專利名稱：抗菌劑和抗菌性組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有赤竹提取物(ササエキス)的抗菌劑，更詳細地說，涉及含有赤竹提取物的抗破傷風桿菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑和抗菌性組合物。
背景技術(shù)：
從很早就已知赤竹提取物具有抗菌性。例如，有關(guān)于對傷口感染的病原菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)的抗菌效果以及對作為胃潰瘍病原菌幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的抗菌效果的報道。
但是，作為傷口感染的病原菌，成為破傷風、氣性壞疽、各種化膿性感染的病因的有芽孢和無芽孢厭氧菌也是重要的存在，但對于這些厭氧菌的抗菌作用的研究則至今未見報道。
評價具有抗菌能力的物質(zhì)時，弄清楚該物質(zhì)對人體病原菌的作用和對皮膚、粘膜上的固有益生菌或條件致病菌的作用是極為重要的。
另外，已知乳桿菌(Lactobacillus spp.)是口腔內(nèi)、消化道內(nèi)、陰道內(nèi)的固有細菌。眾所周知固有細菌對機體的作用具有兩面性。乳桿菌也可從包括血液在內(nèi)的臨床材料中分離得到，決不應過低估其致病原學意義，但由于其分離頻率極低，因而被當做是在各解剖學部位有用性高的細菌種類。乳桿菌被認為是對人具有很高有用性的菌群，赤竹提取物對其具有何種程度的抗菌作用，這是極引人關(guān)注的一個問題，但迄今為止未見到詳細的研究結(jié)果。
皮膚上皮脂腺內(nèi)固有的瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)是厭氧性無芽孢厭氧菌，在中等到重癥的尋常痤瘡中，其與金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococus epidermidis)等一起作為尋常痤瘡的加重因子為人所知。目前，至今一直使用抗菌藥(紅霉素、四環(huán)素、那氟沙星)的乳膏、洗液來治療尋常痤瘡，但長期使用這些藥將在臨床上出現(xiàn)葡萄球菌(staphilococus spp.)、瘡皰丙酸桿菌的耐藥性問題，目前全世界都在研討其對策。尚未見關(guān)于赤竹提取物對瘡皰丙酸桿菌的研究結(jié)果。
二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia)、有色普雷沃氏菌(PigmentedPrevotella spp.)在健康女性的陰道內(nèi)僅以低于檢出下限的數(shù)量存在，但與生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)(人型支原體(hommnis))、陰道加德納氏菌(Gardmerella vaginalis)、以厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcus anaerobius)為中心的厭氧性革蘭氏陽性球菌、卟啉單胞菌(Porphyromonas spp.)等一起都是屬于在細菌性陰道病(BV)的狀態(tài)下異常增加的細菌性陰道病(BV)相關(guān)微生物范疇的專性厭氧性革蘭氏陰性桿菌，作為子宮、盆腔內(nèi)感染的病原菌，也是極為重要的細菌。所述細菌性陰道病(BV)的癥狀特征在于陰道內(nèi)乳酸菌減少、陰道內(nèi)pH低、以及具有乳樣惡臭(胺臭)的白帶。
雖然知道赤竹提取物具有抗菌作用，但至今未見關(guān)于其對上述BV相關(guān)細菌群菌種的抗菌作用的研究。
因此，通常不知道赤竹提取物是否對所有細菌都具有有效的抗菌活性，也不知道對細菌具有抗菌活性的天然提取物是否對念珠菌等真菌具有抗菌活性。
另一方面，破傷風是破傷風桿菌感染傷口部位，在該部位產(chǎn)生的神經(jīng)毒素主要引起肌肉痙攣、僵硬、腱反射亢進的致命率很高的毒素性疾病。破傷風桿菌是可在土壤、人和動物的糞便中檢測到的厭氧性桿菌，通過類毒素進行的自動免疫、通過抗毒素血清進行的被動免疫可有效預防治療破傷風。但赤竹提取物對破傷風桿菌具有抗菌活性，這尚不為人所知。
病毒是不能自身增殖，而寄生于動植物、微生物上進行增殖的極微小的病原體，可分為動物病毒、植物病毒、微生物病毒。已開發(fā)出了各種用于預防治療病毒性疾病的抗病毒劑，但仍需要無副作用的具有有效抗病毒活性的藥物。
已知各種植物中所含的單寧酸具有抗菌作用。例如，雖然知道從赤竹以外的植物中得到的單寧酸對MRSA(甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌)具有抗菌作用，但因其副作用大，所以存在不能作為抗菌劑使用的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供抗菌劑，更具體地說，是提供抗破傷風桿菌劑、抗真菌劑和抗病毒劑。
本發(fā)明的其它目的是提供抗菌性組合物。
本發(fā)明提供含有赤竹提取物的下述抗菌劑、抗菌性組合物。
1.含有赤竹提取物的抗破傷風桿菌劑。
2.含有赤竹提取物的抗真菌劑。
3.還含有有機酸的上述2所述的抗真菌劑。
4.上述3的抗真菌劑，其中所述真菌為念珠菌。
5.含有赤竹提取物的抗病毒劑。
6.含有赤竹單寧酸的抗菌劑。
7.上述6的抗菌劑，該抗菌劑是抗金黃色葡萄球菌、丙酸桿菌、大腸桿菌的抗菌劑。
8.上述6的抗菌劑，該抗菌劑是抗MRSA的抗菌劑。
9.上述6的抗菌劑，該抗菌劑是抗瘡皰丙酸桿菌的抗菌劑。
10.含有赤竹單寧酸的粉刺治療劑。
11.含有赤竹提取物和有機酸的抗菌性組合物。
12.上述11的抗菌性組合物，該組合物為油墨、涂料、食品添加劑、飲料、調(diào)味料、寵物食品、塑料制品或粘結(jié)劑。
13.含有赤竹提取物的抗氣性壞疽菌的抗菌劑。
14.上述13的抗菌劑，其中所述氣性壞疽菌為梭菌屬菌。
15.含有赤竹提取物的抗無芽孢厭氧性革蘭氏陽性球菌的抗菌劑。
16.上述15的抗菌劑，其中所述無芽孢厭氧性革蘭氏陽性球菌為Finegoldia、Micromonas、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、阿托波氏菌屬(Atopobium)或?qū)\生球菌屬(Gemella)。
17.含有赤竹提取物的抗無芽孢厭氧性革蘭氏陰性桿菌的抗菌劑。
18.上述17的抗菌劑，其中所述無芽孢厭氧性革蘭氏陰性桿菌為普雷沃氏菌屬、卟啉單胞菌屬、嗜膽菌屬(Bilophila)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)或梭桿菌屬(Fusobacterium)。
19.含有赤竹提取物的抗陰道炎和細菌性陰道病相關(guān)微生物的抗菌劑。
20.還含有有機酸的上述13-19中任一項的抗菌劑。
21.含有赤竹提取物的調(diào)味料。
22.上述21的調(diào)味料，該調(diào)味料為含有赤竹提取物的食鹽。
23.上述21或22的調(diào)味料，該調(diào)味料還含有有機酸。
24.含有赤竹提取物的農(nóng)藥。
25.還含有有機酸的上述24的農(nóng)藥。
26.含有赤竹提取物的農(nóng)業(yè)用殺菌劑。
27.還含有有機酸的上述26的農(nóng)業(yè)用殺菌劑。
28.含有赤竹提取物的防腐劑。
29.還含有有機酸的上述28的防腐劑。
下面，本說明書中將抗破傷風桿菌劑、抗真菌劑、抗病毒劑、粉刺治療劑等總括簡稱為“抗菌劑”。
另外，本說明書中的“抗菌劑”還包括用于人以外的抗菌劑、防腐劑。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明是含有赤竹提取物作為有效成分的抗菌劑。本發(fā)明的抗菌劑含有1-50％質(zhì)量，優(yōu)選2-25％質(zhì)量，更優(yōu)選4-15％質(zhì)量的為固體成分的赤竹提取物。若赤竹提取物的固體成分濃度小于1％質(zhì)量，則不能充分表現(xiàn)出目的所在的抗菌性，而若超過50％質(zhì)量，則刺激過強，因而不優(yōu)選。
一直以來，通常以含有0.5-10％質(zhì)量的固體成分的提取物形式制造赤竹提取物，并將其用于各種用途。因為通常將該固體成分濃度的物質(zhì)以相對于最終制品為1-10％質(zhì)量左右添加使用，所以最終制品中的赤竹提取物固體成分濃度通常為0.05-0.8％質(zhì)量左右，即使是最高濃度的制品，其濃度也小于1％質(zhì)量左右。其原因在于赤竹提取物價格較高，以這樣的低濃度也能顯示出一定程度的消炎效果和抗菌效果，10％質(zhì)量以上的有效成分添加量是非常識的等。但以這樣的低濃度，很多情況下不具備充分的抗菌效果。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過含有以固體成分濃度計為1-10％質(zhì)量，優(yōu)選2-8％質(zhì)量，更優(yōu)選3-7％質(zhì)量的赤竹提取物，可以使其顯著表現(xiàn)出歷來在低濃度情況下基本上未見的對特異反應性的改善效果、止癢效果，并且傷口愈合效果也顯著提高(WO 02/07745)。本發(fā)明人進一步研究了赤竹提取物對各種菌類的抗菌效果，發(fā)現(xiàn)含有以固體成分計為1-50％重量，優(yōu)選2-25％質(zhì)量，更優(yōu)選4-15％質(zhì)量的赤竹提取物的制品對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等以外的菌，即破傷風桿菌等厭氧菌、包括瘡皰丙酸桿菌在內(nèi)的丙酸桿菌、念珠菌等真菌類或者皰疹病毒、流感病毒、冠狀病毒等病毒等等也具有顯著的抗菌效果，還發(fā)現(xiàn)通過使赤竹提取物中含有蘋果酸等有機酸，可顯著提高抗菌性，從而在以上發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。盡管赤竹提取物本身是很早就已知的，卻至今沒有進行以高濃度使用的嘗試，其原因還不清楚，但令人吃驚的是，通過將濃度提高至比傳統(tǒng)濃度更高(10倍以上)，對破傷風桿菌等厭氧菌、念珠菌等真菌類或者病毒等顯示出顯著的抗菌效果。
本發(fā)明對皮膚軟組織傳染也有效。如皮膚、骨、軟組織因外傷、缺血、手術(shù)而受損傷，則會形成適于厭氧菌感染的環(huán)境。皮膚軟組織感染發(fā)生于易受糞便、上呼吸道分泌物污染的部位。例如，有與腸道手術(shù)相關(guān)的傷口部位、褥瘡、與人咬傷相關(guān)的傷口。從可見到氣體產(chǎn)生的蜂窩織炎(crepitant cellulitis)、協(xié)同性蜂窩織炎、壞疽和壞死性筋膜炎的病例中可分離出厭氧菌。而且，可從皮膚的膿腫、直腸膿腫以及腋下汗腺感染(化膿性汗腺炎)分離到厭氧菌。從糖尿病患者的足潰瘍也可頻繁分離出厭氧菌。
皮膚軟組織感染通常是多種菌感染。平均每種病例可分離出4.8個菌種，厭氧菌與需氧菌的比例為3∶2。分離頻率高的細菌種有擬桿菌(Bacteroides spp.)、消化鏈球菌、腸球菌(Enterococcus spp.)、梭菌(Clostridium spp.)、變形菌(Preoteus spp.)。若厭氧菌與這些感染掛上關(guān)系，將會使發(fā)熱頻率提高、患處發(fā)出惡臭，組織內(nèi)產(chǎn)生氣體，或者發(fā)生足潰瘍。
通過厭氧菌與兼性菌的協(xié)同作用而發(fā)生的壞疽(米蘭尼壞疽)，其特征是強烈的疼痛、發(fā)紅、腫脹及隨后產(chǎn)生的硬結(jié)。紅斑以壞死帶為中心擴散。隨著壞死和紅斑向外側(cè)擴大，在中心部位形成肉芽性潰瘍。癥狀僅表現(xiàn)為疼痛，發(fā)熱不是典型的癥狀。該感染常常由金黃色葡萄球菌與消化鏈球菌的共同作用而發(fā)生。好發(fā)部位是腹部的手術(shù)傷口、下肢的潰瘍周圍。治療是通過外科方法除去壞死組織以及采用抗菌化學療法。
壞死性筋膜炎這一快速擴展的筋膜破壞性疾病大多由A族鏈球菌引起，也有由消化鏈球菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌引起的。有時會還會在組織內(nèi)見到氣體。與之相同，肌壞死也與厭氧菌和兼性菌的混合感染有關(guān)系。富尼埃壞疽是侵害陰囊、會陰部、腹壁前部，多種厭氧菌沿著深部的筋膜面(deep external facial planes)擴散，引起大范圍皮膚缺損的蜂窩織炎。
本發(fā)明提供含有赤竹提取物的皮膚軟組織感染的治療和/或預防劑。
本發(fā)明還提供含有赤竹提取物的抗包括瘡皰丙酸桿菌在內(nèi)的丙酸桿菌的抗菌劑。
本發(fā)明人對赤竹提取物的有效成分進一步進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赤竹提取物中較大量含有的單寧酸具有優(yōu)異的抗菌作用，從而完成了本發(fā)明。歷來有單寧酸具有抗菌作用的報道，但因為這些單寧酸都具有很大的副作用，所以至今沒有實際應用的例子。赤竹提取物本身很早就可經(jīng)口攝取，已知對人體沒有副作用。這樣的赤竹提取物中較大量地含有單寧酸，其具有優(yōu)異的抗菌作用，這是完全沒有預料到的。
作為本發(fā)明抗菌劑的有效成分，對作為赤竹提取物的原料所使用的赤竹沒有特別限制，可以是赤竹屬的所有赤竹。例如クマイ赤竹、山白竹、白紋陰陽竹、オクヤマ赤竹、エゾミヤマ赤竹、チマキ赤竹、ヤヒコ赤竹、オオバ赤竹、ミヤマ赤竹、センダイ赤竹、ユカワ赤竹、アボイ赤竹、オヌカ赤竹等。其中市售品的具體例子有クマイ赤竹、クマ赤竹(中國赤竹、ヒダ赤竹)等。例如優(yōu)選北海道天鹽山系7-10月采割的クマイ赤竹、クマ赤竹的水提取物等。
優(yōu)選本發(fā)明中所用的赤竹提取物是將赤竹的鮮葉或干燥葉，優(yōu)選干燥葉在100-180℃于常壓或加壓下用水提取得到的提取物。
對提取方法沒有特別限定，可以采用例如日本專利第3212278號(日本特開平11-196818號公報)中記載的方法。更具體地說，是用加壓熱水提取機，在100-180℃處理5-30分鐘，提取出提取物，將該提取物用水分分離器分離成含水固體成分(含水率40-70％)，然后用飽和水蒸氣加熱處理機將該含水固體成分在100℃-200℃處理5-60分鐘，再次用加壓熱水提取機在100℃-180℃處理5-30分鐘，提取出提取物，將第一次和第二次的提取物合并使用。也可以使用將赤竹干燥葉在例如60-100℃用水提取30分鐘至12小時而得到的提取物。
作為含有50％質(zhì)量的赤竹提取物固體成分的市售品，有株式會社クロロランド·モシリ制造的“AHSS”、株式會社鳳凰堂的“TWEBS”。
這樣得到的赤竹提取物含有硫成分，其含量以硫換算，每1g赤竹提取物的固體成分含有約4-10mg，通常約6-9mg。可認為硫成分中的主要成分是含硫氨基酸。
本發(fā)明的抗菌劑以硫換算，優(yōu)選每100g含有4-500mg，更優(yōu)選8-250mg，最優(yōu)選16-150mg來自赤竹的硫成分。
另外，赤竹含有單寧酸，其含量相對于赤竹的固體成分為5-15％質(zhì)量。
本發(fā)明的抗菌劑以固體成分濃度計優(yōu)選含有0.05-7.5％質(zhì)量，進一步優(yōu)選0.1-6％質(zhì)量的單寧酸。
本發(fā)明的抗菌劑可以僅以赤竹提取物為有效成分，也可以與適量有機酸聯(lián)合使用，使其抗菌效果進一步提高。這樣的有機酸有例如蘋果酸、檸檬酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、乙酸、苯甲酸、苯乙酸、水楊酸、酚類等。
有機酸在本發(fā)明抗菌劑中的用量優(yōu)選為0.01-5％質(zhì)量，更優(yōu)選為0.02-3％質(zhì)量，最優(yōu)選為0.05-1.5％質(zhì)量。
本發(fā)明的抗菌劑可以是赤竹提取物本身，也可以與其它成分、載體混合。
本發(fā)明提供含有赤竹提取物或者赤竹提取物與有機酸的混合物的食鹽、砂糖、醬油、豆醬、辣醬油、蛋黃醬、酒、料酒、調(diào)味汁等調(diào)味料。例如，將赤竹提取物或者赤竹提取物與有機酸的混合物添加到食鹽中，該食鹽具有使魚類、肉類等的保存期特別增長的效果。赤竹提取物相對于食鹽的添加量，以固體成分計優(yōu)選為1-10％質(zhì)量，更優(yōu)選2-8％質(zhì)量，最優(yōu)選3-6％質(zhì)量。
本發(fā)明的抗菌劑的劑型可以是液態(tài)、固態(tài)、氣態(tài)任何形態(tài)。本發(fā)明的抗菌劑可以采用經(jīng)口給藥和胃腸外給藥的任何給藥方式。經(jīng)口給藥的形態(tài)有片劑、丸劑、散劑、液劑、口香糖、糖果、巧克力、面包、糕點、蕎麥面、切面、各種口服液等食品形式，胃腸外給藥的形態(tài)有注射劑、局部給藥劑(乳膏、軟膏等)、栓劑等。作為局部給藥劑型的例子，有將本發(fā)明抗菌劑含浸到天然纖維或合成纖維紗布等載體上得到的劑型，還有使本發(fā)明抗菌劑含在口紅等化妝品中等。
本發(fā)明的抗菌劑不用說當然對人有效，作為除人以外的哺乳類、鳥類、魚類、爬蟲類等使用的抗菌劑也是有效的。因此，本發(fā)明的抗菌劑可以用作這些動物用抗菌劑(例如寵物用藥物、寵物食品等)。除動物外，本發(fā)明的抗菌劑還可用作各種植物抗菌劑，或者可用作防腐劑。
在制造本發(fā)明的各種劑型的抗菌劑時，除使用預定量的上述赤竹提取物，還可使用通常藥物組合物、化妝品、皮膚用組合物等可用的油性成分等基材成分、保濕劑、防腐劑等。
抗菌劑中所用的水可以是自來水、天然水、純凈水等，對此沒有特別限定，通常優(yōu)選離子交換水等高純度水。
油性成分有例如角鯊烷、牛脂、豬脂、馬油、羊毛脂、蜂蠟等動物性油；橄欖油、葡萄籽油、棕櫚油、霍霍巴油、胚芽油(例如米胚芽油)等植物油；液體石蠟、高級脂肪酸酯(例如棕櫚酸辛酯、棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯)、硅油等合成油、半合成油。
為適應皮膚的保護、提供滋潤效果(用薄膜覆蓋皮膚表面防止干燥，同時產(chǎn)生柔軟性、彈性的效果)、清爽感等要求，可適當組合使用油性成分。角鯊烷、橄欖油和棕櫚酸辛基十二烷基酯的組合物是一個優(yōu)選例子。
為調(diào)節(jié)抗菌劑的硬度、流動性，可使用硬脂酸、硬脂醇、山萮酸、鯨蠟醇、凡士林等固體油，優(yōu)選組合使用硬脂酸與鯨蠟醇。
為了將本發(fā)明的抗菌劑制造成乳膏組合物，可使用用于將赤竹提取物、水、油性成分制成膏狀的膏化劑，對膏化劑沒有特別限定，通常是將甘油一硬脂酸酯與自乳化型甘油一硬脂酸酯(向甘油一硬脂酸酯中添加乳化劑后形成的物質(zhì))組合使用。
還可以根據(jù)需要使本發(fā)明的抗菌劑含有穩(wěn)定劑、保濕劑、傷口愈合劑、防腐劑、表面活性劑等。
穩(wěn)定劑的例子有羧基乙烯基聚合物與氫氧化鉀的組合、聚乙二醇二硬脂酸酯等。特別是聚乙二醇倍半硬脂酸酯(聚乙二醇二硬脂酸酯與聚乙二醇一硬脂酸酯的1∶1混合物)(聚乙二醇的分子量為1000至2萬)的穩(wěn)定性高，水與油不分離，并且可有效調(diào)節(jié)作為膏狀組合物涂布于皮膚上時的硬度，因而優(yōu)選。
保濕劑的例子有透明質(zhì)酸鈉、膠原、蘆薈提取物(特別優(yōu)選提取自木本蘆薈的蘆薈提取物(2))、尿素、1，3-丁二醇、甘油、海藻糖、山梨糖醇、氨基酸、吡咯烷酮羧酸鈉等。
傷口愈合劑的例子有尿囊素、甘草酸二鉀、甘草提取物、艾提取物等。
由于赤竹提取物本身具有抗菌作用，因而僅輔助性使用防腐劑。例如苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸低級烷基酯(例如甲酯、乙酯、丙酯或丁酯等稱為對羥基苯甲酸酯的化合物)、丙酸鈉、混合脂肪酸酯(癸酸甘油酯、聚甘油-2月桂酸酯、聚甘油-10月桂酸酯的混合物)、苯氧基乙醇、201號感光素(黃色色素)、1，2-戊二醇等，但優(yōu)選對羥基苯甲酸酯、混合脂肪酸酯、1，2-戊二醇。
表面活性劑的例子有N-?；?L-谷氨酸鈉、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯等。
還可以根據(jù)需要含有芳香成分，例如橙油、檸檬油、橙皮油、香料等。
在以上各成分中加入水，再根據(jù)需要加入有機酸，使總量為100％質(zhì)量。
將本發(fā)明抗菌劑制成膏狀組合物時各成分的優(yōu)選混合量(％質(zhì)量)如下表1所示。水分以外的各種成分的混合量是除去水分后的％質(zhì)量。
表1

