中加入2mg/L二氯苯氧乙酸(2，4-D)和20-30mg/L5-溴嘧啶(5-Bu)；繼代培養(yǎng)基(NB)中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-芐基氨基嘌(6-BA)；篩選培養(yǎng)基(NB)中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺??；分化培養(yǎng)基(MS)中加入2mg/L6-BA和0.4-0.5mg/L萘乙酸(NAA)；再分化培養(yǎng)基(MS)中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺隆。
2.誘導(dǎo)、繼代、篩選培養(yǎng)時(shí)間已接種的成熟胚和已轉(zhuǎn)的愈傷篩選材料置于生化培養(yǎng)箱中，必須在黑暗下培養(yǎng)誘導(dǎo)、篩選愈傷組織，培養(yǎng)溫度均控制在26-27℃，否則，誘導(dǎo)出來的愈傷組織生長(zhǎng)質(zhì)量較差；(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)將成熟種子去殼，用0.1％氯化汞(HgCI2)溶液浸泡15分鐘，用無菌水沖洗4次后，將已消毒的成熟胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并加入20-30mg/L5-溴尿嘧啶化學(xué)誘變劑培養(yǎng)19天誘導(dǎo)愈傷組織；(2)繼代培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天，擴(kuò)大愈傷組織抗氯磺隆細(xì)胞群體；(3)篩選培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上并加入氯磺隆除草劑25-50mg/L培養(yǎng)18天，篩選抗氯磺隆細(xì)胞系。
3.分化、再分化培養(yǎng)必須在光照下培養(yǎng)，才能誘導(dǎo)出再生植株，光照強(qiáng)度為2000Lx，12小時(shí)光周期；否則分化出來的綠苗為黃苗或白化苗。(1)分化培養(yǎng)將篩選培養(yǎng)19-20天后已成活的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天，讓其分化綠苗；(2)再分化培養(yǎng)將分化培養(yǎng)15天后已分化的愈傷綠塊轉(zhuǎn)入再分化培養(yǎng)基上加入氯磺隆除草劑50-60mg/L，篩選抗氯磺隆再生苗培養(yǎng)15天以上。培養(yǎng)溫度控制在26-27℃。
NB培養(yǎng)基N6大量元素、鐵鹽，B5微量元素、有機(jī)成分；N6大量元素為硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣；鐵鹽為硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉；B5微量元素為硫酸錳、硼酸、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、碘化鉀；有機(jī)成份鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌-肌醇(植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)、科學(xué)出版社、1995年、P403-408)。
MS培養(yǎng)基大量元素、鐵鹽、微量元素、有機(jī)成分；大量元素為硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣；鐵鹽為硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉；微量元素為硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷；有機(jī)成分為甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌-肌醇(植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)、科學(xué)出版社、1995年、P403-408)。
權(quán)利要求
1.一種誘發(fā)水稻抗氯磺隆體細(xì)胞突變體的方法，它包括下列步驟A、配制培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基中加入2mg/L二氯苯氧乙酸和20-30mg/L5-溴尿嘧啶；繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-芐基氨基嘌呤；篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和0.2mg/L6-BA及25-50mg/L氯磺?。环只囵B(yǎng)基培養(yǎng)基中加入2mg/6-BA和0.5mg/L萘乙酸；再分化培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入2mg/L6-BA和0.5mg/LNAA及50-60mg/L氯磺?。籅、培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)、繼代、篩選培養(yǎng)，將已消毒的成熟胚材料接于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于黑暗條件下進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)，并加入5-溴尿嘧啶誘變劑培養(yǎng)18-20天；繼代培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-20天，擴(kuò)大愈傷組織抗氯磺隆細(xì)胞群體；篩選培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)獲得的愈傷組織切割成直徑為1.5-2.0毫米，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-20天；C、分化、再分化培養(yǎng)時(shí)間在光照條件下愈傷組織進(jìn)行再分化綠苗培養(yǎng)，12-14小時(shí)的光周期，分化培養(yǎng)，將篩選培養(yǎng)基上已成活的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-16天分化綠塊；15-16天后進(jìn)入再分化培養(yǎng)，將已分化的愈傷綠塊轉(zhuǎn)入再分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-16天，篩選抗氯磺隆除草劑再生植株苗；D、誘導(dǎo)、繼代、篩選、分化培養(yǎng)溫度控制在26-27℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘發(fā)水稻抗除草劑體細(xì)胞突變體的方法。它由誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、再分化培養(yǎng)組成。操作者先將健康成熟種子去殼，再在無菌條件下，將成熟胚置于乙醇中浸泡，用氯化汞溶液浸泡，用無菌水沖洗，將已消毒的成熟胚接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上加入5－溴尿嘧啶誘變劑黑暗培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)；愈傷組織再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上加入氯磺隆黑暗培養(yǎng)；篩選培養(yǎng)后，將已成活的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，再將已分化的愈傷綠塊轉(zhuǎn)入再分化培養(yǎng)基上并加入氯磺隆除草劑，在光照下篩選培養(yǎng)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，效果好，適應(yīng)性廣，培育一個(gè)抗除草劑新品種比常規(guī)育種方法提前3－4年完成。
文檔編號(hào)A01H3/00GK1582639SQ20041001321
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月26日
發(fā)明者馮雙華, 肖國(guó)櫻 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所