一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于抗菌劑及食品添加劑或者化妝品領域，具體涉及一種酪蛋白?豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備及應用。本發(fā)明通過將豆蔻精油包裹在酪蛋白脂質體中，以實現(xiàn)減少豆蔻精油在施用過程中的揮發(fā)，從而減少豆蔻精油的浪費，提高其利用率，達到長效抗菌與高效利用的目的。
【專利說明】
-種酪蛋白-豆憲精油脂質體抗菌劑的制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于抗菌劑及食品添加劑或者化妝品領域，具體設及一種酪蛋白-豆違精 油脂質體抗菌劑的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 豆違，多年生常綠草本植物，是姜科植物，產(chǎn)出暖性精油。精油無色或黃色，甜而溫 暖，主要成分是松油醇，按油醇，姜締和巧樣締。肉豆違含揮發(fā)油、脂肪油、苯丙素、木脂素和 黃酬等多種化學成分，具有抗菌消炎、鎮(zhèn)痛、止瀉、抗腫瘤等廣泛的藥理作用。豆違精油有良 好的抗炎，鎮(zhèn)痛，抑菌作用，對各種食源性病原菌有較好的抗菌效果，且安全、無毒副作用， 在肉制品加工中應用廣泛，可去異味，抑細菌，增辛香。
[0003] 國內(nèi)有很多關于豆違在醫(yī)學應用的專利申請。CN103893226A公開了肉豆違提取物 在制備抗痛風的藥物、食品或保健品的應用。CN102988333A公開了豆違明在制備防治腸炎 的藥物或食品中的應用。CN102036662A公開了一種利用肉豆違衣木脂素預防和治療ppAR介 導的疾病的方法。CN103719464A發(fā)明了一種肉豆違脾胃虛弱保健茶。CN1709467A公開了一 種復方草豆違滴丸及其制備方法。CN101508937A公開了一種超臨界二氧化碳提取肉豆違精 油的方法，可W獲得高品質的肉豆寇精油產(chǎn)品。CN103638074A公開了一種肉豆寇揮發(fā)油在 制備治療抑郁癥藥物中的應用。
[0004] 雖然豆違精油在醫(yī)學，食品和化妝品行業(yè)被廣泛應用，具有較好的殺菌、增香等特 點，但是豆違精油易揮發(fā)，暴露在空氣中不穩(wěn)定，所W要尋找有效的方法降低肉桂精油在使 用過程中的揮發(fā)程度，延長其膽存期。
[0005] 納米脂質體能將精油包裹在內(nèi)，并且納米脂質體不會對豆違精油的主要活性成分 造成破壞。納米脂質體使豆違精油中的活性成分與外界環(huán)境隔絕開來，可W降低豆違精油 的揮發(fā)性，延長保存期。但由于脂質體的緩釋作用，包裹精油的脂質體保質期有限。因此，選 用酪蛋白制成穩(wěn)定性更高的酪蛋白脂質體。此外，納米脂質體由于它們的亞細胞尺寸，能加 強脂質體的被動吸收機制，減少物質運輸阻力，從而增強精油的抗菌效果。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是公開一種酪蛋白-豆違精油脂質體的制備方法及其用途，通過將 豆違精油包裹在酪蛋白脂質體中，W實現(xiàn)減少豆違精油在施用過程中的揮發(fā)，從而減少豆 違精油的浪費，提高其利用率，達到長效抗菌與高效利用的目的。本發(fā)明由豆違精油，大豆 卵憐脂，膽固醇和表面活性劑，酪蛋白制成酪蛋白-豆違精油脂質體。
[0007] 本發(fā)明的制備方法是將豆違精油，大豆卵憐脂，膽固醇混合于有機溶劑，減壓蒸發(fā) 形成光滑的薄膜，加入水相介質溶解膜狀物并超聲成乳液，通過離屯、和微孔濾膜過濾，得到 粒徑為納米級的豆違精油脂質體，其特征在于:將納米級的豆違精油脂質體與酪蛋白和表 面活性劑的溶液混合，攬拌均勻，通過低溫冷凍緩慢融化的方法使酪蛋白鑲嵌在脂質體上， 通過溫和超聲使脂質體閉合，最終形成包裹豆違精油的酪蛋白脂質體。
[0008] 本發(fā)明的大豆卵憐脂和膽固醇的質量比為5:1;用于制備精油脂質體的乳液含有 豆違精油的濃度為4.0mg/mL表面活性劑為十二烷基聚乙二醇酸(Brij-35)，得到包裹豆違 精油的酪蛋白脂質體后其最終濃度為l.Omg/mL。
[0009] 本發(fā)明中所述的有機溶劑為氯仿。