將上述各成分投入裝備有攪拌葉和優(yōu)選裝備有乳化器的加熱混合釜中，在70-90℃攪拌混合1-2小時，得到本發(fā)明的抗菌劑。
本發(fā)明的抗菌劑除膏狀組合物外，還可以以軟膏、液體、凝膠狀、氣溶膠和其它形態(tài)使用，但膏狀組合物的形態(tài)簡便，且效果也好。另外也可以是洗發(fā)劑、沐浴皂(body soap)、洗面奶等半固體或液體形態(tài)。
清潔患處后，將本發(fā)明的抗菌劑適量涂布，例如以膏狀組合物形式時，每100cm2皮膚涂布0.1-1g左右，每日涂布1-5次，通常涂布1-3次即可。涂布量、涂布次數(shù)可根據(jù)癥狀、傷口的程度適當增減。
經(jīng)口攝取本發(fā)明的抗菌劑時，作為赤竹提取物固體成分，每1kg體重的適合攝取量為0.01-0.1g左右，每日攝取1-5次，通常1-3次。攝取量、攝取次數(shù)可根據(jù)癥狀適當增減。
當將本發(fā)明的抗菌劑以注射劑等形式胃腸外給藥時，作為赤竹提取物固體成分，每1kg體重的適當攝取量為0.01-0.1g左右，每日攝取1-5次，通常1-3次。攝取量、攝取次數(shù)可根據(jù)癥狀適當增減。
通過將本發(fā)明的抗菌劑預先涂布于避孕套上，可預防性病、HIV感染等。
作為本發(fā)明抗菌劑有效成分的赤竹提取物是箬屬的提取物，其1.25％質(zhì)量的水溶液對人胎兒腎臟的293細胞未顯示毒性。
本發(fā)明的抗菌劑含有1-50％質(zhì)量的赤竹提取物固體成分，對破傷風桿菌、引起氣性壞疽的梭菌屬氣性壞疽菌群、念珠菌、發(fā)癬菌、毛霉菌、根霉、曲霉屬菌、隱球菌屬菌、球孢子菌屬菌、ヒト組織胞漿菌屬菌、MRSA等抗生物耐性菌，包括瘡皰丙酸桿菌在內(nèi)的丙酸桿菌屬菌、皰疹病毒、流感病毒、管狀病毒等病毒等顯示顯著的抗菌效果。
本發(fā)明抗菌劑的優(yōu)選實施方式如下所述。
1.含有赤竹提取物(以固體成分計算為1-50％質(zhì)量)、水、油性成分和膏化劑的抗菌劑。
2.上述1中記載的抗菌劑，其中所述油性成分為至少一種選自動物性油、植物性油、合成油和半合成油的物質(zhì)。
3.上述1中記載的抗菌劑，其中所述油性成分為至少一種選自角鯊烷、牛脂、豬脂、馬油、羊毛脂、蜂蠟、橄欖油、葡萄籽油、棕櫚油、霍霍巴油、胚芽油、液體石蠟、棕櫚酸辛酯、棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、硅油、硬脂酸、硬脂醇、山萮酸、鯨蠟醇和凡士林的物質(zhì)。
4.上述1-3中任一項的抗菌劑，其中所述膏化劑為甘油一硬脂酸酯與自乳化型甘油一硬脂酸酯的組合。
5.上述1-4中任一項的抗菌劑，該抗菌劑還含有至少一種選自有機酸、穩(wěn)定劑、保濕劑、傷口愈合劑、防腐劑和表面活性劑的成分。
6.上述5中記載的抗菌劑，其中所述穩(wěn)定劑為至少一種選自羧基乙烯基聚合物與氫氧化鉀的組合、聚乙二醇二硬脂酸酯的物質(zhì)。
7.上述5中記載的抗菌劑，其中所述保濕劑為至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、膠原、蘆薈提取物、尿素、1，3-丁二醇、甘油、海藻糖、山梨糖醇、氨基酸和吡咯烷酮羧酸鈉的物質(zhì)。
8.上述5中記載的抗菌劑，其中所述傷口愈合劑為至少一種選自尿囊素、甘草酸二鉀、甘草提取物和艾提取物的物質(zhì)。
9.上述5中記載的抗菌劑，其中所述防腐劑為至少一種選自苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸低級烷基酯、丙酸鈉、混合脂肪酸酯、苯氧基乙醇、1，2-戊二醇和黃色色素的物質(zhì)。
10.上述5中記載的抗菌劑，該抗菌劑還含有至少一種選自橙油、檸檬油、橙皮油和香料的成分。
11.一種抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物、水、油性成分、膏化劑、穩(wěn)定劑、保濕劑、傷口愈合劑、防腐劑和表面活性劑，其中所述油性成分為至少一種選自角鯊烷、牛脂、豬脂、馬油、羊毛脂、蜂蠟、橄欖油、葡萄籽油、棕櫚油、霍霍巴油、胚芽油、液體石蠟、棕櫚酸辛酯、棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、硅油、硬脂酸、硬脂醇、山萮酸、鯨蠟醇和凡士林的物質(zhì)，所述膏化劑為甘油一硬脂酸酯與自乳化型甘油一硬脂酸酯的組合，所述穩(wěn)定劑為至少一種選自羧基乙烯基聚合物與氫氧化鉀的組合、聚乙二醇二硬脂酸酯的物質(zhì)，所述保濕劑為至少一種選自透明質(zhì)酸鈉、膠原、蘆薈提取物、尿素、1，3-丁二醇、甘油、海藻糖、山梨糖醇、氨基酸和吡咯烷酮羧酸鈉的物質(zhì)，所述傷口愈合劑為至少一種選自尿囊素、甘草酸二鉀、甘草提取物和艾提取物的物質(zhì)，所述防腐劑為至少一種選自苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸低級烷基酯、丙酸鈉、混合脂肪酸酯、苯氧基乙醇和黃色色素的物質(zhì)，所述表面活性劑為N-?；?L-谷氨酸鈉。
12.上述11中記載的抗菌劑，該抗菌劑還含有至少一種選自橙油、檸檬油、橙皮油和香料的成分。
13.上述1中記載的抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物、水、角鯊烷、橄欖油、甘油一硬脂酸酯、自乳化型甘油一硬脂酸酯、羧基乙烯基聚合物、氫氧化鉀、尿素、1，3-丁二醇、尿囊素、對羥基苯甲酸低級烷基酯、硬脂酸、N-?；?L-谷氨酸鈉、檸檬油。
14.上述1中記載的抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物、水、角鯊烷、橄欖油、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、鯨蠟醇、甘油一硬脂酸酯、自乳化型甘油一硬脂酸酯、羧基乙烯基聚合物、氫氧化鉀、尿素、1，3-丁二醇、尿囊素、混合脂肪酸酯、硬脂酸、N-酰基-L-谷氨酸鈉、橙油。
15.上述1-14中任一項記載的抗菌劑，該抗菌劑含有聚乙二醇倍半硬脂酸酯。
16.上述1-15中任一項記載的抗菌劑，其中有機酸為至少一種選自蘋果酸、檸檬酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、乙酸、苯甲酸、苯乙酸、水楊酸和酚類的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供含有赤竹提取物和有機酸的抗菌性組合物。本發(fā)明抗菌性組合物的優(yōu)選形式還有油墨、涂料、食品添加劑、飲料、寵物食品、塑料制品和粘結(jié)劑。
當采用食品添加劑、飲料(清涼飲料、果汁、蔬菜汁、酒類(日本酒、啤酒、發(fā)泡酒、威士忌、燒酒、伏特加、葡萄酒、白蘭地)等水性材料作為這些抗菌性組合物的原料時，可以向這些原料中加入赤竹提取物和有機酸進行混合?？梢栽谥圃煸现?、制造過程中、制造后的任何階段添加。添加赤竹提取物和有機酸后，在70-90℃攪拌混合處理1-2小時，這樣可進一步提高抗菌性。食品添加劑、飲料等抗菌性組合物中的赤竹提取物含量優(yōu)選為0.1-20％質(zhì)量，更優(yōu)選為0.25-7％質(zhì)量。
當采用油墨、涂料、塑料制品、粘結(jié)劑等作為這些抗菌性組合物的原料時，若這些原料是親水性的，則與上述情況一樣，可以將赤竹提取物和有機酸添加到原料中進行混合?？梢栽谠现圃烨?、制造過程中、制造后的任何階段添加。另一方面，若這些原料為疏水性(親油性)，則很多情況下赤竹提取物和有機酸難以混合。這時，最好采取下述方法改善與原料的混合性將赤竹提取物或者赤竹提取物和有機酸的混合物與表面活性劑(乳化劑)或親水性有機溶劑(例如甲醇、乙醇等醇類；丙酮等酮類；乙酸乙酯等酯類；吡啶；二甲基甲酰胺等)結(jié)合使用，改善混合性；或者將赤竹提取物或者赤竹提取物和有機酸的混合物預先用親油性材料進行微膠囊化等。任何情況下都可在添加赤竹提取物和有機酸后，通過在70-90℃攪拌混合處理1-2小時，使抗菌性進一步得到提高。
使用油墨、涂料、塑料制品、粘結(jié)劑等作為原料時，本發(fā)明抗菌性組合物中赤竹提取物的含量優(yōu)選為1-20％質(zhì)量，更優(yōu)選為3-7％質(zhì)量，有機酸的含量優(yōu)選為0.1-10％質(zhì)量，更優(yōu)選為3-7％質(zhì)量。
特別優(yōu)選的有機酸是蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等。
本發(fā)明的抗菌性組合物與不含本發(fā)明抗菌劑的物質(zhì)相比，具有顯著的抗菌性，油墨、涂料作為抗菌性建材不用說自然是適用于一般家庭的，作為有可能發(fā)生院內(nèi)感染的醫(yī)院或公共建筑用的建材也是極為有用的。
下面，給出參考例、實施例和試驗例，進一步詳細說明本發(fā)明。參考例1赤竹提取物的制備將9月份在北海道天鹽山系采集的赤竹干燥葉放入加壓熱水提取罐中，在125℃處理10分鐘，用冷卻水將熱水冷卻至80℃，將提取物與含水固體成分通過螺旋壓力機分離，使含水率為約50％質(zhì)量。然后將約50％質(zhì)量含水固體成分放入高壓釜中，在180℃用飽和水蒸氣加壓熱處理10分鐘。將處理后的含水固體成分再次放入加壓熱水提取罐中，在110℃處理5分鐘，抽提出提取物。合并第一次和第二次的提取物，經(jīng)硅藻土過濾，減壓濃縮至固體成分為50％質(zhì)量，在110-130℃進行流動滅菌處理，得到赤竹提取物。
該赤竹提取物中的硫含量為3850μg/ml(7.7mg/lg固體成分)。
參考例2分析赤竹提取物(Bambuseae Sasa)(從株式會社鳳凰堂獲得)的成分，得到下述結(jié)果。
水 59.5％質(zhì)量蛋白質(zhì) 8.6脂質(zhì)0.6礦物質(zhì) 9.0碳水化合物 19.8單寧酸 2.5實施例1-4將下述表2中的成分以表2所示質(zhì)量比混合，投入裝有攪拌葉和乳化器的加熱混合釜，在80℃攪拌混合2小時，得到本發(fā)明的抗菌劑。實施例1-4中固體成分濃度8％質(zhì)量的赤竹提取物(將參考例1中制備的固體成分50％質(zhì)量的赤竹提取物用水稀釋而成)的添加量分別為12.5、25、37.5和75％質(zhì)量(因此，赤竹提取物固體成分的含量為1、2、3和6％質(zhì)量，100g抗菌劑中的硫含量為7.7mg、15.4mg、23.1mg和46.2mg)。
表2


