專利名稱：具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶的制作方法
本申請(qǐng)要求1999年3月1日提交的序號(hào)為60/127,032的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的權(quán)益。
背景技術(shù)：
肌醇六磷酸酶是催化從肌醇六磷酸分步除去無機(jī)正磷酸的肌醇六磷酸磷酸水解酶(1)。有兩種類型的肌醇六磷酸酶。一類被稱為3-肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.8)，該類酶啟動(dòng)在所述肌醇環(huán)的位置1和位置3除去磷酸基團(tuán)。另一類被稱為6-肌醇六磷酸酶(EC.3.1.3.26)，該類酶首先在該環(huán)的6號(hào)位釋放出磷酸根。雖然尚未從動(dòng)物組織中鑒定出肌醇六磷酸酶，但是，植物通常含有6-肌醇六磷酸酶，且各種各樣的微生物包括細(xì)菌、絲狀真菌和酵母產(chǎn)生3-肌醇六磷酸酶(2-9)。因?yàn)樵谟芍参锒鴣淼氖澄锘蝻暳现校^70％的總磷呈單胃動(dòng)物和人僅利用差的肌醇六磷酸酯的狀態(tài)；所以在改善這些種類的礦質(zhì)營養(yǎng)方面，肌醇六磷酸酶具有極大的用途(10-16)。在豬和家禽的食物中補(bǔ)充的微生物肌醇六磷酸酶有效地提高肌醇六磷酸酯之磷的生物利用度，并減少對(duì)無機(jī)磷補(bǔ)充的需要(11-15)，從而在集約家禽生產(chǎn)區(qū)中產(chǎn)生較少的磷污染(8-15)。但是，因?yàn)樵谖负托∧c中，大概由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白酶解而降解相當(dāng)大量的肌醇六磷酸酶(13)，因而在動(dòng)物食物中補(bǔ)充比較高水平的肌醇六磷酸酶是必需的(10-16)。同時(shí)，還沒研究各種各樣的肌醇六磷酸酶的蛋白酶解之分布型(profile)。顯然，為了改善肌醇六磷酸酶的營養(yǎng)價(jià)值，更好地了解肌醇六磷酸酶對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的敏感性可能是有益的。已在黑曲霉(Aspergillus niger)肌醇六磷酸酶基因的原始宿主中超量表達(dá)了黑曲霉肌醇六磷酸酶的基因(phyA)(17)，并且已將重組的肌醇六磷酸酶(r-PhyA，EC.3.1.3.8)作為一種商品化的肌醇六磷酸酶用于動(dòng)物食物中(13，14)。這種酶是一種大約80kDa的糖蛋白。同樣，已表征了大腸桿菌(E.coli)pH2.5酸性磷酸酶基因(appA)(18，19)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)在動(dòng)物食物中釋放肌醇六磷酸之磷方面，重組的肌醇六磷酸酶(r-AppA，EC3.1.3.2)和r-PhyA是一樣有效的(14)。
但是，補(bǔ)充有限的市售肌醇六磷酸酶的花費(fèi)以及該酶活性對(duì)飼料制粒之熱的不穩(wěn)定性妨礙該酶在畜牧業(yè)方面的實(shí)際應(yīng)用。因此，需要供動(dòng)物飼料之用的、具有高水平肌醇六磷酸酶活性和高水平穩(wěn)定性的酶。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。通過用一種蛋白酶處理該磷酸酶，產(chǎn)生一種具有增加的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。
本發(fā)明還提供一種編碼具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段的重組基因。所述載體包括一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)編碼該磷酸酶片段的編碼區(qū)和一個(gè)終止子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過用一種蛋白酶處理該磷酸酶而增加磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的方法。
本發(fā)明也提供一種具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶，該酶具有SEQ.ID No.1中顯示的氨基酸序列。
附圖簡述


圖1顯示了蛋白酶消化后的肌醇六磷酸酶活性的變化。
圖1A顯示了以不同的胰蛋白酶/蛋白比率(w/w)(r＝0.001、0.005、0.01、以及0.025)保溫的r-PhyA和r-AppA之肌醇六磷酸酶活性的變化。符號(hào)r-PhyA(■)和r-AppA(●)。所述結(jié)果為來自5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。*表示對(duì)未處理的r-PhyA或r-AppA對(duì)照的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。
圖1B顯示了以不同的胃蛋白酶/蛋白比率(w/w)(r＝0.001、0.005和0.01)保溫的r-PhyA和r-AppA之肌醇六磷酸酶活性的變化。符號(hào)r-PhyA(□)和r-AppA(○)。所述結(jié)果為來自7個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。*表示對(duì)未處理的r-PhyA或r-AppA對(duì)照的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。
圖2顯示在胰蛋白酶或胃蛋白酶的一段時(shí)間的水解過程(0、1、5、30、以及120分鐘)后，剩余的r-PhyA和r-AppA的肌醇六磷酸酶活性。符號(hào)胰蛋白酶消化的r-PhyA(■)或r-AppA(●)；胃蛋白酶消化的r-PhyA(□)和r-AppA(○)。所用的胰蛋白酶/肌醇六磷酸酶的比率(w/w)是r＝0.01(w/w)。所用的胃蛋白酶/肌醇六磷酸酶的比率是r＝0.005。所述結(jié)果為來自6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。*表示對(duì)未處理的r-PhyA或r-AppA對(duì)照的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。