[0010] 本發(fā)明中所用的水相介質是根據(jù)中國藥典2000版標準配制的憐酸鹽緩沖溶液，pH 值6.5~7.4,優(yōu)選7.2。
[0011] 所述的酪蛋白和表面活性劑的溶液是將酪蛋白分散在化ij-35的憐酸鹽緩沖液中 得到的，Br i j-35濃度為1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。
[0012] 本發(fā)明中脂質體上鑲嵌的蛋白為酪蛋白，豆違精油脂質體與酪蛋白和表面活性劑 的溶液W體積比10:1混合，混合后溶液中酪蛋白濃度為0.1 mg/mL，Bri j-35濃度為1.Omg/ rnL 〇
[0013] 本發(fā)明中低溫冷凍緩慢融化是指將混合液在-18°C下冷凍化，隨后在0°C下緩慢融 化化。
[0014] 本發(fā)明中溫和超聲是指在低功率50W條件下超聲化，溫度范圍0-10°C。
【附圖說明】
[001引圖1酪蛋白-豆違精油脂質體的包封率。
[0016] 圖2酪蛋白-豆違精油脂質體的粒徑與多分散系數(shù)(PDI)。
[0017] 圖3酪蛋白-豆違精油脂質體對大腸桿菌的抗菌效果。
[0018] 圖4酪蛋白-豆違精油脂質體對金黃色葡萄球菌的抗菌效果。
[0019]表1酪蛋白-豆違精油脂質體的Ze化電位。
【具體實施方式】
[0020] 通過下面實例說明本發(fā)明的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護內(nèi)容，不僅局限于此
[0021] 實施例1酪蛋白-豆違精油脂質體的包封率
[0022] 1實驗材料 大豆卵憐脂 B及 國藥集團化學試劑有限公司 膽固醇 A民 國藥集團化學試劑有限公司 S氯甲燒 AR 國熟集團化學試劑有限公司
[0023] 豆寇精油 AR 法國Florihana精她 Brij-35 GR 國藥集團化學試劑有限公司 釀蛋白 CP 國藥集團化學試劑有限公司
[0024] 2實驗方法
[0025] 1)豆違精油脂質體的制備
[00%]①稱取Ig大豆卵憐脂，0.?膽固醇和200mg的豆違精油，加入50mL氯仿使其溶解。 [0027]②在旋轉蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至溶劑蒸干，蒸發(fā)溫度為10~30°C，圓底燒瓶內(nèi)壁會形成 光滑的薄膜;然后將所得產(chǎn)品放入真空干燥箱中，30°C，真空狀態(tài)下干燥2地。
[00%]③加入50mL的憐酸鹽緩沖液到圓底燒瓶中進行水化，水化超聲波功率為lOOW，超 聲時間為化。
[0029] ④將所得混合液于細胞超微粉碎儀中W功率360W，工作10s間隙5s，粉碎30min。
[0030] ⑤將所得產(chǎn)品進行離屯、，400化pm，15min，取上層液體。
[0031 ]⑥將所得液體用0.22WI1濾膜進行過濾，得濾液。
[0032] 2)酪蛋白-豆違精油脂質體的制備
[0033] ①按照上述豆違精油脂質體的制備方法，制備豆違精油濃度為4mg/mL的豆違精油 脂質體。
[0034] ②將酪蛋白超聲分散在含lOmg/mL Brij-35的憐酸鹽緩沖液中，最終形成酪蛋 白一 Br i j-35溶液，其中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。
[0035] ③在50mL豆違精油脂質體中添加5mL Img/mL的酪蛋白一化ij-35溶液，混合均勻。
[0036] ④將所得混合液于超聲條件下擴散lOmin。
[0037] ⑤將所得混合液在-18 °C下冷凍化。
[0038] ⑥將所得混合液在(TC下緩慢融化化。
[0039] ⑦通過溫和超聲（功率50W，化，KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司）使脂質體閉 合，所得溶液即為酪蛋白-豆違精油脂質體。
[0040] 3)包封率的測定