比較例1將固體成分濃度8％質(zhì)量的赤竹提取物(將參考例1中制備的固體成分50％質(zhì)量的赤竹提取物用水稀釋而成)的添加量改為6.2％質(zhì)量(從而赤竹提取物固體成分的含量為0.5％質(zhì)量，100g抗菌劑中的硫含量為3.8mg)，除此之外與實施例1一樣操作，制得比較例1的抗菌劑。
實施例5將下述表3中的成分以表3所示質(zhì)量比混合，與實施例1-4同樣操作，制得本發(fā)明的抗菌劑。
表3


100g該抗菌劑中的硫含量為46.2mg。
實施例6將下述表4中的成分以表4所示質(zhì)量比混合，投入裝有攪拌葉和乳化器的加熱混合釜中，在80℃攪拌混合2小時，制得本發(fā)明的抗菌劑。
表4


該膏的pH為6.00。
實施例7將下述表5中的成分以表5所示質(zhì)量比混合，投入裝有攪拌葉和乳化器的加熱混合釜中，在80℃攪拌混合2小時，制得本發(fā)明的抗菌劑膏。
表5


該膏的pH為4.68。
實施例8-10不添加dl-蘋果酸，將赤竹提取物(固體成分含量50％質(zhì)量)的量變?yōu)?6％質(zhì)量、20％質(zhì)量和30％質(zhì)量，并調(diào)節(jié)純凈水的量，除此之外與實施例7一樣操作，制得赤竹提取物固體成分含量為8％質(zhì)量、10％質(zhì)量和15％質(zhì)量的本發(fā)明抗菌劑膏。
實施例11-13將赤竹提取物(固體成分含量50％質(zhì)量)的量變?yōu)?6％質(zhì)量、20％質(zhì)量和30％質(zhì)量，并調(diào)節(jié)純凈水的量，除此之外與實施例7—樣操作，制得赤竹提取物固體成分含量為8％質(zhì)量、10％質(zhì)量和15％質(zhì)量的本發(fā)明抗菌劑膏。
試驗例1(對破傷風桿菌的抗菌活性)使用26株破傷風梭菌(Clostridium tetani)。這些菌株是從日本的土壤中分離得到的。使用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為對照。
將參考例1中制備的赤竹提取物(赤竹提取物固體成分含量為50％質(zhì)量)用無菌蒸餾水稀釋，制成赤竹提取物水溶液。
通過瓊脂平板稀釋法測定各種濃度赤竹提取物水溶液的最低抑菌濃度。制作改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使最終濃度為12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.19、0.10％質(zhì)量。將赤竹提取物水溶液與2倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。為防止破傷風桿菌畸變，將瓊脂濃度補正到3％。在瓊脂被調(diào)節(jié)到3％的改良GAM瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，用接種環(huán)將得到的受試菌株的菌落取出，使其懸浮于厭氧菌培養(yǎng)液(Difco)中，將濁度調(diào)節(jié)至Mc Farland No.1。將其1μl(接種量105cfu)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。對照菌株則使用血液瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，在厭氧菌培養(yǎng)液(Difco)中，將濁度調(diào)節(jié)至McFarland No.0.5，將其1μl(接種量105cfu)通過劃線法進行接種。另外，在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)18小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
通過該方法測定的赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922和葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌濃度都為3.13％質(zhì)量。
對26株破傷風桿菌最低抑菌濃度分布在0.78％質(zhì)量至0.19％質(zhì)量。結(jié)果如表6所示。赤竹提取物對80％或50％菌株的破傷風桿菌所用菌株的最低抑菌濃度(MIC80％和MIC50％)分別為0.78％和0.39％。
表6


破傷風是以土壤中存在的破傷風桿菌的芽胞與土壤一起侵入傷口部位為契機而發(fā)病的疾病。芽胞在局部發(fā)芽、增殖并產(chǎn)生毒素(破傷風痙攣毒素)，這是發(fā)病必不可少的條件。受污染的傷口部位容易形成芽胞發(fā)芽所需的厭氧環(huán)境，因此預防破傷風的根本是進行稱為清創(chuàng)術(shù)的適當外科處置，除去侵入的異物、壞死組織等，阻止傷口部位形成厭氧性環(huán)境，防止破傷風桿菌的增殖。
如表6所示，赤竹提取物以0.78％的低濃度即可完全抑制所有26株破傷風桿菌的增殖?？芍嘀裉崛∥锏目咕钚允菍Υ竽c桿菌、葡萄球菌的抗菌活性的4倍以上。
對在與不含赤竹提取物的培養(yǎng)基中的生長沒有差別的濃度(0.19％)下進行菌株生長而得到的破傷風桿菌進行單一染色并用顯微鏡觀察，可觀察到菌體形成絲狀和菌體膨脹出現(xiàn)溶菌的圖象。在菌株生長與不含赤竹提取物的培養(yǎng)基中的生長相比明顯得到抑制的濃度(0.38％)下，可見顯色性差的菌體，且可容易地見到具有芽胞的菌體。在電子顯微鏡水平已觀察到，葡萄球菌中顯示胞壁的形成受到阻礙。通過對抗生物質(zhì)的研究可知，在最低抑菌濃度以下的濃度所見到的絲狀形成是在分裂時向毛句的氣形成受到阻礙時所見到的現(xiàn)象。
氣性壞疽是具有與破傷風類似的發(fā)病機理的與外傷相關(guān)連的疾病，赤竹提取物對引起氣性壞疽的幾種厭氧菌即產(chǎn)氣莢膜梭菌(Closdtridium perfringens)、敗毒梭菌(Clostridium septicum)、雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)等氣性壞疽菌群的抗菌活性以及引起膿性感染的無芽同胞厭氧菌的抗菌活性也受到關(guān)注。
試驗例2(對念珠菌的抗菌活性)研究實施例8-13中配制的赤竹提取物以及含有赤竹提取物和蘋果酸的膏狀組合物對念珠菌(白色念珠菌(Candida albicans)臨床分離株)的抗菌活性。
所用培養(yǎng)基·NB培養(yǎng)基添加0.2％肉膏的普通肉湯(榮研化學)·1/50 NB培養(yǎng)基將NB培養(yǎng)基用磷酸緩沖液稀釋至50倍，并將pH調(diào)節(jié)至7.2±0.2。
·SCDLP肉湯(榮研化學)·SA培養(yǎng)基標準瓊脂培養(yǎng)基(日水制藥)菌液的調(diào)整在實施試驗前一天，將純培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)菌以約108個/ml懸浮于1/50NB培養(yǎng)基中，將Mc Farland調(diào)節(jié)至0.5。再用1/50NB培養(yǎng)基將菌液稀釋100倍(約106個/ml)。
將膏狀組合物在60℃加熱10分鐘，使膏狀組合物熔融。將1ml熔融后的膏狀組合物滴加到丙烯酸酯板(50mm×50mm)上，在室溫下放置10分鐘，使其固化。將0.5ml菌液滴加到膏狀組合物涂布面上，在其上將緊密貼合丙烯酸酯板(45mm×45mm)。將其在高濕度下于36℃培養(yǎng)24小時。
向無菌玻璃皿中裝入10ml的SCDLP肉湯，將培養(yǎng)24小時后的丙烯酸酯板移入其中，用肉湯沖洗丙烯酸酯板。取其100μl，滴加到SA培養(yǎng)基上，將其均勻涂抹展開，培養(yǎng)48小時后，測定菌數(shù)，換算成每1塊丙烯酸酯板上的菌數(shù)。結(jié)果如表7所示。
表7