圖3顯示了用不同量的胰蛋白酶(r＝0.001、0.005、0.01、以及0.025(w/w))的r-AppA(12％、A組)或r-PhyA(20％、B組)的消化產(chǎn)物之SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。用考馬斯藍(lán)將蛋白染色。T胰蛋白酶對(duì)照，C純化的r-AppA(A組)或r-PhyA(B組)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白參照物(M)為一組10kDa的梯(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、以及200kDa)(Gibco)。所述結(jié)果為來自4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
圖4顯示了來自用不同量的胃蛋白酶(r＝0.001、0.002、0.005、以及0.01(w/w))的r-AppA(圖4A)或r-PhyA(圖4B)的消化產(chǎn)物之SDS-聚丙烯酰胺凝膠(20％)電泳的結(jié)果。用考馬斯藍(lán)將蛋白染色。T胰蛋白酶對(duì)照，C純化的r-AppA(圖4A)或r-PhyA(圖4B)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白參照物(M)為一組10kDa的梯(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、以及200kDa)(Gibco)。所述結(jié)果為來自6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
圖5顯示了由于r-PhyA和r-AppA與不同濃度的胰蛋白酶(r＝0.001、0.005、0.01、以及0.025，w/w)(圖5A)或胃蛋白酶(r＝0.001、0.002、0.005、以及0.01)(圖5B)溫育而由大豆餅粕中釋放出的無機(jī)磷(iP)的量。符號(hào)r-AppA(■)，r-PhyA(□)。所述結(jié)果為來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值SEM。*表示對(duì)未處理的r-AppA或r-PhyA對(duì)照的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。
圖6顯示了appA2基因的核苷酸序列以及它的推斷的氨基酸序列。用小寫字母表示非翻譯區(qū)。加下劃線的序列是用來擴(kuò)增appA2(Pf11-22、以及K21468-1490)、appA2(E2243-22、以及K21468-1490)的引物?？蜃撛诘腘-糖基化位點(diǎn)。已將appA2的序列傳送到Genebank數(shù)據(jù)庫中，登記號(hào)為250016。
圖7是細(xì)胞外肌醇六磷酸酶活性(□)與酸性磷酸酶活性(○)、以及誘導(dǎo)后在用appA2轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的CIPPA2mRNA表達(dá)(◆)的時(shí)程。將結(jié)果以來自三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM表示。
圖8顯示了誘導(dǎo)后在用appA2轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母中的appA2mRNA表達(dá)的RNA印跡分析(圖8A)。用[α-32P]標(biāo)記的appA2作為探針來實(shí)現(xiàn)雜交。每條泳道上加載20μg的總RNA。B組代表在紫外光下由該酵母rRNA顯現(xiàn)的相同的RNA加載量。
圖9顯示了在37℃時(shí)，用肌醇六磷酸鈉作為底物的、純化的r-appA2(●)、r-appA(▲)和r-phyA(□)之酶促活性的pH依賴性。緩沖液pH1.5-4.5，0.2M甘氨酸-HCl；pH5.5-7.5，0.2M檸檬酸鹽；pH8.5-11，0.2M Tris-HCl。將結(jié)果以來自三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值SEM表示。
圖10顯示在不同溫度保溫了20分鐘后，r-appA2的剩余的酸性磷酸酶活性的非變性凝膠(15％)電泳分析。熱處理后，在把樣品加載到該凝膠上(200μg蛋白/泳道)之前，將所述樣品放在冰上達(dá)5分鐘。
圖11顯示了在大豆餅粕中用不同量(100、300、600和900PU)的純化的r-appA2酶(●)、r-appA酶(▲)和r-phyA酶(□)的肌醇六磷酸之磷的水解。*表示在r-appA2和其它兩種酶之間的顯著性差異(P＜0.05)。將結(jié)果表示為來自三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供一種具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。用一種蛋白酶處理該磷酸酶，并挑選具有磷酸酶活性的片段。正如在下面進(jìn)一步詳細(xì)論述的，與全長的肽相比，這些片段具有改良的肌醇六磷酸酶活性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白酶為胃蛋白酶。
除了通過全長肽的蛋白酶解而產(chǎn)生該活性片段之外，本發(fā)明也提供一種重組基因，所述基因具有一個(gè)啟動(dòng)子、一段編碼按照權(quán)利要求1的磷酸酶片段的編碼區(qū)和一個(gè)終止子?？梢杂迷撝亟M基因來直接表達(dá)截短的產(chǎn)物。
可以將改良的磷酸酶用于動(dòng)物飼料，以改善所述動(dòng)物對(duì)磷酸酯的利用性。
除了磷酸酶之外，本發(fā)明提供一種通過用一種蛋白酶處理該磷酸酶而增加磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶，該酶具有顯示于圖6中的SEQ.ID No.1中所示的氨基酸序列。
最好是，由細(xì)胞將所述具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽分泌到生長培養(yǎng)基中。這為較高的表達(dá)水平和更容易的產(chǎn)物分離創(chuàng)造條件。使具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽同一種能夠引導(dǎo)該蛋白離開該細(xì)胞的信號(hào)序列偶聯(lián)。優(yōu)選的是，由該蛋白切取該信號(hào)序列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將編碼一種具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽的異源基因與一種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件符合讀框地剪接。