[0041] 用無水乙醇稀釋豆違精油，逐級稀釋成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mg/血的 標準溶液。然后，分別吸取化L標準溶液進行GC-MS分析，對其主要成分的譜峰面積進行自動 積分，繪制主成分峰面積-豆違精油濃度標準曲線。取ImL酪蛋白-豆違精油脂質體樣品， 13500巧m，離屯、化，倒掉上清液。接著加入ImL乙醇破乳劑，超聲化。最后W100 (K)rpm的轉速 離屯、15min，取上清液，用于GC-MS分析。制備好的脂質體樣品，對精油主成分的峰面進行自 動積分，再根據(jù)繪制的標準曲線，計算出脂質體中豆違精油的含量。則：
[0042]
[0043] 3酪蛋白-豆違精油脂質體的包封率
[0044] 包封率是評價脂質體制劑質量好壞的最重要的指標，也是脂質體能否發(fā)揮較普通 制劑高效、低毒等特點的關鍵。由圖1可看出，豆違精油脂質體的包封率為41.21%，酪蛋白- 豆違精油脂質體的包封率為78.62%。因此制備酪蛋白-豆違精油脂質體可W明顯提高脂質 體的包封率。
[0045] 實施例2酪蛋白-豆違精油脂質體的粒徑與多分散系數(shù)(PDI)
[0046] 1實驗材料
[0047] ①空白脂質體 [004引②豆違精油脂質體 [0049]③酪蛋白-豆違精油脂質體 [(K)加]2實驗方法
[0051] 用美國布魯克海文儀器公司產(chǎn)的，型號為BI-9000的高濃度激光粒度儀測定酪蛋 白-豆違精油脂質體的粒徑和多分散系數(shù)(PDI)值，所測樣品放入樣品池直接測量即可。
[0052] 3酪蛋白-豆違精油脂質體的粒徑與多分散系數(shù)(PDI)
[0053] 多分散系數(shù)(PDI)直接反映酪蛋白-豆違精油脂質體的穩(wěn)定性，因此是主要參考指 標，脂質體的PDI在0~0.3范圍內(nèi)屬于最好，在0.3~0.7范圍內(nèi)較差，但可W接受，當PDI〉 0.別寸，不予考慮。如圖2所示，空白脂質體的粒徑為86.4nm、PDI為0.353,豆違精油脂質體的 粒徑為160.7皿、PDI為0.217，酪蛋白-豆違精油脂質體的粒徑為601.5皿、PDI為0.019。酪蛋 白-豆違精油脂質體的多分散系數(shù)(PDI)最小，因此制備酪蛋白-豆違精油脂質體可W明顯 提高脂質體的穩(wěn)定性。
[0054] 實施例3酪蛋白-豆違精油脂質體的Zeta電位 [0化日]1實驗材料
[0056] ①空白脂質體
[0057] ②豆違精油脂質體
[0058] ③酪蛋白-豆違精油脂質體
[0化9] 2實驗方法
[0060] 用英國馬爾文儀器有限公司生產(chǎn)的型號為Zetasirer nano ZSZeta的電位儀測 量，直接將待測脂質體樣品放入電位儀中測量即可。
[0061] 3酪蛋白-豆違精油脂質體的Ze化電位
[0062] 表1酪蛋白-豆違精油脂質體的Zeta電位
[0063]
[0064] Zeta電位也可W直接反映酪蛋白-豆違精油脂質體的穩(wěn)定性，因此也是主要參考 指標，脂質體的Zeta電位的絕對值越大說明脂質體越穩(wěn)定性，Zeta電位的絕對值在0~30范 圍內(nèi)屬于不穩(wěn)定，在大于30時脂質體較穩(wěn)定性。如表1所示，Ξ種脂質體均帶負電，空白脂質 體的Zeta電位為-22.8mV，其絕對值小于30，脂質體不穩(wěn)定;豆違精油脂質體的Zeta電位為- 21. ImV，其絕對值小于30脂質體，不穩(wěn)定;酪蛋白-豆違精油脂質體的Zeta電位為-38.2mV， 其絕對值大于30且最大，脂質體最穩(wěn)定。
[0065] 實施例4酪蛋白-豆違精油脂質體的抗菌性能
[0066] 1實驗材料
[0067] ①豆違精油脂質體(保存7天、30天、60天、90天）
[006引②酪蛋白-豆違精油脂質體(保存7天、30天、60天、90天）
[0069] 2實驗方法