對照實施例7中未添加dl-蘋果酸和赤竹提取物。
含有赤竹提取物但不含蘋果酸的膏狀組合物(試驗編號3-5)對念珠菌基本上沒有抗菌活性，但含有赤竹提取物和蘋果酸的膏狀組合物(試驗編號6-8)，特別是赤竹提取物濃度為10％質(zhì)量以上時顯示出高抗菌活性。
試驗例3(對皰疹病毒的治愈效果)將實施例7中制備的膏狀組合物(赤竹提取物固體成分含量為6％質(zhì)量)在皰疹病毒感染患者(60歲、女)的患處(口角)每日適量涂布2次，2天內(nèi)癥狀明顯減輕，3天完全治愈。
試驗例4(對來自粉刺患者病灶的菌株的分析)從粉刺患者的病灶分離得到下述44株金黃色葡萄球菌和26株丙酸桿菌屬菌。
表8


上述44株金黃色葡萄球菌的抗生物質(zhì)敏感性如下所述。(μg/ml)表9

上述26株丙酸桿菌屬菌的抗生物質(zhì)敏感性如下所述。(μg/ml)表10

試驗例5(參考例2的赤竹提取物的抗菌性)在瓊脂培養(yǎng)基上，通過2倍稀釋法研究參考例2的赤竹提取物(赤竹單寧酸)和市售的單寧酸(批號02060618，Extrasynthese，Geney，F(xiàn)rance)的抗菌性(MIC(mg/ml)最低抑菌濃度)。結(jié)果如下所示。
表11

()內(nèi)的數(shù)值是作為赤竹單寧酸的MIC值。
試驗例6(參考例2的赤竹提取物的抗菌性)用試驗例4中從粉刺患者的病灶分離得到的44株葡萄球菌屬細菌(混合物)和26株丙酸桿菌屬菌(混合物)，在瓊脂培養(yǎng)基上，通過2倍稀釋法研究參考例2的赤竹提取物(赤竹單寧酸)和市售的單寧酸(批號02060618，Extrasynthese，Geney，F(xiàn)rance)的抗菌性(MIC(mg/ml)抑制生育的最低濃度)。結(jié)果如下所示。將葡萄球菌的菌株在MH瓊脂(Mueller Hinton瓊脂(BBL))培養(yǎng)基上、pH7.0、空氣中、37℃培養(yǎng)24小時，將丙酸桿菌在GAM培養(yǎng)基、pH7.0、厭氧環(huán)境中、35℃培養(yǎng)48小時。市售單寧酸的MIC80對葡萄球菌屬菌群為0.04mg/ml，對丙酸桿菌為0.08mg/ml。
表12

實施例14向100質(zhì)量份水性油墨中加入6質(zhì)量份參考例1中制備的赤竹提取物和10質(zhì)量份dl-蘋果酸，在80℃混合加熱處理2小時，得到抗菌性油墨。
實施例15向100質(zhì)量份水性涂料中加入6質(zhì)量份參考例1中制備的赤竹提取物和10質(zhì)量份dl-蘋果酸，在80℃混合加熱處理2小時，得到抗菌性涂料。
實施例16向100質(zhì)量份日本酒中加入3質(zhì)量份參考例1中制備的赤竹提取物和0.25質(zhì)量份dl-蘋果酸，在80℃混合加熱處理3小時，得到抗菌性日本酒。
實施例17向100質(zhì)量份水性粘結(jié)劑中加入6質(zhì)量份參考例1中制備的赤竹提取物和10質(zhì)量份dl-蘋果酸，在80℃混合加熱處理2小時，得到抗菌性粘結(jié)劑。
試驗例7(對10株氣性壞疽菌群產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗菌作用)所用菌株使用了1株產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124和9株臨床分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌(GAI-92099、GAI-92100、GAI-92101、GAI-92102、GAI-92103、GAI-92104、GAI-92105、GAI-92106、GAI-92107)合計10株。這些臨床分離菌株是從感染患者的臨床材料中分離得到、保存于岐阜大學醫(yī)學部附屬厭氧菌實驗設(shè)施(以下稱為“所述設(shè)施”)的菌株。另外，用大腸桿菌ATC25922作為評價抗菌能力的精度控制用菌株。
赤竹提取物溶液的固體成分濃度為50％，包含水溶性蛋白·氨基酸、礦物質(zhì)、單寧酸、糖類、水溶性多糖、羧酸、總?cè)~綠素、硅酸、維生素、脂質(zhì)、精油、水分。原液的pH約為5.0。使用無菌蒸餾水稀釋溶液。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度，以％表示。制備赤竹提取物的2倍稀釋水溶液系列，使終濃度為25％至0.2％。將赤竹提取物稀釋液與改良GAM瓊脂培養(yǎng)基(2倍)以1∶1混合，制成最終含有12.5-0.1％濃度的赤竹提取物的改良GAM瓊脂培養(yǎng)基。在改良GAM瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，將得到的受試菌株的菌落用無菌棉棒取出，使其懸浮于厭氧菌肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其10μl(接種量106cfu)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。對于對照菌株大腸桿菌，則用TSA瓊脂培養(yǎng)基(Difco)上的菌落，在厭氧菌肉湯中將濁度調(diào)節(jié)至Mc Farland No.0.5，將其10μl(接種量105cfu)通過劃線法進行接種。并在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)18小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。通過本方法測定的赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度都為3.13％。
結(jié)果抑制10株產(chǎn)氣莢膜梭菌生長所必需的赤竹提取物的最低濃度分布于3.13-6.25％。抑制80％或50％的產(chǎn)氣莢膜梭菌所用菌株生長的赤竹提取物濃度為6.25％。
表13赤竹提取物對10株產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗菌作用

考察氣性壞疽是以存在于土壤中稱為氣性壞疽菌群的1群梭菌的芽胞與土壤一起侵入傷口部位為契機而發(fā)病的疾病。已知產(chǎn)氣莢膜梭菌、敗毒梭菌、雙酶梭菌等都是病原菌，但氣性壞疽病例的80％是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引發(fā)的。已知氣性壞疽是通過急救外科的適當治療可充分預防的疾病，但在外科處置太遲的情況下，或者外科處置不十分恰當?shù)那闆r下，在受傷后6小時以后發(fā)病，經(jīng)過劇烈的過程，最后引起死亡?；蛘?，為了挽救生命，只能切除四肢等患處，這是醫(yī)療上不能輕視的一種疾病。
根據(jù)這次試管階段的研究結(jié)果可知，雖然赤竹提取物對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抗菌作用比不上試驗例1中所探討的對破傷風梭菌的作用，但以3.13％以上～6.25％以下的濃度即可完全抑制10株產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖。因此，含浸有這種濃度水平的赤竹提取物的患處保護布等超過了對產(chǎn)氣莢膜梭菌的最低抑菌濃度，在受傷后接受外科醫(yī)生的適當治療之前，作為應急處理用于人體時，可以說具有抑制受傷部位的產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)芽或其發(fā)芽后的增殖的作用。
試驗例8(對產(chǎn)氣莢膜梭菌以外的氣性壞疽菌群的抗菌作用)所用菌株使用從來自感染患者的臨床材料分離得到的或保存于所述設(shè)施的參考菌株。用大腸桿菌ATC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923作為評價抗菌能力的精度控制用菌株。使用與試驗例7一樣的試驗液。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度，以％表示。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂培養(yǎng)基，使終濃度為8％至0.125％。將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7.0。在改良GAM瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，將得到的受試菌株的菌落通過無菌棉棒取出，使其懸浮于厭氧菌肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其10μl(接種量106cfu)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。對于對照菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，則用TSA瓊脂培養(yǎng)基(Difco)上的菌落，在厭氧菌肉湯中將濁度調(diào)節(jié)至Mc Farland No.0.5，將其10μl(接種量105cfu)通過劃線法進行接種。并在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)18小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。結(jié)果如表14所示。
表14赤竹提取物對氣性壞疽菌群梭菌的抗菌作用

考察可知赤竹提取物可抑制諾氏梭菌和生孢梭菌生長的濃度為3％，可抑制敗毒梭菌生長的濃度為3-5％，可抑制雙酶梭菌、索氏梭菌生長的濃度為5-7％。即，雖然赤竹提取物對與氣性壞疽相關(guān)的梭菌的抗菌作用因菌種不同而存在差異，但只要具有7％的濃度，則可抑制所用全部菌株的增殖。為預防氣性壞疽而對傷口部位使用本提取物時，最好在pH7的條件下，設(shè)定為7％的濃度。
試驗例9(對16株瘡皰丙酸桿菌的抗菌作用)所用菌株使用瘡皰丙酸桿菌ATCC11827和15株臨床分離菌株(GAI-10341、GAI-10342、GAI-10343、GAI-10344、GAI-10345、GAI-10346、GAI-10347、GAI-10348、GAI-10349、GAI-10350、GAI-10351、GAI-10352、GAI-10353、GAI-10354、GAI-10355)合計16株。這些臨床分離株是從皮膚科感染患者分離得到并保存于所述設(shè)施的菌株。使用與試驗例7一樣的試驗液。使用無菌蒸餾水進行稀釋。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度。以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為12.5、6.25、3.13、1.56、0.78％。將赤竹提取液與2倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。不對pH進行調(diào)節(jié)。
在布魯氏菌HK半流動培養(yǎng)基(極東制藥)上培養(yǎng)48小時，從得到的受試菌株的濃厚生長部位取1接種環(huán)菌株，通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在本實驗條件下，1接種環(huán)含有108/ml的細菌數(shù)。在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)2天后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
結(jié)果完全抑制16株瘡皰丙酸桿菌生長所需的赤竹提取物的最低濃度(MIC)為6.25％(表15)。赤竹提取物對16株瘡皰丙酸桿菌中的12株，在3.13％時比不含赤竹提取物的對照培養(yǎng)基具有更顯著的生長抑制作用，完全抑制需要6.25％。
表15赤竹提取物對16株瘡皰丙酸桿菌的抗菌作用


考察雖然抑制與尋常痤瘡相關(guān)的金黃色葡萄球菌所需的赤竹提取物濃度為3.13％，但在本試驗例的探討中，完全抑制瘡皰丙酸桿菌所有菌株所需的赤竹提取物濃度在3.13％以上～6.25％以下的濃度范圍內(nèi)。因為瘡皰丙酸桿菌與金黃色葡萄球菌都是重要的尋常痤瘡加重因子，所以當目的在于治療尋常痤瘡時，能完全抑制瘡皰丙酸桿菌生長的適當濃度可考慮6.25％左右。
現(xiàn)在還不明白赤竹提取物具有這樣的抗菌作用的機理，其原因有可能是作為植物的赤竹提取物與至今為止來自放線菌或來自真菌的各種抗菌藥具有不同的作用機理，耐藥性表達這方面也值得研究。
試驗例10(對26株來自粉刺的瘡皰丙酸桿菌的抗菌作用)所用菌株使用總共26株瘡皰丙酸桿菌臨床分離株。這些臨床分離株是分離自粉刺患者并保存于所述設(shè)施的菌株。使用與試驗例7一樣的試驗液，是濃度為50％的酸性(pH5.0左右)溶液。使用無菌蒸餾水進行稀釋。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度。以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％。將pH調(diào)節(jié)至7.0附近。將在GAM瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落懸浮于厭氧菌肉湯中，調(diào)整為含有預定菌數(shù)的菌液。在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)2天后，通過肉眼觀察有沒有生長。
結(jié)果與考察以下，參考地給出對各種抗菌藥的敏感性分布，雖然這不是與本試驗同時進行得到的結(jié)果。本試驗與在未調(diào)節(jié)pH情況下實施的上一試驗不同，終點的判定很困難。
表16瘡皰丙酸桿菌(26株)對赤竹提取物和各種抗菌藥的敏感性