一種優(yōu)選的磷酸酶由大腸桿菌的appA基因編碼。最初被定義為大腸桿菌胞質(zhì)磷酸酐磷酸水解酶(appA)基因的該基因含有1,298個(gè)核苷酸(Genebank的登記號(hào)為M58708)。首先發(fā)現(xiàn)該基因在大腸桿菌中編碼一種最適pH為2.5的酸性磷酸酶蛋白(EcAP)。該酸性磷酸酶是一種分子量為44,644道爾頓的單體。成熟的EcAP含有410個(gè)氨基酸(18)。Ostanin等用一種pT7載體在大腸桿菌BL21中超量表達(dá)了appA，并使其酸性磷酸酶活性增加了大約400倍(440mU/mg蛋白)(20)。先前不知道該appA基因的產(chǎn)物具有肌醇六磷酸酶的活性。
可以在任何原核表達(dá)系統(tǒng)或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所述的磷酸酶?？梢岳酶鞣N各樣的宿主-載體系統(tǒng)來表達(dá)編碼所述蛋白的序列。優(yōu)選的載體包括病毒載體、質(zhì)粒、粘粒或一種寡核苷酸。首要的是，所述載體系統(tǒng)必須與所用的宿主細(xì)胞是相容的。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于下面那些系統(tǒng)用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，諸如包含酵母載體的酵母之類的微生物，用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等等)感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，以及由細(xì)菌感染的植物。這些載體的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性方面不同。根據(jù)所利用的宿主-載體系統(tǒng)，可以用許多合適的轉(zhuǎn)錄元件和翻譯元件中任何一種。
用于表達(dá)磷酸酶的優(yōu)選宿主包括真菌細(xì)胞，包括酵母菌種或絲狀真菌菌種的真菌細(xì)胞，且可依據(jù)本發(fā)明將所述真菌細(xì)胞用作宿主細(xì)胞。優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的不同菌株。也可使用如克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的其它酵母。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用來超量表達(dá)該蛋白的酵母菌株是釀酒酵母。絲狀真菌宿主細(xì)胞包括曲霉屬和鏈孢霉屬(Neurospora)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述酵母菌株是一種甲基營養(yǎng)酵母菌株。甲基營養(yǎng)酵母是能夠利用甲醇作為碳源來產(chǎn)生維持細(xì)胞功能所必需的能源且包含一種用于表達(dá)醇氧化酶的基因的那些酵母屬。典型的甲基營養(yǎng)酵母包括畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母菌屬(Torulopsis)、假絲酵母屬(Candida)和Karwinskia的成員。這些酵母屬能用甲醇作為唯一的碳源。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該甲基營養(yǎng)酵母菌株為巴斯德畢赤酵母。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，其中在57-65℃的溫度范圍內(nèi)具有最適活性。一種更優(yōu)選的具體實(shí)施方案是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，其中其最適活性的溫度范圍是從58-62℃。
而另一種優(yōu)選的具體實(shí)施方案是具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，其中在80℃加熱蛋白達(dá)15分鐘后該蛋白至少保留其活性的40％。更優(yōu)選的具有肌醇六磷酸酶活性的、其中在60℃加熱蛋白達(dá)15分鐘后該蛋白至少保留其活性的60％的蛋白或多肽。
用幾種方法可獲得純化的蛋白。最好是用常規(guī)技術(shù)以純化的形式(優(yōu)選至少約80％純度、更優(yōu)選90％純度)產(chǎn)生出本發(fā)明的蛋白或多肽。通常，將本發(fā)明的蛋白或多肽分泌到重組宿主細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中。用另一種方法，產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白或多肽，但不將其分泌到生長培養(yǎng)基中。在這樣的實(shí)例中，為了分離該蛋白，則增殖包含一種重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞；通過超聲處理、熱處理、或化學(xué)處理，裂解宿主細(xì)胞；以及將勻漿離心以除去細(xì)胞碎片。然后，使該上清液經(jīng)受順序的硫酸銨沉淀。在一根適當(dāng)大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中使包含本發(fā)明多肽或蛋白的級(jí)分經(jīng)受凝膠過濾，從而分離該蛋白。必要時(shí)，可以用HPLC進(jìn)一步純化該蛋白級(jí)分。
本發(fā)明也提供一種含有異源基因的酵母菌株，該異源基因編碼具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽。應(yīng)該把該異源基因功能性地連接到一個(gè)能夠在酵母中表達(dá)肌醇六磷酸酶的啟動(dòng)子上，且后接一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。
而本發(fā)明的另一方面是用于在宿主中表達(dá)肌醇六磷酸酶的載體。該載體攜帶一種編碼具有肌醇六磷酸酶活性之蛋白或多肽的磷酸酶基因。
對(duì)于克隆到酵母中，可以將該基因克隆到自主復(fù)制或整合到酵母基因組中的任一載體上。例如YEp質(zhì)粒的自主復(fù)制型質(zhì)粒的拷貝數(shù)可以是高的，但其有絲分裂的穩(wěn)定性可能不夠(48)。它們可含有負(fù)責(zé)自主復(fù)制的2μ質(zhì)粒序列和個(gè)負(fù)責(zé)在大腸桿菌中復(fù)制的大腸桿菌序列。該載體最好包含一種用于酵母轉(zhuǎn)化子選擇的遺傳標(biāo)記和一種在大腸桿菌中用于選擇的抗性基因。包含ARS序列和CEN序列的附加型載體以每個(gè)細(xì)胞單個(gè)拷貝的形式而存在，且它們比所述YEp載體更穩(wěn)定。當(dāng)以一個(gè)或多個(gè)拷貝的形式將一種DNA片段整合到酵母基因組中時(shí)，使用整合型載體。在這種情況下，該重組DNA是穩(wěn)定的，且不需要選擇(49-51)。某些載體具有復(fù)制起點(diǎn)，該復(fù)制起點(diǎn)在選定的宿主細(xì)胞中起作用。合適的復(fù)制起點(diǎn)包括2μ、ARS1和25μM。所述載體具有用于插入融合基因和啟動(dòng)子序列的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和選擇標(biāo)記?？梢酝ㄟ^去掉或添加限制性位點(diǎn)、或者除去其它不想要的核苷酸，來修飾該載體。