[0070] 采用平板菌落計數(shù)法，W大腸桿菌化scherichia coli)和金黃色葡萄球菌 (51曰地如〇(3〇(3(3118 aureus)為模式菌種測定酪蛋白-豆違精油脂質體的殘存菌數(shù)。將大腸桿 菌和金黃色葡萄球菌接種到液體培養(yǎng)基中，分別置于空氣搖床中在37°C、150rpm的條件下 震蕩培養(yǎng)24~4她，獲得對數(shù)生長期的菌懸液。取適量處于對數(shù)期的大腸桿菌和金黃色葡萄 球菌分別加入含有一定量無菌憐酸鹽緩沖液的試管中（細菌濃度約為1〇5~106CFU/mL)，然 后再向試管中加入濃度為20%(v/v)的豆違精油脂質體及酪蛋白-豆違精油脂質體。同時另 取兩個分別含有w上兩種菌的試管并向其中加入等量無菌水(不加脂質體)作為對照。將各 試管均置于空氣搖床中在37°C、150rpm的條件下震蕩反應2地。分別于不同時間點的取適量 培養(yǎng)液進行十倍梯度稀釋到合適的濃度，然后移取10化L稀釋液滴到無菌固體平板培養(yǎng)基 上，涂布均勻之后放入37Γ恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。24~4她后進行平板菌落計數(shù)，從 而對豆違精油脂質體和酪蛋白-豆違精油脂質體的抗菌活性進行評價。實驗重復Ξ次，結果 取平均值。
[0071] 3酪蛋白-豆違精油脂質體的抗菌性能
[0072] 不同保存期的酪蛋白-豆違精油脂質體的抗菌活性的變化也可W間接反映脂質體 的穩(wěn)定性。因此對保存7天、30天、60天、90天的豆違精油脂質體及酪蛋白-豆違精油脂質體 進行了抗菌性能評價，結果如圖3、圖4所示。保存時間為7天時，豆違精油脂質體與酪蛋白- 豆違精油脂質體的抗菌活性相近，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均顯示了良好的抗菌效 果。保存時間為30天時，豆違精油脂質體的抗菌效果明顯降低，而酪蛋白-豆違精油脂質體 仍然顯示出良好的抗菌效果。保存時間為60天和90天時，豆違精油脂質體幾乎沒有顯示抗 菌效果，而酪蛋白-豆違精油脂質體仍然保持良好的抗菌效果。
【主權項】
1. 一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，將豆蔻精油，大豆卵磷脂，膽固醇 混合于有機溶劑，減壓蒸發(fā)形成光滑的薄膜，加入水相介質溶解膜狀物并超聲成乳液，通過 離心和微孔濾膜過濾，得到粒徑為納米級的豆蔻精油脂質體，其特征在于:將納米級的豆蔻 精油脂質體與酪蛋白和表面活性劑的溶液混合，攪拌均勻，通過低溫冷凍緩慢融化的方法 使酪蛋白鑲嵌在脂質體上，通過溫和超聲使脂質體閉合，最終形成包裹豆蔻精油的酪蛋白 脂質體。2. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 大豆卵磷脂和膽固醇的質量比為5:1;用于制備精油脂質體的乳液含有豆蔻精油的濃度為 4.0mg/mL;表面活性劑為十二烷基聚乙二醇醚(Brij-35)，得到包裹豆蔻精油的酪蛋白脂質 體后其最終濃度為1 .Omg/mL。3. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 所述的有機溶劑為氯仿。4. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 所用的水相介質是根據(jù)中國藥典2000版標準配制的磷酸鹽緩沖溶液，pH值6.5~7.4,優(yōu)選 7.2。5. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 所述的酪蛋白和表面活性劑的溶液是將酪蛋白分散在Brij-35的磷酸鹽緩沖液中得到的， Br i j-35濃度為1 Omg/mL，分散后溶液中酪蛋白濃度為1. Omg/mL。6. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 脂質體上鑲嵌的蛋白為酪蛋白，豆蔻精油脂質體與酪蛋白和表面活性劑的溶液以體積比 10:1混合，混合后溶液中酪蛋白濃度為0. lmg/mL，Bri j-35濃度為1 .Omg/mL。7. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 低溫冷凍緩慢融化是指將混合液在_18°C下冷凍2h，隨后在0°C下緩慢融化2h。8. 如權利要求1所述的一種酪蛋白-豆蔻精油脂質體抗菌劑的制備方法，其特征在于： 溫和超聲是指在低功率50W條件下超聲2h，溫度范圍0-10°C。
【文檔編號】A61K47/42GK105999039SQ201610521758
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】崔海英, 李偉, 林琳
【申請人】江蘇大學