試驗例11(赤竹提取物對乳桿菌的抗菌作用)所用菌株使用表17所示的由機構(gòu)保存的參考菌株。這些菌株是從ATCC、JCM購入并保存于所述設(shè)施的菌株。從細菌性陰道病婦女的陰道內(nèi)或婦科領(lǐng)域感染中可較高頻率分離的代表性菌種中選取二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉單胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)ATCC25260、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)N-1、N-2作為對照。另外，出于同樣的目的，用大腸桿菌ATC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為敏感性測定的精度控制用菌株。試驗液與試驗例7相同。
用無菌蒸餾水稀釋赤竹提取物原液，放置一會兒后，有時會生成棕褐色的沉淀物，與培養(yǎng)基混合稀釋時，要將其充分攪拌混合使用。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度(MIC)。以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％。對于10％-6％的高濃度區(qū)域，分別用20％-12％的赤竹提取液與2倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合制作(最終pH5.3-5.5)，對5％-0.5％的低濃度區(qū)域，將50％-5％的赤竹提取液與1倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合(最終pH5.5-6.0)，制成含有赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。
另外，這次抗菌能力的探討除在酸性(pH5.3-6.0)條件下外，在更弱酸性至環(huán)境酸性下實施。將添加赤竹提取物后的pH用2N的NaOH水溶液調(diào)節(jié)至pH6.5-7.0，制作調(diào)整后的培養(yǎng)基。
接種菌的調(diào)整在布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，將轉(zhuǎn)移得到的受試菌株的菌落用無菌棉棒取出，使其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整濁度為Mc Farland No.1。將其10μl(接種量106cfu)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。對于對照菌株，則用TSA瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，在厭氧菌肉湯MIC中將濁度調(diào)節(jié)至Mc Farland #1，將其10μl(接種量106cfu)通過劃線法進行接種。這次，對大腸桿菌ATC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923，同時測定Mc Farland#1/2、1/2的10倍稀釋液、1/2的100倍稀釋液的MIC，探討接種菌量對MIC的影響。
在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)18小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
結(jié)果在未調(diào)節(jié)pH的酸性(pH5.3-6.0)實驗條件下測定的赤竹提取物的最低抑菌濃度如表17所示。對于干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacilluscasei ss.casei)、短乳桿菌短亞種(Lactobacillus brevis ss.brevis)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)4菌種4株為7-8％，對除該4菌種4株外的另外5菌種5株為10％以上。另外，對于同時測定的二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉單胞菌ATCC25260的最小抑菌濃度都是0.5％；對于2株赤竹提取物的精度控制用菌株大腸桿菌ATC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923，通過本方法測定的最低抑菌濃度都為4％。
在調(diào)節(jié)pH(pH6.8-7.1)的實驗條件下測定的赤竹提取物的最低抑菌濃度如表1所示。對短乳桿菌短亞種、嗜酸乳桿菌這2菌種2株是7％，對除該2菌種2株外的另外7菌種7株為＞＝9％。二路普雷沃氏菌為1％，不解糖卟啉單胞菌為0.5％。大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC為6％。
在求調(diào)節(jié)pH(pH6.4-7.0)條件下的MIC時，用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923探討接種菌量對MIC的影響。結(jié)果，在使用1接種環(huán)量的濁度為Mc Farland#1-1/2(＞108/ml)的金黃色葡萄球菌菌液時，MIC為6％，在使用Mc Farland#1/2的10倍(107/ml)、100倍稀釋液(106/ml)時，MIC為3％。雖然大腸桿菌隨接種菌量的變化，菌的生長程度在subMIC區(qū)域階段性地變差，但讀取的MIC值沒有變動，都是6％。
考察由上述試驗可知，赤竹提取物以6.25％-3.13％以下的濃度即可抑制一些病原性細菌的生長。除赤竹提取物對這些病原性細菌的抗菌能力外，積累關(guān)于其對非病原性細菌的抗菌能力的信息也是極為重要的，因此實施了本試驗例。
從機體防御的觀點考慮，多數(shù)乳桿菌在人粘膜中都扮演著重要的角色。本發(fā)明人已從29名健康孕婦的陰道分離出了91株乳桿菌，對這些乳桿菌進行詳細鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌(Lactobaciluscrispatus)最多，有48株(52.7％)，加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)次之，有19株(20.85％)，然后是陰道乳桿菌(Lactobacillus vaginalis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、唾液乳桿菌等。其中，100％的卷曲乳桿菌產(chǎn)生過氧化氫，是產(chǎn)量很多的乳桿菌的代表性菌種，并且認為其與不是100％但據(jù)報道存在產(chǎn)生過氧化氫的菌株的加氏乳桿菌、陰道乳桿菌這2個菌種一起，在女性的陰道和子宮粘膜內(nèi)的感染防御機構(gòu)中起著特別重要的作用。通過這次探討可知，赤竹提取物對作為產(chǎn)生過氧化氫的乳桿菌的卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌的抗菌作用MIC為10％以上，與同時實施的對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等代表性病原性兼性菌的MIC為4％以及對二路普雷沃氏菌、不解糖卟啉單胞菌、脆弱擬桿菌等代表性化膿性厭氧菌的MIC為0.5-4％相比，其抗菌作用特別弱。
并且已知，赤竹提取物溶液具有與陰道內(nèi)環(huán)境的pH相近的pH，在中性條件下比在堿性條件下能發(fā)揮更強的抗菌作用，而在酸性條件下又比在中性條件下能發(fā)揮更強的抗菌作用。將對參考菌株大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌能力低2管左右的pH稍微移到中性附近，即使在這樣的弱酸性實驗條件下，乳桿菌的MIC也沒有大的變化。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在孕婦、新生兒的腸道中可較高比率地分離出加氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、類干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌、唾液乳桿菌、卷曲乳桿菌等，但這些乳桿菌中，相對于除陰道分離率高的卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌以外的乳桿菌，MIC顯示出7％以上的高值。
這表明赤竹提取物對作為陰道內(nèi)有益菌、消化道內(nèi)有益菌的乳桿菌的抗菌能力，與被評價為具有更強病原性的細菌種相比，前者通常更弱。這預示著當打算同時在婦科陰道、消化道使用赤竹提取物時，這一點有可能成為對于本物質(zhì)來說極其優(yōu)異的特點。
表17赤竹提取物對乳桿菌群的抗菌作用


*接種菌量Mc Farland#1的1接種環(huán)量試驗例12(對大腸桿菌、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抗菌作用)本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)赤竹提取物對作為各種化膿性感染病原菌的極為重要的大腸桿菌、對各種抗菌藥表現(xiàn)出多重耐藥性的甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)、與MRSA一樣對多種抗菌藥具有很強耐藥傾向的綠膿桿菌等具有抗菌作用。本發(fā)明人一直都是通過以改良GAM瓊脂培養(yǎng)基作為敏感性測定培養(yǎng)基的瓊脂平板稀釋法測定赤竹提取物對厭氧菌的抗菌作用，其中所述改良GAM瓊脂培養(yǎng)基是對厭氧菌而言受到推薦的培養(yǎng)基。
本試驗例中，分別使用10株以上從患者分離得到的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌這些兼性菌和需氧菌，以對兼性菌而言受到推薦的Mueller Hinton Agar作為測定培養(yǎng)基，通過瓊脂平板稀釋法研究赤竹提取物對這些菌種的抗菌作用。
材料和方法所用菌株使用保存于設(shè)施中的臨床分離株14株大腸桿菌、14株甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌和13株綠膿桿菌。另外，使用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為測定敏感性的精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。使用無菌蒸餾水稀釋溶液。
抗菌試驗按照抗菌藥對兼性菌的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度(MIC)。盡可能以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的Muellar Hinton瓊脂平板(Difco)，使最終濃度為7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032％。對于7％-6％的高濃度區(qū)域，分別用14％-12％的赤竹提取液與2倍濃度的Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合制作，對5％-0.032％的低濃度區(qū)域，將50％-0.32％的赤竹提取液與1倍濃度的MuellerHinton瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合，制成含有赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。用2N的NaOH水溶液將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH6.5-7.3。
另外，不用Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基，而用改良GAM瓊脂培養(yǎng)基[日水制藥]制備含有赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基，使用相同的接種菌液，接種大腸桿菌和MRSA，進行一晚厭氧性培養(yǎng)，求出MIC。此時也用2NNaOH將pH調(diào)節(jié)至6.7-7.3。
接種菌液的調(diào)整和判定在TSA瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48小時，將得到的受試菌株的菌落通過無菌棉棒取出，使其懸浮于Mueller Hinton肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其10μL懸浮于1ml MuellerHinton肉湯中，將其5μl通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。
在35℃有氧環(huán)境下培養(yǎng)20小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。將厭氧培養(yǎng)后的平板在進行了一夜培養(yǎng)并判定后，再在大氣環(huán)境下放置一夜，判定其有沒有再增殖。
結(jié)果在調(diào)整了pH(pH6.5-7.3)的實驗條件下測定的赤竹提取物對大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分布于2-3％，MIC50％為2％。對MRSA的MIC分布于0.25-0.5％，MIC50％為0.5％。對綠膿桿菌所有菌株的MIC為1％。
在本次用Mueller Hinton培養(yǎng)基進行的中性環(huán)境、需氧性培養(yǎng)的實驗條件下，對精度控制用菌株大腸桿菌ATCC25922的MIC為2％，對金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC為0.5％。
用改良GAM瓊脂培養(yǎng)基，在厭氧性環(huán)境下測定的赤竹提取物對14株大腸桿菌臨床分離株的MIC50％為8％，對14株金黃色葡萄球菌臨床分離株的MIC50％為3％。對于精度控制用菌株而言，在用改良GAM瓊脂培養(yǎng)基的中性環(huán)境、厭氧性環(huán)境中對大腸桿菌ATCC25922的MIC為8％，對金黃色葡萄球菌ATCC25923為3％。
考察本試驗例中，從通過盡可能接近日本化學療法學會MIC測定標準法的赤竹提取物的MIC測定結(jié)果，可確認赤竹提取物對MRSA、綠膿桿菌，在大致為中性的環(huán)境中都顯示出1％以下的MIC，具有極強的抗菌作用。
我們知道，有些藥物對細菌的MIC隨測定所用培養(yǎng)基的成分、pH、有無血液等添加物、接種菌量、培養(yǎng)環(huán)境等各種實驗條件而變化。本發(fā)明人以破傷風梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、瘡皰丙酸桿菌、脆弱擬桿菌等為對象研究了赤竹提取物的MIC，這些細菌都是在營養(yǎng)學上需要復雜的成分且只在不存在游離氧的厭氧性環(huán)境下才生長的厭氧菌。進行這些測定時，使用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為精度控制用菌株，但未曾將赤竹提取物對這些精度控制用菌株在厭氧性環(huán)境下的MIC與在通常用于兼性菌的測定環(huán)境下的MIC同時進行比較。這次對這一點進行了探討，明確了其差別。以改良GMI瓊脂培養(yǎng)基作為敏感性測定培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在厭氧性環(huán)境下測定的赤竹提取物的MIC，對大腸桿菌ATCC25922為7％以上，與用Mueller Hinton培養(yǎng)基進行需氧培養(yǎng)下測得的2％相比，可觀察到向耐藥性一側(cè)的大幅移動。并且，對于金黃色葡萄球菌ATCC25923也是如此，在厭氧性環(huán)境下測定的赤竹提取物的MIC為3％，與用Mueller Hinton培養(yǎng)基進行需氧培養(yǎng)下測定的0.5％相比，可見到向耐藥性側(cè)的大幅移動。赤竹提取物在與厭氧菌一樣的測定環(huán)境下測得的對14株MRSA的MIC90％為3％。厭氧培養(yǎng)下的金黃色葡萄球菌由于形成抑制生長的露滴狀菌落，因而有時難以判定其增殖終點。將已判定過的平板再在有氧環(huán)境下放置一夜，確認露滴狀菌落是否發(fā)生再增殖時，有3例中，判定為生長陽性的點經(jīng)過一夜培養(yǎng)后未見其再增殖，所以測定赤竹提取物在厭氧性培養(yǎng)下的抗菌能力時，如果將金黃色葡萄球菌ATCC25923用于精度控制，并見到露滴狀菌落，則需要先確認有沒有再增殖能力等，對MIC的確定方法有必要進行重新考慮。由上述可知，在與厭氧菌相同的條件下測定的兼性菌的MIC向耐藥性側(cè)移動了6-8倍。其原因是由于MullerHinton瓊脂與改良GAM瓊脂的培養(yǎng)基成分不同，還是由于通過抗菌藥氨基葡糖苷所見到的厭氧培養(yǎng)與需氧培養(yǎng)的不同，這是引起人們的興趣之處，但對使用Mueller Hinton瓊脂的需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)的MIC進行比較研究得知，大腸桿菌ATCC25922在用Mueller Hinton瓊脂進行的厭氧培養(yǎng)下的MIC與需氧培養(yǎng)下的,MIC相同，而金黃色葡萄球菌ATCC25923盡管與大腸桿菌ATCC25922的實驗條件一樣，其厭氧培養(yǎng)下的MIC卻比需氧培養(yǎng)下的MIC高4倍等隨菌種不同而不同的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象可能是各種因素結(jié)合并相互作用所致。
表18赤竹提取物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分布

*需氧性Mueller Hinton瓊脂、需要性培養(yǎng)厭氧性改良GAM瓊脂培養(yǎng)基、厭氧性培養(yǎng)綠膿桿菌的厭氧性培養(yǎng)未實施參考表19以Muller Hinton Agar作為敏感性測定培養(yǎng)基、按照日本化學療法學會標準法測定的赤竹提取物對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌3株參考菌株的MIC的比較

高10μl的Mc Farland No.1，低10μl的Mc Farland No.1的100倍稀釋液，(1)在厭氧培養(yǎng)下不能測定，但再繼續(xù)進行需氧培養(yǎng)后，判定為1％，NT未實施實驗表20培養(yǎng)基pH對MIC的影響


表21改良GAM瓊脂培養(yǎng)基、厭氧性培養(yǎng)、培養(yǎng)24小時

改良GAM瓊脂培養(yǎng)基、需氧性培養(yǎng)、培養(yǎng)24小時試驗例13(對細菌性陰道病關(guān)連微生物的抗菌作用)1.關(guān)于二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌株在分類為BV相關(guān)細菌的細菌中，首先研究赤竹提取物對二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌的抗菌作用。
所用菌株使用總共14株二路普雷沃氏菌和9株有色普雷沃氏菌(中間普雷沃氏菌(Prevotella intermedia)、產(chǎn)黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica))。二路普雷沃氏菌是二十世紀90年代前期從女性陰道內(nèi)分離得到并保存于所述設(shè)施的菌株，有色普雷沃氏菌是2002年從各種臨床材料中分離得到并保存于所述設(shè)施的菌株。使用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。是濃度為50(w/v)％的酸性(pH5.0左右)溶液。使用無菌蒸餾水進行稀釋。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。將赤竹提取液與瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。用2N的NaOH水溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH(pH7.0-7.3)。
使用通過布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落，將其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland#1的菌液，10倍稀釋后，將其1接種環(huán)的量(10μl)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在本實驗條件下，1接種環(huán)含有約104個細菌。在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)2天后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
在本實驗條件下測定的赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC都是＞5％。
結(jié)果赤竹提取物在0.5％時完全抑制二路普雷沃氏菌的生長，在1％時完全抑制有色普雷沃氏菌的生長。赤竹提取物對14株二路普雷沃氏菌的MIC50％和對有色普雷沃氏菌的MIC50％都為0.5％。
表22赤竹提取物對14株二路普雷沃氏菌和9株有色普雷沃氏菌的抗菌作用