可以將該肌醇六磷酸酶基因置于任何啟動(dòng)子的控制之下(52)。人們可選擇一種組成型酵母啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)型酵母啟動(dòng)子。用于酵母載體的合適啟動(dòng)子序列尤其還包括金屬硫蛋白的啟動(dòng)子、3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子(53)或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子(54)，所述其它糖酵解酶例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。在Hitzeman的EP A-73,657中進(jìn)一步描述了供酵母表達(dá)之用的其它合適載體和啟動(dòng)子，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。另一個(gè)可供選擇的啟動(dòng)子是葡萄糖阻抑型ADH2啟動(dòng)子(56，57)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
人們可以選擇一種組成型酵母啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)型酵母啟動(dòng)子。例如磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的其它編碼糖酵解酶的基因、以及α-因子基因的強(qiáng)啟動(dòng)子，都是組成型的。當(dāng)使用一種組成型啟動(dòng)子時(shí)，在細(xì)胞生長期間則合成該產(chǎn)物。用乙醇和葡萄糖調(diào)節(jié)ADH2啟動(dòng)子，用半乳糖和葡萄糖調(diào)節(jié)GAL-1-10和GAL7啟動(dòng)子，用磷酸鹽調(diào)節(jié)PHO5啟動(dòng)子，以及用銅調(diào)節(jié)金屬硫蛋白啟動(dòng)子。用溫度調(diào)節(jié)熱激啟動(dòng)子，HSP150啟動(dòng)子屬于所述的熱激啟動(dòng)子。也可以用雜合啟動(dòng)子。當(dāng)連續(xù)表達(dá)所需產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞有害時(shí)，使用一種調(diào)節(jié)型的啟動(dòng)子?？梢杂靡环N強(qiáng)的原核啟動(dòng)子例如T7啟動(dòng)子來代替酵母啟動(dòng)子，但在這種情況下，則必須用一種編碼相應(yīng)的聚合酶的基因來轉(zhuǎn)化該酵母菌株。至于轉(zhuǎn)錄終止，使用HSP150終止子或任何其它有功能的終止子。這里，把啟動(dòng)子和終止子稱為控制元件。本發(fā)明不限于任何特定的載體、啟動(dòng)子或終止子。
所述載體也可以攜帶一種選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記通常是抗生素抗性基因或能夠互補(bǔ)具有充分表征的代謝缺陷的酵母菌株的基因，例如色氨酸缺陷突變型或組氨酸缺陷突變型。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記包括URA3、LEU2、HIS3、TRP1、HIS4、ARG4或抗生素抗性基因。
所述載體也可以有能夠在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。在細(xì)菌菌株中操作載體更有效。優(yōu)選的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)為ColE1、Ori或oriT。
可以使用或來自酵母或來自肌醇六磷酸酶基因或其它來源的一種前導(dǎo)序列，來幫助所表達(dá)的肌醇六磷酸酶分泌到培養(yǎng)基中去。本發(fā)明不限于任何特定類型的前導(dǎo)序列或信號(hào)肽。
合適的前導(dǎo)序列包括酵母α-因子的前導(dǎo)序列，可以用該α-因子的前導(dǎo)序列來引導(dǎo)所述肌醇六磷酸酶的分泌。通常將該α-因子前導(dǎo)序列插入到啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)基因序列之間(58；美國專利號(hào)4,546,082；以及歐洲公布的專利申請(qǐng)?zhí)?24,274；所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。另一種合適的前導(dǎo)序列是作為165個(gè)氨基酸的前原(prepro)形式合成的釀酒酵母的MFα1(α-因子)，所述前原形式包括19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽或前肽(prepeptide)、后接64個(gè)氨基酸的“前導(dǎo)肽”或原肽(propeptide)，且包含三個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)、后接(LysArg(Asp/Glu，Ala)2-3α-因子)4(58)。已廣泛地用前原MFα1(preproMF α1)的信號(hào)肽-前導(dǎo)肽部分來達(dá)到釀酒酵母中異源蛋白的合成與分泌。從第4,546,082號(hào)美國專利、第116,201號(hào)歐洲專利申請(qǐng)、第123,294號(hào)歐洲專利申請(qǐng)、第123,544號(hào)歐洲專利申請(qǐng)、第163,529號(hào)歐洲專利申請(qǐng)、第123,289號(hào)歐洲專利申請(qǐng)以及第3614/83號(hào)DK專利申請(qǐng)了解與酵母同源的信號(hào)肽/前導(dǎo)肽的應(yīng)用，通過引用將上述專利和專利申請(qǐng)結(jié)合到本文中。在第123,289號(hào)歐洲專利申請(qǐng)中，描述了利用釀酒酵母α-因子前體，而WO 84/01153指出了釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)肽的利用，且德國專利申請(qǐng)DK 3614/83指出了為了分泌外源蛋白而利用釀酒酵母的PH05信號(hào)肽；上述三個(gè)文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
