專利名稱：一種植物內生枯草芽孢桿菌及其制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其制劑，特別是一種植物內生枯草芽孢桿菌及其制劑。
背景技術：
隨著科技的發(fā)展和生活水平的提高，人們對綠色食品、限制使用化學農(nóng)藥和環(huán)境保護的要求也不斷提高?？莶菅挎邨U菌是自然界普遍存在的、對人畜無毒無害、不污染環(huán)境、對許多植物病害有良好防治效果的非致病細菌，作為一種防病微生物，枯草芽孢桿菌正日益受到人們的重視，有不少相關的研究報道。如《生物防治通報》1993.9(2)63-68發(fā)表了王雅平、劉伊強等的文章“枯草芽孢桿菌TG26防病增產(chǎn)效應研究”，報道了分離自絲瓜根部的一株枯草芽孢桿菌TG26菌株室內盆栽對小麥赤霉病的防病效果為82.25-89.80％，浸根處理對西瓜枯萎病和青枯病的防效達100％，田間小區(qū)防效對小麥赤霉病、西瓜枯萎病和青枯病的防效分別為76.4％、73.1％和79.6％，并有明顯的增產(chǎn)效應。申請?zhí)枮?9114260.8的發(fā)明專利“枯草芽孢桿菌菌劑、制法及其使用方法”，介紹了一種枯草芽孢桿菌菌劑、制法及其使用方法，菌劑含有菜豐寧B1菌株、菜豐寧B2菌株、麥豐寧B3菌株總量為5億/克以上。申請?zhí)枮?8124889.6的發(fā)明專利“一種枯草芽孢桿菌菌株、制法、制劑及應用”，介紹了一種枯草芽孢桿菌菌株、制法、制劑及應用，菌株來源于蘋果果實表面，為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，編號為XM16，菌種保藏編號為CGMCC No.0372；以蛋白質、淀粉和蔗糖為主要原料，進行分離培養(yǎng)和菌體生產(chǎn)，用于蘋果霉心病和枝干病害等作物真菌病害的防治。以上的枯草芽孢桿菌都具有抑菌和防病作用，但它們都是非植物體內生的枯草芽孢桿菌。實驗表明，非內生枯草芽孢桿菌易受外界環(huán)境的影響，且易被大田中的其它微生物抑制，嚴重影響其對植物病害的防治效果。用于室內盆栽尚可，用于防治大田作物病害的效果極差。
植物內生菌是指能夠定殖在植物細胞間隙或細胞內，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關系的一類微生物。植物內生細菌至今已有100多年的研究歷史。目前已對50多種植物的內生細菌進行了分離，分離到包括格蘭氏陰性菌和格蘭氏陽性菌共計50多個屬，幾乎所有的健康植株均可分離到內生細菌。研究還表明，植物內生細菌不僅將寄主植物作為其棲息場所，而且對寄主植物具有促生、防病、固氮等生物學作用，同時內生細菌還是外源基因導入植物體內的良好載體。
有關植物內生細菌具有促生、防病、固氮等作用的報道較多。如《中國生物防治》1996，12(1)7-10發(fā)表了夏正俊，顧本康等的文章“棉花內生及根際土壤細菌誘導棉花對大麗輪枝菌抗性的研究”，報道了從棉花組織內分離到294株細菌，6.8％的菌株對棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)有較強的拮抗作用，其中73a菌株對病害表現(xiàn)出67.21％誘導抗性作用。Sturz A.V.，Christie B.R.和Nowak J.發(fā)表的Baterial endophytesPotential role in developingsustainable systems of crop production.《Critical Reviews inPlant Sciences》.2000，19(1)1-30.綜合報道了近年來植物內生細菌在促生、防病、固氮等方面的效果，受到開發(fā)研究人員的親睞。
在微生物制劑的生產(chǎn)方面，傳統(tǒng)的生物農(nóng)藥工業(yè)生產(chǎn)工藝是砂土管菌種→斜面活化→搖瓶考察→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→過濾濃縮→吸附→噴霧干燥→質量檢驗→包裝→成品入庫。
三、技術內容本發(fā)明的目的是開發(fā)一種能夠在植物體內定殖傳導、對植物病原真菌具有較強拮抗作用、且同時具有促生作用的枯草芽孢桿菌制劑。
本發(fā)明的一種植物內生枯草芽孢桿菌及其制劑，菌株是從辣椒葉片內分離，經(jīng)人工誘變篩選，獲得能在多種植物體內內生定殖傳導的植物內生枯草芽孢桿菌BS-2(Bacillus subtilis，已于2002年10月14日送交位于北京市中關村的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO.0819)。其特征是，用抗利福平與拮抗植物病原真菌雙標記進行內生測定，從植株體內回收分離的菌株，在含利福平培養(yǎng)基上出現(xiàn)與原始菌株相同的菌落；其形態(tài)特征為菌落圓形、淡黃色，菌體桿狀，周毛鞭毛，產(chǎn)芽胞。以BS-2菌株制備植物內生枯草芽孢桿菌制劑。
配方一、花生餅粉培養(yǎng)基(重量％)花生餅粉 1.5-5.0％ 葡萄糖 0.05-2.0％KH2PO40.001-0.2％K2HPO40.001-0.2％CaCO30.001-0.2％ H2O 93-98％配方二、黃豆粉培養(yǎng)基(重量％)黃豆餅粉 1.5-5.0％ 淀粉 0.5-2.0％葡萄糖0.05-2.0％ KH2PO40-0.2％K2HPO40.001-0.2％ CaCO30.001-0.2％H2O 91-97％