考察健康女性的陰道是厭氧菌和需氧菌的寶庫。在女性產(chǎn)道的正常細菌群中，對保持陰道內(nèi)清潔度具有重要作用的乳桿菌以最優(yōu)勢存在。但是另一方面，已知作為條件致病病原體的厭氧消化鏈球菌等厭氧性革蘭氏陽性球菌和普雷沃氏菌(產(chǎn)黑素普雷沃氏菌、中間普雷沃氏菌等)、擬桿菌等厭氧性革蘭氏陰性桿菌也以低菌量存在，并在被稱為細菌性陰道病的狀況下異常地增殖，所以將它們稱為細菌性陰道病關(guān)連微生物。細菌性陰道病是產(chǎn)生乳樣具有惡臭的白帶的疾病，當前正在探討這種疾病與STD易感染性、早產(chǎn)、早期破水等見于圍產(chǎn)期的各種異常的關(guān)系以及與盆腔炎性疾病PID發(fā)展的關(guān)系。
已知二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌在細菌性陰道病關(guān)連微生物中，也是與重癥度或頑固性相關(guān)的極重要的細菌種。
從這次的研究可知赤竹提取物對這些二路普雷沃氏菌和有色普雷沃氏菌具有極好的抗菌作用。
表23婦產(chǎn)科領(lǐng)域感染的病原菌一覽(疾病名、學名、俗名)


*厭氧菌試驗例14(對細菌性陰道病關(guān)連微生物的抗菌作用)2.關(guān)于陰道加德納氏菌從健康女性的陰道可檢測出陰道加德納氏菌，但其數(shù)量很少。陰道加德納氏菌與人型支原體、厭氧消化鏈球菌、有色普雷沃氏菌、非有色普雷沃氏菌、卟啉單胞菌等一起都屬于在細菌性陰道病的狀態(tài)下異常增殖的所謂BV關(guān)連微生物中的一種細菌。并且作為產(chǎn)道感染的病原菌是極為重要的。本試驗對陰道加德納氏菌進行探討。
材料與方法所用菌株使用了總共11株陰道加德納氏菌。這包括購自NCTC或ATCC的2株菌株和9株臨床分離株。臨床分離株是本發(fā)明人在二十世紀九十年代前期從女性陰道內(nèi)分離得到并保存于所述設(shè)施的菌株。還使用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)，使終濃度為8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。將赤竹提取液與布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基以1∶1或1∶9的比例混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。并用2N NaOH水溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH(pH7.0-7.3)。
使用通過布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落，使其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其1接種環(huán)量(10μl)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。對對照培養(yǎng)基進行適當設(shè)定，使通過對照培養(yǎng)基進行的生長在涂抹部位整體看起來都一樣。
在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)2天后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
在本實驗條件下測得的赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC分別為＞8％、8％。
結(jié)果赤竹提取物對11株陰道加德納氏菌的MIC范圍分布于6％-4％，MIC50％為6％。
表24赤竹提取物對11株陰道加德納氏菌的抗菌作用


考察由本次的研究可知，赤竹提取物對作為細菌性陰道病關(guān)連微生物中的一種重要細菌的兼性厭氧菌陰道加德納氏菌，以6％的濃度即可完全抑制其生長。知悉其與作為BV關(guān)連微生物的厭氧菌的為非有色普雷沃氏菌的二路普雷沃氏菌或者為有色普雷沃氏菌的產(chǎn)黑素普雷沃氏菌相比，對前者的抗菌能力更弱。已知本提取物即使以8％的濃度也不會抑制乳桿菌的多數(shù)菌株的生長，所以認為在用于生物體時的濃度設(shè)定方面取得了重要成績。
在一系列的研究中，知悉作為參考菌株的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC隨實驗條件而有所變化。MIC受所用敏感性測定用培養(yǎng)基的種類、接種菌量、培養(yǎng)條件等因素影響，這回首次使用了布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基作為敏感性測定培養(yǎng)基。用本培養(yǎng)基測定的MIC比用改良GAM培養(yǎng)基測定的MIC似乎向酸性側(cè)有所移動。
試驗例15(對細菌性陰道病關(guān)連微生物的抗菌作用)3.關(guān)于Finegoldia、Micromonas、消化鏈球菌屬厭氧球菌Finegoldia magna、Micromonas micros、消化鏈球菌與二路普雷沃氏菌、有色普雷沃氏菌、卟啉單胞菌、生殖道支原體(人型支原體)、陰道加德納氏菌等一起，都是在以陰道內(nèi)乳酸菌減少、陰道內(nèi)pH降低和乳樣且具有惡臭(胺臭)的白帶為特征細菌性陰道病(BV)狀態(tài)下異常增加的細菌性陰道病關(guān)連微生物的成員。本試驗例中，研究赤竹提取物對被分類為細菌性陰道病關(guān)連細菌的一種細菌—厭氧球菌的抗菌作用。
材料與方法所用菌株使用了5株厭氧消化鏈球菌、3株不解糖消化鏈球菌(Peptostreptococcus asaccharolyticus)、7株Finegoldia magna、6株Micromonas micros總共21株。還使用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。將赤竹提取液與瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。并用2N NaOH水溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH(pH7.0-7.3)。
使用通過布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落，使其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland#1的菌液。將其1接種環(huán)量(10μl)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在本實驗條件下，1接種環(huán)含有約106個細菌。
在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)24小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
在本實驗條件下測得的赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC都為＞＝5％。
結(jié)果赤竹提取物以3％的濃度即完全抑制了Micromonas micros、Finegoldia magna、厭氧消化鏈球菌、不解糖消化鏈球菌這21株厭氧球菌的生長。赤竹提取物對厭氧球菌的MIC50％為0.5％。
表25赤竹提取物對厭氧球菌的抗菌作用

考察細菌性陰道病是產(chǎn)生乳樣具有惡臭的白帶的疾病，涉及到與對性感染(STD)的易感染性、早產(chǎn)、早期破水等見于圍產(chǎn)期的各種異常的關(guān)系以及與骨盆內(nèi)炎性疾病PID發(fā)展的關(guān)系。已知細菌性陰道病中，健康時對保持陰道內(nèi)清潔度具有重要作用的乳桿菌顯著減少，普雷沃氏菌(產(chǎn)黑素普雷沃氏菌、中間普雷沃氏菌等)、擬桿菌等厭氧性革蘭氏陰性桿菌和厭氧消化鏈球菌等厭氧性革蘭氏陽性球菌以及陰道加德納氏菌、支原體等微生物異常增殖。這些細菌群被稱為細菌性陰道病關(guān)連微生物。
先前已說明赤竹提取物以2％的低濃度即可抑制細菌性陰道病關(guān)連微生物普雷沃氏菌(二路普雷沃氏菌、產(chǎn)黑素普雷沃氏菌、中間普雷沃氏菌等)的生長，以6％的濃度可抑制脆弱擬桿菌群、陰道加德納氏菌的生長。由本次的研究可知，赤竹提取物以2％的濃度即可抑制厭氧性球菌群所有菌株的生長。
試驗例16(對細菌性陰道病關(guān)連微生物的抗菌作用)關(guān)于動彎桿菌作為厭氧性革蘭氏陽性桿菌的動彎桿菌是厭氧性無芽孢革蘭氏陽性厭氧桿菌，與二路普雷沃氏菌、有色普雷沃氏菌、卟啉單胞菌、生殖道支原體(人型支原體)、陰道加德納氏菌一起，都是在以陰道內(nèi)乳酸菌減少、陰道內(nèi)pH降低和乳樣且具有惡臭(胺臭)的白帶為特征的細菌性陰道病狀態(tài)下異常增加的細菌性陰道病關(guān)連微生物的成員。本試驗例中，研究赤竹提取物對動彎桿菌的抗菌作用。
材料與方法所用菌株使用了12株動彎桿菌。其中包括柯氏動彎桿菌柯氏亞種(Mobiluncus curtisii subsp.curtisii)ATCC35242、柯氏動彎桿菌霍氏亞種(Mobiluncus curtisii subsp.holmessii)ATCC25241、羞怯動彎桿菌(Mobiluncus mullielis)ATCC35240、ATCC35243。另外用金黃色葡萄球菌ATCC25923作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度。制備含有赤竹提取物的布魯氏菌HK血液瓊脂平板，使終濃度為8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。血液使用因冷凍溶解而溶血的羊脫纖維血(日生材)，以5％的比例添加到培養(yǎng)基中。將赤竹提取液與瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。并用2N NaOH水溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH(pH7.0±0.3)。
使用通過布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)培養(yǎng)72小時后得到的受試菌株的菌落，使其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland#1的菌液。將其1接種環(huán)量(10μl)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在本實驗條件下，1接種環(huán)含有約106個細菌。
在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)2天后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
在pH7.0的本實驗條件下測得的赤竹提取物對金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC為8％。(與用對照培養(yǎng)基進行的生長相比，觀察到顯著抑制生長的濃度為4％。)結(jié)果結(jié)果顯示于表26中。赤竹提取物在4％時可完全抑制動彎桿菌的生長。赤竹提取物對動彎桿菌的MIC50％為4％。
考察細菌性陰道病是產(chǎn)生乳樣具有惡臭的白帶的疾病，涉及與對STD的易感染性、早產(chǎn)、早期破水等見于圍產(chǎn)期的各種異常的關(guān)系以及與骨盆內(nèi)炎癥性疾病PID發(fā)展的關(guān)系。已知細菌性陰道病中，健康時對保持陰道內(nèi)清潔度具有重要作用的乳桿菌顯著減少，普雷沃氏菌(產(chǎn)黑素普雷沃氏菌、中間普雷沃氏菌等)、擬桿菌等厭氧性革蘭氏陰性桿菌和作為厭氧性革蘭氏陽桿菌的動彎桿菌、厭氧消化鏈球菌等厭氧性革蘭氏陽性球菌以及陰道加德納氏菌、支原體等微生物異常增殖。這些細菌群被稱為細菌性陰道病關(guān)連微生物。在細菌性陰道病關(guān)連微生物中，動彎桿菌是在BV評分值高的狀態(tài)下則檢出率增高的菌種，這在本發(fā)明人的研究中也得到確認。
先前已說明赤竹提取物以2％的低濃度即可抑制細菌性陰道病關(guān)連微生物普雷沃氏菌(二路普雷沃氏菌、產(chǎn)黑素普雷沃氏菌、中間普雷沃氏菌等)的生長，以6％的濃度可抑制脆弱擬桿菌群、陰道加德納氏菌的生長，并且以2％的濃度可抑制厭氧球菌群所有菌株的生長。本試驗例對動彎桿菌進行探討。其結(jié)果可知赤竹提取物以4％的濃度即可抑制它們的生長。
表26赤竹提取物對動彎桿菌的抗菌作用

試驗例17(赤竹提取物對脆弱擬桿菌菌株的抗菌作用)脆弱擬桿菌是從人糞便中分離出的無芽孢厭氧性革蘭氏陰性桿菌，在包括褥瘡、肛周膿腫等在內(nèi)的各種皮膚、皮下軟組織感染中，與金黃色葡萄球菌(MRSA)、多重耐藥性綠膿桿菌都是臨床上極其重要的菌種。本試驗例研究赤竹提取物對脆弱擬桿菌的抗菌作用。
所用菌株使用了總共12株脆弱擬桿菌。這些臨床分離株是在2002年1月至7月從各種化膿性感染患者分離得到并保存于所述設(shè)施的菌株。并用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度。以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1％。10-6％用赤竹提取液與2倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合，5-1％用赤竹提取液與瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。并用2N NaOH水溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH(pH6.6-7.1)。
使用通過布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落，使其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland#1的菌液，將其1接種環(huán)量(10μl)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在本實驗條件下，1接種環(huán)包括約106cfu/ml的細菌數(shù)。
在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)1、2天后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
在本實驗條件下測得的赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC都為6％。
結(jié)果赤竹提取物對12林脆弱擬桿菌的MIC范圍分布于4-6％，MIC90％為5％。
表27赤竹提取物對12株脆弱擬桿菌的抗菌作用