在酵母中表達(dá)的異源蛋白的分泌過程方面，也可以利用來自釀酒酵母(MFα1或MFα2)的α-因子信號(hào)肽-前導(dǎo)肽(第4,546,082號(hào)美國專利、第16,201號(hào)歐洲專利申請(qǐng)、第123,294號(hào)歐洲專利申請(qǐng)、第123,544號(hào)歐洲專利申請(qǐng)和第163,529號(hào)歐洲專利申請(qǐng)，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。通過在所需蛋白之基因的5’末端融合編碼釀酒酵母MFα1之信號(hào)序列/前導(dǎo)序列的DNA序列，證明了所需蛋白的分泌與加工。在公布的WO89/02463號(hào)和WO 90/10075號(hào)PCT申請(qǐng)中，描述了運(yùn)用了鼠唾液淀粉酶信號(hào)肽(或其突變體)來達(dá)到在酵母中表達(dá)的異源蛋白的分泌，通過引用將WO 89/02463號(hào)和WO 90/10075號(hào)PCT申請(qǐng)結(jié)合到本文中。
第5,726,038號(hào)美國專利描述了酵母天冬氨酸蛋白酶3的信號(hào)肽的應(yīng)用，該信號(hào)肽的運(yùn)用能夠提供改善的、在酵母中表達(dá)之蛋白的分泌。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，適宜于促進(jìn)重組多肽從酵母中分泌的其它前導(dǎo)序列是已知的?？梢栽诳拷皩?dǎo)序列3’端處修飾前導(dǎo)序列，以使該前導(dǎo)序列包含一個(gè)或更多個(gè)限制性位點(diǎn)。這將便于該前導(dǎo)序列與結(jié)構(gòu)基因的融合。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員，酵母轉(zhuǎn)化的方案是已知的。在Hinnen等的文章(59)中描述了一個(gè)這樣的方案。所述Hinnen等的方案在一種選擇性培養(yǎng)基中選擇Trp轉(zhuǎn)化子，其中，該選擇性培養(yǎng)基包括0.67％的酵母氮堿、0.5％的水解酪蛋白氨基酸、2％的葡萄糖、10μg/ml的腺嘌呤以及20μg/ml的尿嘧啶。
在穩(wěn)定表達(dá)的載體上、在人工染色體上、或通過整合到酵母宿主細(xì)胞的染色體上，可以保持所述的基因。通過把所述肌醇六磷酸酶基因克隆到將重組到酵母染色體上的載體中，可以完成進(jìn)入到染色體中的整合。適宜的載體可包括與酵母染色體中的核苷酸序列同源的核苷酸序列。用另一種方法，可以使該肌醇六磷酸酶基因位于能夠轉(zhuǎn)移該基因到染色體中的重組位點(diǎn)之間，所述重組位點(diǎn)例如轉(zhuǎn)座因子。
本發(fā)明也提供一種生產(chǎn)肌醇六磷酸酶的方法；即通過提供一種分離的磷酸酶基因，該磷酸酶基因編碼一種具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因。該磷酸酶最好是一種微生物的磷酸酶。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微生物的磷酸酶是一種大腸桿菌磷酸酶。同樣優(yōu)選的是微生物的磷酸酶AppA和AppA2。
也提供一種將肌醇六磷酸轉(zhuǎn)變成肌醇和無機(jī)磷的方法。用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，由一種生物分離出一種appA基因。然后，在宿主細(xì)胞中由該基因表達(dá)一種具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白或多肽。使所產(chǎn)生的蛋白或多肽與肌醇六磷酸混合或接觸。這種技術(shù)對(duì)于處理食物或動(dòng)物飼料中的肌醇六磷酸是特別有用的。
從大腸桿菌中分離出優(yōu)選的appA基因。
雖然在酵母系統(tǒng)中產(chǎn)生的所述肌醇六磷酸酶與當(dāng)前商品化的肌醇六磷酸酶一樣有效地從玉米和大豆里釋放出肌醇六磷酸酯之磷，但所述肌醇六磷酸酶好象是更耐熱的?？梢杂眠@種酵母中的肌醇六磷酸酶超量表達(dá)系統(tǒng)來提供供食品和飼料工業(yè)之用的耐熱的肌醇六磷酸酶。
實(shí)施例實(shí)施例1用于實(shí)施例2-6的材料與方法r-AppA的表達(dá) 從用表達(dá)載體pAPPA1(20)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21菌株中獲得appA基因(Genebank的登記號(hào)為M58708)。按照制造商的說明書(Perkin Elmer)，通過PCR，擴(kuò)增包含appA編碼區(qū)的1.35kb的DNA片段。引物衍生自該核苷酸序列(18)的5’和3’區(qū)域，且所述引物包括E2[正向的242-252]5’GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA3’(SEQ.ID.NO.2)；以及K2[反向的1468-1490]5’GGGGTACCTTACAAACTGCACG3’(SEQ.ID.NO.3)。這兩種引物由康乃爾大學(xué)寡核苷酸合成實(shí)驗(yàn)室(the Cornell University OligonucleotideSynthesis Facility)(Ithaca，NY))合成。從1％的瓊脂糖凝膠中切下擴(kuò)增的產(chǎn)物，并用GENECLEAN II試劑盒(Bio101)將其洗脫。首先把純化的該片段克隆到pGEM T-easy載體(Promega)中，然后在EcoRI位點(diǎn)，將該片段插入到酵母表達(dá)載體pPIcZαA(Invitrogen)中。將大腸桿菌菌株TOP10F’(Invitrogen)用作原始宿主來擴(kuò)增這兩種構(gòu)成物。按照制造商的說明書(Invitrogen)，通過電穿孔，將包含appA的pPIcZαA載體轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母菌株X33中。將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞鋪平板到Y(jié)PD-Zeocin瓊脂培養(yǎng)基中；且在具有甘油的基本培養(yǎng)基(BMGY)中將陽性菌落培養(yǎng)24小時(shí)。當(dāng)所述酵母細(xì)胞密度達(dá)到2.5×108個(gè)細(xì)胞/ml(OD600＝5)時(shí)，將細(xì)胞離心；并用0.5％的甲醇培養(yǎng)基(BMMY)懸浮所述的細(xì)胞，以誘導(dǎo)appA基因的表達(dá)。誘導(dǎo)后，從所述轉(zhuǎn)化了的X33細(xì)胞中提取酵母基因組的總DNA；且將其用作模板，使用上文描述的同樣的引物，通過PCR，來核實(shí)所述appA基因的存在。在康乃爾大學(xué)DNA服務(wù)實(shí)驗(yàn)室(the Cornell University DNAServices-Facility)中，運(yùn)用以Dye Deoxy終止物的Taq循環(huán)自動(dòng)化測序(Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA)，來測定所擴(kuò)增的DNA片段的序列。