配方三、普通細菌NB培養(yǎng)基(重量％)牛肉浸膏 0.1--0.5％ 蛋白胨 0.25--1.0％葡萄糖0.01--0.5％H2O98-99％PH值一般為5.5---8.5，在15℃--50℃條件下，120-250r/min黑暗振蕩培養(yǎng)3-120小時，即可獲得BS-2植物內生枯草芽孢桿菌制劑。
BS-2菌株的優(yōu)點可在較低的菌液濃度下主動進入植物體內，并能在植物體內定殖繁殖和傳導；對植物同時具有促進生長和防病作用；可在培養(yǎng)36小時左右產(chǎn)生芽孢，菌種容易保存；培養(yǎng)方法簡單，易進行工業(yè)化生產(chǎn)。
BS-2植物內生枯草芽孢桿菌制劑，具有明顯的防病、殺菌和促生作用。大田應用表明，以配方三生產(chǎn)的BS-2植物內生枯草芽孢桿菌制劑，用于浸種時對白菜和辣椒苗鮮重可增加90％以上；噴霧施用時，對辣椒苗和果的炭疽病、白菜炭疽病及香蕉炭疽病具有80％以上的防病效果；以配方一、二生產(chǎn)的BS-2菌制劑的防病效果比用配方三生產(chǎn)的制劑防病效果更好；內生定殖測定表明，BS-2菌株可在辣椒、白菜、黃瓜、甜瓜、番茄、茄子、豇豆、水稻、小麥等多種植物體內定殖傳導。本發(fā)明的菌種容易保存、培養(yǎng)方法簡單、產(chǎn)品可以開發(fā)為水劑或粉劑，使用方法簡便、易于進行工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應用前景。
四、具體實施例為了充分公開本發(fā)明的一種植物內生枯草芽孢桿菌及其制劑，下面結合水劑生產(chǎn)的實施例加以說明。
本發(fā)明采用由辣椒葉片內分離，經(jīng)人工誘變篩選出的能在植物體內定殖傳導的植物內生枯草芽孢桿菌BS-2(Bacillus subtilis，已于2002年10月14日送交位于北京市中關村的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC NO.0819)為生產(chǎn)菌株，產(chǎn)品的配方如下配方一、花生餅粉培養(yǎng)基(重量％)花生餅粉 2.5％ 葡萄糖1.0％KH2PO40.05％ K2HPO40.05％CaCO30.1％ H2O 96.3％配方二、黃豆粉培養(yǎng)基(重量％)黃豆餅粉 2.5％ 淀粉 1.0％葡萄糖1.0％ KH2PO40.1％K2HPO40.1％ CaCO30.1％H2O 95.2％配方三、普通細菌NB培養(yǎng)基(重量％)牛肉浸膏 0.3％蛋白胨 0.5％葡萄糖0.25％ H2O 98.95％調PH值為6.7(滅菌后)，在28℃的條件下，180r/min黑暗振蕩培養(yǎng)48小時，即可獲得BS-2植物內生枯草芽孢桿菌制劑。
工業(yè)生產(chǎn)方法。以植物內生枯草芽孢桿菌BS-2為生產(chǎn)菌種，取上述配方中的一種，進行工業(yè)生產(chǎn)。水劑生產(chǎn)工藝按常規(guī)工業(yè)發(fā)酵工藝砂土管菌種→斜面活化→搖瓶考察→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)，將發(fā)酵罐培養(yǎng)液加水配兌即可獲得BS-2植物內生枯草芽孢桿菌水劑；粉劑生產(chǎn)工藝繼上述的發(fā)酵罐培養(yǎng)工序之后，按常規(guī)粉劑生產(chǎn)工藝過濾濃縮→吸附→噴霧干燥→質量檢驗→包裝→成品入庫，即可以生產(chǎn)BS-2植物內生枯草芽孢桿菌粉劑。
權利要求
1.一種植物內生枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌為植物內生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCC NO.0819；
2.根據(jù)權利要求1所述的一種植物內生枯草芽孢桿菌，其特征在于，用抗利福平與拮抗植物病原真菌雙標記進行內生測定，從植株體內回收分離的菌株，在含利福平培養(yǎng)基上出現(xiàn)與原始菌株相同菌落；其形態(tài)特征為菌落圓形、淡黃色，菌體桿狀，周毛鞭毛，產(chǎn)芽胞；
3.一種植物內生枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于以權利要求1或者2所述的植物內生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CGMCCNO.0819為生產(chǎn)菌株，其培養(yǎng)基的配方如下花生餅粉培養(yǎng)基(重量％)花生餅粉 1.5-5.0％ 葡萄糖 0.05-2.0％KH2PO40.001-0.2％K2HPO40.001-0.2％CaCO30.001-0.2％H2O 93-98％
4.根據(jù)權利要求3所述的一種植物內生枯草芽孢桿菌制劑，其特征在于培養(yǎng)基的配方如下花生餅粉培養(yǎng)基(重量％)花生餅粉 2.5％葡萄糖 1.0％KH2PO40.05％K2HPO40.05％CaCO30.1％ H2O 96.3％
全文摘要
一種植物內生枯草芽孢桿菌及其制劑，其菌株BS－2(Bacillussubtilis，CGMCC NO.0819)，是由辣椒葉片內分離，經(jīng)人工誘變篩選出的新菌株?？稍谳^低的菌液濃度下主動進入植物體內，并能在植物體內定殖繁殖和傳導；對植物同時具有促進生長和防病作用；其制劑用于浸種時對白菜和辣椒苗鮮重可增加90％以上；噴霧施用時，對辣椒苗和果的炭疽病、白菜炭疽病及香蕉炭疽病具有80％以上的防病效果。
文檔編號A01N63/00GK1506455SQ0214781
公開日2004年6月23日 申請日期2002年12月7日 優(yōu)先權日2002年12月7日
發(fā)明者胡方平, 何紅 申請人:福建農(nóng)林大學