考察脆弱擬桿菌群(特別是脆弱擬桿菌)是厭氧性無芽孢革蘭氏陰性厭氧桿菌，存在于人的下部消化道粘膜上。該菌群在粘膜出現(xiàn)破綻時，通常侵入無菌的組織或內(nèi)臟，引起感染。是可從各種膿性感染，特別是橫膈膜以下的膿性感染以最高頻率分離得到的厭氧菌。本細菌與大腸桿菌等兼性桿菌、葡萄球菌、腸球菌、米氏鏈球菌(Streptococcus milleri)群等兼性、微需氧球菌、擬桿菌以外的無芽孢厭氧菌等一起存在于感染部位。也就是說作為多種菌感染的構(gòu)成菌是很重要的。脆弱擬桿菌與其它的部分兼性菌一樣，對很多的抗菌藥具有自然耐藥性，對本菌種具有抗菌能力的抗菌藥比較限于氯潔霉素、頭霉素、卡巴培南等。但是，對這數(shù)量很少的幾種抗菌藥，也還存在容易獲得耐藥性的問題。因此，對于與脆弱擬桿菌相關(guān)的感染的治療，需長期使用更廣譜的抗菌藥或者多種抗菌藥。但通過這些使用方法，不用說本菌種，具有使本菌種以外的細菌種的抗菌藥耐藥性增長的可能，可以說本菌種在感染治療上是極難對付的菌種。
由本次的研究可知，作為膿性多種菌感染病原菌，與金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌一起都是重要的無芽孢厭氧菌的代表性菌群脆弱擬桿菌群的細菌種，赤竹提取物對其具有與對厭氧條件下的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌參考菌株的作用至少同等程度的抗菌作用。
試驗例18(盆腔內(nèi)感染)
健康女性的陰道是厭氧菌和需氧菌的一個寶庫。在女性產(chǎn)道的正常細菌群中，厭氧菌以需氧菌10倍以上的量大量存在。是厭氧性革蘭氏陽性球菌和擬桿菌(按照現(xiàn)在的分類是普雷沃氏菌和擬桿菌)。厭氧菌可從與STD病原體沒有關(guān)系的產(chǎn)道感染的大部分患者分離得到。主要的厭氧性病原體是脆弱擬桿菌、二路普雷沃氏菌、解糖胨普雷沃氏菌(Prevotella disiens)、產(chǎn)黑素普雷沃氏菌、厭氧球菌以及梭菌。厭氧菌與輸卵管卵巢膿腫、膿毒性流產(chǎn)、盆腔內(nèi)膿腫、子宮內(nèi)膜炎、術(shù)后創(chuàng)部感染，特別是剖腹產(chǎn)術(shù)后創(chuàng)部感染等有關(guān)系。這些感染多是厭氧菌與腸桿菌科的細菌引起的多種菌感染，但僅由腸桿菌科的細菌與未分離出其它兼性菌的厭氧菌引起的感染比腹腔內(nèi)感染的情況更多見。其特征是從子宮排出具有惡臭的膿液或血液、包覆有子宮的下腹部全體或盆腔內(nèi)局部壓痛、持續(xù)發(fā)熱或畏寒。有時并發(fā)盆腔靜脈的化膿性血栓性靜脈炎，成為引起反復性膿毒性肺栓塞的病因。
厭氧菌可能是與細菌性陰道病的病因相關(guān)的因素。至今原因不明的癥候群具有下述特征具有惡臭的分泌物異常多和陰道內(nèi)的陰道加德納氏菌、普雷沃氏菌、動彎桿菌、消化鏈球菌以及支原體等細菌的異常增加。厭氧菌被認為在盆腔炎性疾病(PID)的病因方面扮演著重要角色，多名專家都闡述了細菌性陰道病與PID的發(fā)展之間的關(guān)系。
以放線菌(Actinomyces spp.)為病因的盆腔感染是與子宮內(nèi)避孕用具的使用相關(guān)聯(lián)的感染。
試驗例19(赤竹提取物對雙歧桿菌(Bifidobacterium spp.)的抗菌作用)評價具有抗菌能力的物質(zhì)時，在弄清其對人體病原菌的作用的同時，弄清其對存在于皮膚、粘膜上的益生菌或條件致病菌的作用是極為重要的。
雙歧桿菌與乳桿菌一樣，是消化道內(nèi)、陰道內(nèi)的固有細菌，是除已知具有呼吸器官病原性的齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium)外，沒有被指出具有病原性的菌種的益生菌。因此，用雙歧桿菌的參考菌株，對赤竹提取物對雙歧桿菌具有何種程度的抗菌作用進行探討。
材料和方法所用菌株使用表28中給出的機構(gòu)保存的參考菌株。這些菌株是從JCM購買、保存于所述設(shè)施的菌株。從可在婦科領(lǐng)域感染和消化器官感染中以最高頻率分離出的厭氧菌菌種中選取二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉單胞菌ATCC25260、脆弱擬桿菌N-1作為對照。并出于同樣的目的，將大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923用作敏感性測定精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。用無菌蒸餾水稀釋溶液。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％。10-6％的高濃度域分別用20-12％的赤竹提取液與2倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶1混合(最終pH5.3-5.5)，5-0.5％的低濃度區(qū)域用50-5％的赤竹提取液與1倍瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合(最終pH5.5-6.0)，制成含有赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。
接種菌液的調(diào)整在布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基種培養(yǎng)48小時，將得到的受試菌株的菌落用無菌棉棒取出，使其懸浮于厭氧菌肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其10μl(接種量106cfu)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。對于對照菌株，用TSA瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，在厭氧菌肉湯中調(diào)整成Mc Farland#1的濁度，將其10μl(接種量106cfu)通過劃線法進行接種。并在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)18小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
結(jié)果在沒有調(diào)整pH的酸性(pH5.3-6.0)實驗條件下測定的赤竹提取物的最低抑菌濃度如表28所示。對于雙歧桿菌的5菌種5株，除1株MIC為4％的雙歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)外，最低抑菌濃度全部都在7％以上。同時測定的二路普雷沃氏菌ATCC29303、不解糖卟啉單胞菌ATCC25260的最低抑菌濃度都是0.5％，通過本方法測定的對2株AHSS的精度控制用菌株、大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923的最低抑菌濃度都為4％。
考察已知赤竹提取物在6.25％以下(大多為4％左右)的濃度可以抑制一些病原性細菌的生長。因認為除赤竹提取物對這些病原性細菌的抗菌能力外，積累其對非病原性細菌的抗菌能力的信息也是極其重要的，所以進行了本次的研究。
從機體防御考慮，在人的粘膜中，乳桿菌、雙歧桿菌的多數(shù)都扮演著極為重要的角色。本發(fā)明人已經(jīng)報道赤竹提取物對作為產(chǎn)生過氧化氫的乳桿菌的卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌的抗菌作用的MIC為10％以上，而對同時實施的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有代表性的病原性兼性菌的MIC為4％，對二路普雷沃氏菌、不解糖卟啉單胞菌、脆弱擬桿菌等具有代表性的化膿性兼性菌的MIC為0.5-4％，前者與后兩者相比，前者是極弱的。
這次，可知赤竹提取物對消化道內(nèi)固有的雙歧桿菌的5菌種5株，也與對乳桿菌一樣，僅具有很弱的抗菌力。
這強烈表明赤竹提取物對陰道內(nèi)益生菌、消化道內(nèi)益生菌的抗菌力比對條件致病性病原菌的抗菌力相對較弱。
表28赤竹提取物對雙歧桿菌群的抗菌作用

*接種菌量將1接種環(huán)量的濁度為Mc Farland#1的菌液劃線1cm試驗例20(對白色念珠菌和Candida glabrata的抗真菌作用)本試驗例研究對作為“鵝口瘡”、女性陰道炎、外陰炎的病原菌白色念珠菌和Candida glabrata的抗真菌作用。
所用菌株使用了總共13株白色念珠菌和Candida glabrata。這些菌株是在2002年從各種臨床材料分離得到并保存于所述設(shè)施的菌株。使用大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923和綠膿桿菌ATCC27853作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。使用無菌蒸餾水進行稀釋。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度。制備含有赤竹提取物的MH瓊脂平板(Difco)，使終濃度為8、7、6、5、4、3、2、1％。將赤竹提取液與瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合，制成含有預定濃度的赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。并用2N NaOH水溶液或10％氯化氫水溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH(pH7.0左右與pH5.0左右的兩種)。
使用通過マイコセル瓊脂培養(yǎng)基(BD)培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落，使其懸浮于MH肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為McFarland#1的菌液，將其1接種環(huán)量(10μl)通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在本實驗條件下，1接種環(huán)包括約106個細菌。
在35℃培養(yǎng)24小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。
在本實驗條件下測得的1天后赤竹提取物對大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923和綠膿桿菌ATCC27853的MIC，在pH7下分別為2、＜＝1、2％；在pH5下全都為＜＝1。在3天后、室溫下的MIC，pH7條件下分別為3、＜＝1、3，pH5條件下分別為2、＜＝1、＜＝1。
結(jié)果表中給出了在pH5和pH7的環(huán)境下1天后和3天后判定的赤竹提取物對念珠菌的MIC分布。在pH5、24小時判定時，赤竹提取物以5％的濃度抑制了所有8株白色念珠菌和4株Candida glabrata的的生長。3天后判定時，抑制全部菌株的生長需要8％的濃度。
在pH7、24小時判定時，赤竹提取物以5％的濃度抑制了白色念珠菌所有菌株的生長。未能判定對Candida glabrata的MIC。3天后判定時，抑制包括Candida glabrata在內(nèi)的全部菌株生長需要8％以上的濃度。
考察已知女性陰道炎有由原蟲引起的毛滴蟲陰道炎、由真菌引起的念珠菌性陰道炎和由細菌引起的細菌性陰道病(＝非特異性陰道炎)。引起陰道炎的念珠菌也是外陰炎的病因。念珠菌性陰道炎與其它陰道炎不同，以白帶呈乳酪狀為特征，是一種瘙癢感極強的疾病。通過給予抗真菌劑進行治療。
本次研究確認了赤竹提取物具有抑制酵母狀真菌生長的作用。在酸性條件下1天后測定的MIC分布于5％-3％。在調(diào)整pH后于中性條件下測定的MIC分布于5％-4％。但是，當進一步在室溫下放置3天后再次判定MIC時，赤竹提取物對念珠菌的pH5.0下的MIC除1株為8％外，其余12株從5-3％的范圍向7-4％范圍的耐藥性側(cè)移動，在pH7.0下的MIC則13株全部都從5-4％的范圍移動至8％以上了。這暗示著1天后確定的MIC或更高濃度的赤竹提取物對真菌所顯示出的抗菌作用只是抑菌，殺菌則需要更高的濃度。將Candida glabrata在中性環(huán)境下于37℃培養(yǎng)1天后，未見到有充分的生長，但之后在室溫下放置3天后，可確認充分生長，可以判定MIC。用調(diào)整成酸性的Mueller Hinton培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)1天后，可見到充分的生長，可以判定MIC。
用Mueller Hinton培養(yǎng)基作為敏感性測定用培養(yǎng)基的本實驗中，赤竹提取物對念珠菌的MIC為7-4％的濃度，顯示出具有抗真菌作用。其MIC在中性環(huán)境下比酸性環(huán)境顯示低1管左右的值。而且，即使采用在中性條件下1天后抑制了生長的相當高的濃度，其后通過在室溫放置，仍可觀察到念珠菌生長，由此可知其作用只是制菌作用。在酸性條件下，采用1天后抑制了生長的濃度，之后雖觀察到了念珠菌生長，但其生長程度比在中性環(huán)境下觀察到的生長程度輕。即，本提取物在酸性條件下對念珠菌比在中性環(huán)境下顯示出更強的殺菌作用。在將赤竹提取物進行臨床應用的情況下，設(shè)定濃度時，除考慮與本提取物的毒性相關(guān)的信息外，還需要充分考慮這一點后，再設(shè)定使用濃度和使用次數(shù)。
由上述內(nèi)容可知，除抗菌作用外還具有抗真菌作用的赤竹提取物，足可作為念珠菌陰道炎和外陰炎以及其它與念珠菌有關(guān)的病狀的治療藥物使用。
本發(fā)明人確認了本提取物對普雷沃氏菌、陰道加德納氏菌等與細菌性陰道病有關(guān)的細菌顯示強或中等程度的抗菌作用以及具有其它細菌學上的特性，由此認為其作為細菌性陰道病的治療藥物的有用性很高，這種情況下很容易想到，同時擁有抗真菌作用的本提取物具備一種特性，即可防止念珠菌引起的菌交替現(xiàn)象或交替癥的發(fā)生，而據(jù)報道，這是目前用于細菌性陰道病的氯霉素等完全沒有抗真菌作用的抗菌藥用后產(chǎn)生的副作用。
表29赤竹提取物對白色念珠菌和Candida glaburata的抗菌作用

*培養(yǎng)基pH**判定天數(shù)
*在不含赤竹提取物的培養(yǎng)基(pH7.0)上生長差，因而保留判定試驗例21(對來自于尋常痤瘡患者病灶的葡萄球菌的抗菌作用)6.25％濃度的赤竹提取物可完全抑制作為粉刺(尋常痤瘡)的重要病因之一的瘡皰丙酸桿菌的生長。并且已知，赤竹提取物以1％以下的濃度可完全抑制重要的化膿性球菌金黃色葡萄球菌(MRSA)的生長。本發(fā)明人使用13株從粉刺患者病灶分離出的粉刺的重要加重因子表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌，總共14株葡萄球菌，通過瓊脂平板稀釋法研究赤竹提取物的抗菌作用。
材料與方法所用菌株使用了13株表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌，總共14株。使用大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923作為敏感性測定的精度控制用菌株。表30中給出了所用菌株的菌種與抗菌藥敏感性。
表30來自于粉刺病灶的葡萄球菌的對抗菌藥的耐藥性


試驗液與試驗例7的一樣。使用無菌蒸餾水稀釋溶液。
抗菌試驗按照抗菌藥對兼性菌的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。盡可能以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的Muellar Hinton瓊脂平板(Difco)，使終濃度為5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。將50-1.25％的赤竹提取液與1倍濃度的Mueller Hinton瓊脂培養(yǎng)基以1∶9混合，制成含有赤竹提取物的瓊脂培養(yǎng)基。用2N NaOH水溶液將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH6.1-7.1。對金黃色葡萄球菌ATC25922和大腸桿菌ATCC25922的MIC為2％。
接種菌液的調(diào)整與判定在TSA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48小時，將得到的受試菌株的菌落用無菌棉棒取出，使其懸浮于Mueller Hinton肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其10μl懸浮于1ml MuellerHinton肉湯中，將其10μl通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在35℃、有氧環(huán)境下培養(yǎng)20小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。
結(jié)果使用13株表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌，總共14株，通過瓊脂平板稀釋法分析赤竹提取物的抗菌作用。其結(jié)果，赤竹提取物在1％濃度時完全抑制了這些菌株的生長。對14株菌株進行對三種抗菌藥(四環(huán)素、氯潔霉素、氧氟沙星)的敏感性試驗，對四環(huán)素1種抗菌藥具有耐藥性的菌株有2株，對氯潔霉素1種抗菌藥具有耐藥性的菌株有1株，對四環(huán)素和氯潔霉素2種抗菌藥具有耐藥性的菌株有2株，對氧氟沙星1種抗菌藥具有耐藥性的菌株有1株，但赤竹提取物對這些耐藥菌，同樣以1％以下的濃度即可抑制其生長。
表31赤竹提取物對14株葡萄球菌的抗菌作用