r-PhyA和r-AppA的純化 從BASF(Mt Olive，NJ)獲得r-PhyA。開始時(shí)，既將r-PhyA酶、又將r-AppA酶懸浮于pH7的50mM Tris-HCl中，且添加硫酸銨至25％飽和度。在離心(25,000g，20分鐘)該混合物后，保留上清液，并添加硫酸銨至75％飽和度。然后，離心(25,000g，20分鐘)該混合物，并將沉淀懸浮到10ml pH7的25mM Tris-HCl中。使該懸浮液對(duì)同一緩沖液透析過夜，并將其加到一根用pH7的25mM Tris-HCl平衡的DEAE-瓊脂糖柱(Sigma)上。在用200ml(n-LL)pH7的25mM Tris-HCl洗滌該柱后，用pH7的0.2MNaCl、25mM Tris-HCl來稀釋蛋白。分析所收集的所有級(jí)分的肌醇六磷酸酶活性及蛋白濃度(21)。在4℃下進(jìn)行全部的純化過程，且在分析之前，將所述級(jí)分貯藏在-20℃。
蛋白酶解和蛋白電泳 按照制造商的說明書(Sigma)，將純化的r-AppA和r-PhyA(2mg/ml)與不同量的胃蛋白酶和胰蛋白酶保溫。分別地，將胃蛋白酶(800單位/mg蛋白)溶解到pH2的10mM HCl(0.1mg/ml)中，且將胰蛋白酶(1,500BAEE單位/mg蛋白)溶解到pH7.5的80mM碳酸氫銨(0.1mg/ml)中。一個(gè)BAEE單位被定義為用BAEE作為底物，在pH7.6和25℃時(shí)，每分鐘在253nm的0.001的吸光度變化。按100μl的終體積，在37℃將10μg純化的r-PhyA(0.1PU)或r-AppA(0.08PU)與胰蛋白酶或胃蛋白酶以范圍為0.001-0.01的蛋白酶/肌醇六磷酸酶(w/w)的比率保溫1小時(shí)至120分鐘。在冰上停止該反應(yīng)，且為了蛋白電泳和肌醇六磷酸酶活性分析而將該混合物的pH調(diào)節(jié)到8。用先前描述的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳或尿素-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析消化的蛋白混合物(22，23)。
肌醇六磷酸酶活性以及來自大豆餅粕的肌醇六磷酸之磷的水解 如同先前描述的(24)，在蛋白酶解之前或在蛋白酶解的不同時(shí)間點(diǎn)，既測定r-PhyA的肌醇六磷酸酶活性，又測定r-AppA的肌醇六磷酸酶活性。用Chen等的方法(25)來分析所釋放的無機(jī)磷(iP)。一個(gè)肌醇六磷酸酶單位(PU)被定義為在37℃時(shí)，每分鐘從肌醇六磷酸鈉釋放出1μmol無機(jī)磷的酶活性。為了證實(shí)胰蛋白酶與胃蛋白酶對(duì)r-PhyA和r-AppA剩余活性的蛋白酶解效應(yīng)，監(jiān)測了用與不同量之胰蛋白酶或胃蛋白酶保溫的這兩種酶從大豆餅粕中的肌醇六磷酸酯之磷的水解。在一個(gè)5ml的總反應(yīng)中，在37℃時(shí)(at 3VC)，將0.5mg純化的r-PhyA(5PU)或r-AppA(4PU)與1克大豆餅粕和在pH2.5的10mM HCl中的胃蛋白酶或在pH6.8的0.2M檸檬酸鹽中的胰蛋白酶保溫2小時(shí)。如同上面描述地測定所釋放的無機(jī)磷(iP)。實(shí)施例2r-AppA和r-PhyA的制備在用所述appA基因轉(zhuǎn)化的X33中，超過30個(gè)的菌落表達(dá)水解肌醇六磷酸鈉的胞外肌醇六磷酸酶活性。菌落26具有最高的該酶活性(88U/ml)，且選擇其用于進(jìn)一步的研究。在從所述的DEAE-瓊脂糖柱上洗脫出r-PhyA和r-AppA樣品后，收集了每份4ml的45份級(jí)分以分析肌醇六磷酸酶活性。用于蛋白酶解的級(jí)分的r-PhyA和r-AppA的肌醇六磷酸酶比活分別為9.6U/mg蛋白和8.1U/mg蛋白。實(shí)施例3胰蛋白酶消化對(duì)兩種酶的肌醇六磷酸酶活性的影響在胰蛋白酶消化2小時(shí)之后，r-PhyA和r-AppA之間的剩余肌醇六磷酸酶活性有顯著性差異(
圖1A)。雖然在胰蛋白酶/肌醇六磷酸酶的比率為0.001及0.005時(shí)，兩種酶保留了其最初活性的85％以上；但在所述比率為0.01和0.025時(shí)，r-AppA相應(yīng)地分別失去其最初活性的64％和74％。同時(shí)，r-PhyA僅相應(yīng)地分別失去了其最初活性的14％和23％。因?yàn)檫@兩種酶對(duì)胰蛋白酶消化的敏感性在所述比率為0.01時(shí)有明顯差異，而以這種比率進(jìn)行時(shí)程研究。胰蛋白酶消化一直到2小時(shí)，r-PhyA仍保留著其最初活性的90％(圖2)。比較起來，在消化1分鐘、5分鐘、30分鐘和120分鐘后，r-AppA相應(yīng)地分別失去了其最初活性的64％、77％、87％和95％。實(shí)施例4胃蛋白酶消化對(duì)兩種酶的肌醇六磷酸酶活性的影響在胃蛋白酶消化2小時(shí)之后，剩余的r-AppA的肌醇六磷酸酶活性是完全意想不到的。在所述比率為0.001和0.002時(shí)，該肌醇六磷酸酶活性或者保持不變，或者微微增加。在所述比率為0.005及0.01時(shí)，與最初的活性值相比，則使該肌醇六磷酸酶活性增加了30％。然而，在這兩種高比率時(shí)，r-PhyA失去了其最初活性的58％及77％(