考察本發(fā)明人通過瓊脂平板稀釋法，分析了從粉刺患者分離得到的作為粉刺加重因子而重要的13株表皮葡萄球菌和1株科氏葡萄球菌總共14株對赤竹提取物的敏感性。其結(jié)果，赤竹提取物以2％的濃度完全抑制了這些菌株的生長。進行了對三種抗菌藥(四環(huán)素、氯潔霉素、氧氟沙星)的敏感性試驗的14株菌株中，對四環(huán)素1種抗菌藥具有耐藥性的菌株有2株，對氯潔霉素1種抗菌藥具有耐藥性的菌株有1株，對四環(huán)素和氯潔霉素2種抗菌藥具有耐藥性的菌株有2株，對氧氟沙星1種抗菌藥具有耐藥性的菌株有1株，但赤竹提取物對這些耐藥菌，同樣以2％以下的濃度即可抑制其生長。
以上事實證明若赤竹提取物的濃度為可抑制瘡皰丙酸桿菌生長的6.25％，則對加重因子葡萄球菌也具有充分的作用，作為粉刺的治療藥是極為有用的。
試驗例22(對來自于尋常痤瘡患者病灶的葡萄球菌的抗菌作用)本試驗例使用從粉刺患者病灶分離出的總共44株表皮葡萄球菌，通過瓊脂平板稀釋法分析赤竹提取物的抗菌作用。
所用菌株使用了總共44株葡萄球菌。并使用大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923作為敏感性測定的精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。使用無菌蒸餾水進行溶液的稀釋。
抗菌試驗按照抗菌藥對兼性菌的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。盡可能以日本化學療法學會標準法為基準。制備含有赤竹提取物的Muellar Hinton瓊脂平板(Difco)，使終濃度為5、4、3、2、1、0.5、0.25、0.125％。用2N NaOH水溶液將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH6.1-7.1。對金黃色葡萄球菌ATC25922和大腸桿菌ATCC25922的MIC為2％。
接種菌液的調(diào)整與判定在TSA瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48小時，將得到的受試菌株的菌落用無菌棉棒取出，使其懸浮于Mueller Hinton肉湯(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland No.1的菌液。將其10μl懸浮于1ml MuellerHinton肉湯中，將其10μl通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。在35℃、有氧環(huán)境下培養(yǎng)20小時后，通過肉眼觀察有沒有生長。
結(jié)果歸納在表32中。
表32葡萄球菌(44株)對赤竹提取物和各種抗菌藥的敏感性


1)表皮平整球菌34株、頭狀葡萄球菌2株、金黃色葡萄球菌2株、科氏葡萄球菌1株、人葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌1株、種名未定葡萄球菌(Staphylococcus sp.)3株。
試驗例23(對陰道炎和細菌性陰道病關(guān)連微生物的抗菌作用)試驗液與試驗例7的一樣。是50(w/v)％的棕褐、具有芳香、稍有粘性的酸性液體。
抗菌能力的試驗法效仿抗菌藥對厭氧菌的抗菌能力測定法，以改良GAM瓊脂培養(yǎng)基或布魯氏菌HK瓊脂培養(yǎng)基為測定用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，求出最低抑菌濃度(MIC).
供試菌株念珠菌和二路普雷沃氏菌(14株)、有色普雷沃氏菌(9株)、Finegoldia、Micromonas、消化鏈球菌的厭氧球菌群(21株)、動彎桿菌(12株)、陰道加德納氏菌(11株)。
成績與總結(jié)已知赤竹提取物對BV關(guān)連微生物中的兼性厭氧菌和厭氧菌以及念珠菌的抗菌能力的程度。抑制念珠菌生長的濃度為3-5％，抑制陰道加德納氏菌生長的濃度為6％，抑制動彎桿菌生長的濃度為4％，阻止厭氧球菌群生長的濃度為3％，阻止普雷沃氏菌生長的濃度為1％。
試驗例24(赤竹提取物對專性厭氧菌的抗菌譜)使用厭氧菌參考菌株在pH6.0和pH7.0條件下的分析本試驗例中，為明確赤竹提取物的抗菌譜，使用多株包括一部分難處理的微需氧菌、兼性菌(鏈球菌、乳桿菌、放線菌、Sutterella)在內(nèi)的教室保存的專性厭氧菌，在中性(pH7.0)和弱酸性(pH6.0)附近，研究赤竹提取物的抗菌作用。
所用菌株使用保存于所述設(shè)施的參考菌株[表33-36]。用大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為MIC精度控制用菌株。試驗液與試驗例7的一樣。使用無菌蒸餾水進行稀釋。
抗菌試驗按照抗菌藥的抗菌能力測定法中所用的瓊脂平板稀釋法，測定最低抑菌濃度。制作含有赤竹提取物的改良GAM瓊脂平板(日水制藥)，使終濃度為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1％。用2N氫氧化鈉水溶液和10％鹽酸水溶液調(diào)整培養(yǎng)基的pH，其目標為pH6.0和pH7.0。
使用通過布魯氏菌HK血液瓊脂培養(yǎng)基(極東制藥)培養(yǎng)48小時后得到的受試菌株的菌落，使其懸浮于厭氧菌肉湯MIC(Difco)中，調(diào)整成濁度為Mc Farland#1的菌液，10倍稀釋后，將其1接種環(huán)量通過劃線法接種于含有赤竹提取物的平板系列上。本實驗條件下，1接種環(huán)含有約104個細菌。
在厭氧工作站(グンゼ產(chǎn)業(yè))中于35℃培養(yǎng)2天后(梭菌則是培養(yǎng)1天后)，通過肉眼觀察有沒有生長。確認有生長時，判定為(+)。結(jié)果如表33-36所示。
表33 1)對厭氧球菌(消化鏈球菌、葡萄球菌、Finegoldia、Micromonas、阿托波氏菌、孿生球菌)和微需氧菌(鏈球菌)以及厭氧性革蘭氏陽性桿菌(放線菌、真桿菌(Eubacterium)、丙酸桿菌、雙歧桿菌)的抗菌能力



接種菌量108/ml培養(yǎng)時間48小時后判定備注厭氧消化鏈球菌ATCC27337、不解糖消化鏈球菌WAL3218、產(chǎn)吲哚消化鏈球菌GAI0915、普氏消化鏈球菌ATCC9321、Micromonasmicros VPI-5464-1、Finegoldia magna ATCC29328、解糖葡萄球菌ATCC14953、極小阿托波氏菌VPI0546、雙歧雙歧桿菌JCM1255在pH6.0不生長。
表34對乳酸桿菌(乳桿菌)和厭氧革蘭氏陰性桿菌(擬桿菌)的抗菌作用


接種菌量107/ml培養(yǎng)時間35℃48小時后判定表35對厭氧性革蘭氏陰性桿菌(擬桿菌、普雷沃氏菌、卟啉單胞菌、梭桿菌、嗜膽菌、脫硫弧菌)、微需氧菌(彎曲桿菌、Sutterella、二氧化碳嗜纖維菌)和厭氧性革蘭氏陰性球菌(韋榮氏球菌)的抗菌作用


接種菌量107/ml 培養(yǎng)時間35℃48小時備注
解肝素普雷沃氏菌ATCC35895、解糖卟啉單胞菌ATCC25260、牙齦卟啉單胞菌ATCC33277、沃氏嗜膽菌WAL7959、piger脫硫弧菌DSM749用pH6.0的不含提取物的對照培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，不生長。
表36對有芽孢厭氧菌(梭菌)的抗菌力

*敗毒梭菌、索氏梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌屬于氣性壞疽菌群的成員。
接種菌量107/ml培養(yǎng)35℃24小時后判定總結(jié)至此弄清了赤竹提取物對厭氧菌群的抗菌譜的概要。若假定赤竹提取物的MIC為3％以下時為強抗菌能力，4％-6％時為中等程度的抗菌能力，7％以上時為弱抗菌能力，則可以如下進行描述。
赤竹提取物對無芽孢厭氧性革蘭氏陽性球菌(Finegoldia、Micromonas、消化鏈球菌、阿托波氏菌、孿生球菌)具有強抗菌能力。但是，對微需氧菌的anginosus群具有弱抗菌能力。
無芽孢革蘭氏陽性厭氧菌中，對丙酸桿菌具有中等程度的抗菌能力，對放線菌、雙歧桿菌、乳桿菌具有弱抗菌能力。無芽孢厭氧性革蘭氏陰性桿菌中，對普雷沃氏菌、卟啉單胞菌、嗜膽菌、脫硫弧菌、梭桿菌具有強抗菌作用，對擬桿菌、Sutterella具有中等程度的抗菌作用。對厭氧性革蘭氏陽性球菌(韋榮氏球菌(Veillonella))具有強抗菌作用。梭菌中，除對索氏梭菌顯示出中等程度的抗菌作用外，對其余的所有梭菌均顯示出強抗菌作用。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的抗菌劑對破傷風桿菌、念珠菌(例如白色念珠菌、Candidaglabrata)、丙酸桿菌屬細菌、氣性壞疽菌、各種耐藥菌(例如甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌)、陰道炎和細菌性陰道病關(guān)連微生物(例如Finegoldia、Micromonas、消化鏈球菌)等顯示出強抗菌作用，對放線菌、雙歧桿菌、乳桿菌顯示出弱抗菌作用，并且對皰疹病毒等病毒顯示出抗病毒作用，可用作抗菌性油墨、抗菌性涂料、抗菌性日本酒、抗菌性粘結(jié)劑、抗菌性飲料、抗菌性食品、抗菌性調(diào)味料、動植物用抗菌劑、防腐劑、農(nóng)業(yè)殺菌劑、農(nóng)藥等。特別是除赤竹提取物外還含有有機酸(例如蘋果酸)的本發(fā)明抗菌劑的抗菌作用特別顯著。
權(quán)利要求
1.含有赤竹提取物的抗破傷風桿菌劑。
2.含有赤竹提取物的抗真菌劑。
3.權(quán)利要求2的抗真菌劑，該抗真菌劑還含有有機酸。
4.權(quán)利要求3的抗真菌劑，其中所述真菌為念珠菌。
5.含有赤竹提取物的抗病毒劑。
6.含有赤竹單寧酸的抗菌劑。
7.權(quán)利要求6的抗菌劑，該抗菌劑是抗金黃色葡萄球菌、丙酸桿菌、大腸桿菌的抗菌劑。
8.權(quán)利要求6的抗菌劑，該抗菌劑是抗MRSA的抗菌劑。
9.權(quán)利要求6的抗菌劑，該抗菌劑是抗瘡皰丙酸桿菌的抗菌劑。
10.粉刺治療劑，該治療劑含有赤竹單寧酸。
11.抗菌性組合物，該組合物含有赤竹提取物和有機酸。
12.權(quán)利要求11的抗菌性組合物，該組合物為油墨、涂料、食品添加劑、飲料、調(diào)味料、寵物食品、塑料制品或粘結(jié)劑。
13.抗氣性壞疽菌的抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物。
14.權(quán)利要求13的抗菌劑，其中所述氣性壞疽菌為梭菌屬菌。
15.抗無芽孢厭氧性革蘭氏陽性球菌的抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物。
16.權(quán)利要求15的抗菌劑，其中所述無芽孢厭氧性革蘭氏陽性球菌為Finegoldia、Micromonas、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、阿托波氏菌屬(Atopobium)或?qū)\生球菌屬(Gemella)。
17.抗無芽孢厭氧性革蘭氏陰性桿菌的抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物。
18.權(quán)利要求17的抗菌劑，其中所述無芽孢厭氧性革蘭氏陰性桿菌為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、嗜膽菌屬(Bilophila)、脫硫弧菌屬(Desulfovivrio)或梭桿菌屬(Fusobacterium)。
19.抗陰道炎和細菌性陰道病相關(guān)微生物的抗菌劑，該抗菌劑含有赤竹提取物。
20.權(quán)利要求13-19中任一項的抗菌劑，該抗菌劑還含有有機酸。
21.含有赤竹提取物的調(diào)味料。
22.權(quán)利要求21的調(diào)味料，該調(diào)味料為含有赤竹提取物的食鹽。
23.權(quán)利要求21或22的調(diào)味料，該調(diào)味料還含有有機酸。
24.含有赤竹提取物的農(nóng)藥。
25.權(quán)利要求24的農(nóng)藥，該農(nóng)藥還含有有機酸。
26.含有赤竹提取物的農(nóng)業(yè)用殺菌劑。
27.權(quán)利要求26的農(nóng)業(yè)用殺菌劑，該殺菌劑還含有有機酸。
28.含有赤竹提取物的防腐劑。
29.權(quán)利要求28的防腐劑，該防腐劑還含有有機酸。
全文摘要
含有赤竹提取物的抗破傷風桿菌劑、含有赤竹提取物和有機酸的抗真菌劑、含有赤竹提取物的抗病毒劑、含有赤竹單寧酸的抗菌劑、含有赤竹提取物和有機酸的抗菌性組合物。
文檔編號A01N37/04GK1674925SQ0381943
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月13日
發(fā)明者土田裕三, 土田小太郎, 土田憲次郎, 渡邊邦友, 中村良子, 巖澤篤郎 申請人:株式會社鳳凰堂