圖1B)。因?yàn)樵谒霰嚷蕿?.005時(shí)r-PhyA和r-AppA之間在反應(yīng)方面有顯著性差異，而將這種比率用于一種跟蹤時(shí)程研究。當(dāng)將所述r-AppA與胃蛋白酶保溫0分鐘至30分鐘時(shí)，肌醇六磷酸酶活性隨著時(shí)間而逐步增加。此后，沒觀察到進(jìn)一步的增加(圖2)。但是，在保溫1分鐘、5分鐘、30分鐘和120分鐘后，r-PhyA相應(yīng)地分別失去了其最初活性的42％、73％、82％和92％。實(shí)施例5SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳當(dāng)將r-AppA與胰蛋白酶保溫時(shí)，在所述比率高于0.01時(shí)，則該酶蛋白被降解；而在所述比率為0.025時(shí)，則看不見該酶蛋白。有一條大約28kDa的主帶，在所述三種低比率的胰蛋白酶中在這條帶和完整蛋白之間，有幾條其它的帶。然而，在所述胰蛋白酶的比率為最高時(shí)，則那條主帶明顯減弱，且其它帶消失(圖3A)。如果將所述r-AppA與不同量的胰蛋白酶保溫，則有許多的中間帶；且在所述胰蛋白酶比率為最高時(shí)，至少有三條看得見的帶(圖3B)。如果以高于0.002的所述比率將r-AppA與胃蛋白酶保溫，則顯示出一條大約8.4kDa的獨(dú)特帶(圖4A)。另一方面，用不同量之胃蛋白酶的r-PhyA的蛋白酶解，除了產(chǎn)生一種大約14kDa的主要片段外，還產(chǎn)生許多擴(kuò)散的且輪廓不清的帶(圖4B)。實(shí)施例6蛋白酶解對(duì)用r-PhyA和r-AppA水解出肌醇六磷酸酯之磷的影響當(dāng)在37℃將r-AppA與大豆餅粕和不同量的胰蛋白酶保溫2小時(shí)時(shí)，則在所述比率為0.001、0.005、0.01和0.025時(shí)，從大豆餅粕中釋放出的無機(jī)磷的減少相應(yīng)地分別為3％、13％、34％和52％(圖5A)。同時(shí)，在同樣的條件下，對(duì)于r-PhyA，則所述的減少分別為3％、6％、13％和28％。與對(duì)照相比，添加胃蛋白酶到r-AppA(比率為0.005)和大豆餅粕的混合物中，導(dǎo)致從大豆餅粕中釋放出的無機(jī)磷增加大約30％(圖5B)。比較起來，在由r-PhyA釋放無機(jī)磷方面，同樣的處理產(chǎn)生大于50％的減少。
迄今為止，關(guān)于微生物的肌醇六磷酸酶對(duì)胰蛋白酶和胃蛋白酶的敏感性，還沒有具體的數(shù)據(jù)。在這個(gè)研究中，把兩種部分純化的重組肌醇六磷酸酶暴露于單一的蛋白酶消化，且測定了蛋白酶解對(duì)其剩余活性的影響以及對(duì)其從大豆餅粕中釋放出肌醇六磷酸酯之磷的能力的影響。這些結(jié)果已表明r-PhyA比r-AppA更抗胰蛋白酶而對(duì)胃蛋白酶的抗性較弱。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，這兩種肌醇六磷酸酶的蛋白酶解方式也是顯然不同的。推測起來，r-PhyA和r-AppA之間對(duì)蛋白酶的不同敏感性，可能與其一級(jí)氨基酸序列特征以及肽折疊的特性有關(guān)；因?yàn)閮煞N酶之間的氨基酸序列同源性(～15％)聯(lián)系著這(17，18)。然而，在考慮肌醇六磷酸酶之蛋白酶解的分子機(jī)制時(shí)，則應(yīng)該給予注意；這超出了本研究原先的范圍。近來在phyA肌醇六磷酸酶(26)和一種大腸桿菌肌醇六磷酸酶(27)的結(jié)晶和(或)初步的X-射線分析方面的進(jìn)展能夠幫助我們了解其蛋白酶解反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
意想不到的是，在胃蛋白酶消化后，r-AppA顯示出剩余的肌醇六磷酸酶活性增長30％。同樣，在存在胃蛋白酶的情況下，這種酶也從大豆餅粕中釋放出30％額外的無機(jī)磷。根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，r-AppA顯然依照著不同的保溫期而被胃蛋白酶降解成小肽。可能的是，可能有潛在的抗胃蛋白酶的、與完整r-AppA蛋白相比具有較高的肌醇六磷酸酶活性的多肽。雖然SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析沒有為我們提供任何有關(guān)這樣的肽的具體信息，但是，已表明了胃蛋白酶將天然蛋白或合成蛋白轉(zhuǎn)變成活性多肽，例如將豬的內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)變成有活性的21個(gè)殘基的內(nèi)皮縮血管肽(28)。胃蛋白酶也可以調(diào)節(jié)某些蛋白的結(jié)構(gòu)與功能(29，30)。正如上面所提到的，關(guān)于phyA(26)和大腸桿菌肌醇六磷酸酶(27)的近來的結(jié)晶數(shù)據(jù)的可用性，能促進(jìn)所述appA基因的定向定點(diǎn)誘變或缺失。因此，有可能揭示出與胃蛋白酶水解有關(guān)的r-AppA的肌醇六磷酸酶活性增加的分子機(jī)制。盡管抗胃蛋白酶的r-AppA肽的生化不確定性，這個(gè)發(fā)現(xiàn)仍有重大的營養(yǎng)意義。因?yàn)槲傅鞍酌甘俏钢械闹饕鞍酌?，且是一種充分描述的天冬氨酸蛋白酶(31)，因此，一種抗胃蛋白酶的肌醇六磷酸酶多肽讓我們能夠以足夠的酶活性而補(bǔ)充少量的酶到所述的食物中；因而將減少家畜生產(chǎn)中應(yīng)用食物肌醇六磷酸酶的花費(fèi)。
將用于本研究的蛋白酶活性水平與生理?xiàng)l件下的蛋白酶活性水平進(jìn)行比較是困難的，因?yàn)轶w內(nèi)的胃蛋白酶和胰蛋白酶的濃度還沒被很好地描述過。已報(bào)道了豬腸中的平均胰蛋白酶活性為20-25U/毫克蛋白(32)，這比在本文中使用的劑量高得多。無論如何，使用多種水平的胰蛋白酶和胃蛋白酶，在最低水平和最高水平之間有10至25倍范圍的差異。另外，在存在胃蛋白酶或胰蛋白酶的情況下，即在一種模擬的體內(nèi)消化條件下，測定了由r-AppA或r-PhyA從大豆餅粕中釋放出的無機(jī)磷。雖然r-AppA和r-PhyA都是部分純化的，但所有的數(shù)據(jù)都一致地表明這兩種重組酶對(duì)胃蛋白酶和胰蛋白酶的截然不同的反應(yīng)方式。因此，這種體外的觀察可能是與生理狀態(tài)有關(guān)的。實(shí)施例7用于實(shí)施例8-12的材料與方法產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的細(xì)菌菌落的分離與鑒定 由在康乃爾大學(xué)養(yǎng)豬場(Cornell University Swine Farm)中圈飼的雜種Hampshire-Yorkshire-Duroc豬(13周齡)獲得結(jié)腸內(nèi)含物。用實(shí)用的玉米-大豆餅粕食物來喂養(yǎng)這些豬。在殺死所述豬后，立即通過無菌步驟取出結(jié)腸的內(nèi)含物，并將其保存在無氧、無菌塑料袋中。在一個(gè)帶橡皮塞的250ml錐形燒瓶中，用190ml的厭氧瘤胃液葡萄糖培養(yǎng)基稀釋10克樣品。在CO2環(huán)境中將該混合物劇烈地?fù)u動(dòng)3分鐘。相應(yīng)地進(jìn)行一系列的連續(xù)稀釋。
在一種改進(jìn)的、含有不溶解性肌醇六磷酸鈣的瘤胃液-葡萄糖-纖維二糖-瓊脂培養(yǎng)基(43，44)中，將稀釋的樣品于37℃培養(yǎng)3天。將伴隨著亮區(qū)的菌落作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外肌醇六磷酸酶活性的潛在生產(chǎn)者來研究。用肌醇六磷酸鈉作為底物來測定肌醇六磷酸酶的活性(24)。一個(gè)肌醇六磷酸酶單位(PU)被定義為在37℃時(shí)，每分鐘從肌醇六磷酸鈉中釋放出1μmol無機(jī)磷的酶活性。用磷酸對(duì)硝基苯酯(P-NPP)作為底物，按照制造商的說明書(Sigma，St.Louis，MO)來測定酸性磷酸酶的活性。在康乃爾獸醫(yī)學(xué)院診斷實(shí)驗(yàn)室(the Diagnostic Laboratory of Cornell Veterinary College)(Ithaca，NY)中進(jìn)行了選定菌落的鑒定。通過標(biāo)準(zhǔn)步驟確定了所分離菌落的形態(tài)學(xué)特征和生理學(xué)特征。
DNA擴(kuò)增和測序 因?yàn)楫a(chǎn)生最高的酸性磷酸酶活性和肌醇六磷酸酶活性的菌落被鑒定為一株大腸桿菌菌株，所以用起源于大腸桿菌pH2.5酸性磷酸酶基因(appA，Genebank的登記號(hào)為145283)(18)之DNA序列的引物來分離所述的基因。在康乃爾大學(xué)寡核苷酸合成實(shí)驗(yàn)室合成下述的引物，即引物Pfl[正向的1-22]5’-TAAGGAGCAGAAACAATGTGGT-3’(SEQ.ID.NO.4)、E2[正向的254-264]5’-GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA-3’(SEQ.ID.NO.5)和K2[反向的1468-1491]5’-GGGGTACCTTACAAACTGCACG-3’(SEQ.ID.NO.6)。分別地，用[Pf1-K2]引物擴(kuò)增全序列，用[E2-K2]引物來擴(kuò)增該編碼區(qū)。所述PCR反應(yīng)混合物(100μl)包含作為模板的500ng基因組DNA、各種引物各100pmol、5U的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT)、pH8.3的10mM Tris-HCl、50mM KCl、12.5mM MgCl2和各種dNTP(Promega，Madison，WI)各200μM。用GeneAmp PCR系統(tǒng)2400(PerkinElmer)來完成該反應(yīng)。所述熱程序包括94℃(3分鐘)的一個(gè)循環(huán)、[94℃(0.8分鐘)、54℃(1分鐘)以及72℃(2分鐘)]的30個(gè)循環(huán)、以及在72℃(10分鐘)的一個(gè)循環(huán)。通過1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖(Gibco BRL，Grand Island，NY)凝膠電泳，來分離所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。切割下包含預(yù)期大小之帶的凝膠薄片，并用GENECLEAN II試劑盒(Bio101，Vista，CA)洗脫DNA。在康乃爾大學(xué)DNA服務(wù)實(shí)驗(yàn)室，使用用Dye Deoxy終止物的Taq循環(huán)自動(dòng)化測序(Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA)，來測定所述PCR產(chǎn)物的序列。進(jìn)行5次測序?qū)嶒?yàn)，并用多重序列對(duì)比程序CLUSTAL BLAST(45)，把推斷出的氨基酸序列與其它酸性磷酸酶和肌醇六磷酸酶進(jìn)行序列對(duì)比。在下文中，把鑒定出的兩種PCR片段[Pf1-K2]和[E2-K2]分別描述為appA2和appA2。為了比較的目的，用引物[E2-K2]來從大腸桿菌BL21(DE3)擴(kuò)增appA基因。如同上面描述的，實(shí)施所述聚合酶鏈反應(yīng)并處理所產(chǎn)生的片段。
亞克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建 按照制造商的說明書，將PCR產(chǎn)物[E2-K2]和[Pf1-K2]克隆到pGEMT-easy載體(Promega)中；然后將其轉(zhuǎn)化到TOP10F中以篩選陽性菌落。如由制造商的說明書所描述的，在EcoRI位點(diǎn)和KpnI位點(diǎn)，將分離的appA2片段和appA片段插入到pPICZαA(Invitrogen，San Diego，CA)中。將這些構(gòu)成物轉(zhuǎn)化到TOP10F細(xì)胞中去，并在含有25μg zeocin/ml的LB培養(yǎng)基上，將所述的TOP10F細(xì)胞鋪平板。然后，培養(yǎng)陽性菌落，以制備用于轉(zhuǎn)化的DNA。
酵母的轉(zhuǎn)化和表達(dá) 按照制造商的說明書，用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母菌株X33(Invitrogen)，并制備用于轉(zhuǎn)化的所述菌株X33。運(yùn)用BglII，使2μg質(zhì)粒DNA線性化；然后，通過電穿孔將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。在30℃于1M山梨糖醇中不搖動(dòng)地溫育3小時(shí)后，在YPD-zeocin瓊脂培養(yǎng)基中將這些細(xì)胞鋪平板，以篩選轉(zhuǎn)化的基因進(jìn)入到宿主染色體DNA的5’AOX1區(qū)域中的整合。2天后，用具有甘油的基本培養(yǎng)基(GMGY培養(yǎng)基)培育轉(zhuǎn)化子達(dá)24小時(shí)。在所述培養(yǎng)物達(dá)到約2.5×108個(gè)細(xì)胞/ml(OD600＝5)的密度后，將細(xì)胞離心下來(3500g，5分鐘)；然后，用0.5％的甲醇培養(yǎng)基(GMMY)懸浮所述的細(xì)胞，以誘導(dǎo)該肌醇六磷酸酶基因的表達(dá)。
RNA的定量 在誘導(dǎo)后，于不同的時(shí)間從所述appA2轉(zhuǎn)化子中提取總RNA。在1％的甲醛-瓊脂糖凝膠中分離所述RNA，并通過毛細(xì)作用的印跡法，將其轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上，且用UV將其交聯(lián)2分鐘。然后，在42℃將該膜預(yù)雜交4小時(shí)。探針為appA2[E2-K2]PCR片段，且使用Ready-to-go TM DNA標(biāo)記珠(Ready-To-Go TM DNA Labeling Beads)(Amersham PharmaciaBiotech)，用[α-32P]-dCTP(DuPont，Boston，MA)將其標(biāo)記。在42℃將該膜與所述探針雜交過夜，并用2×SSC(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)、1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)于25℃洗滌該膜3次達(dá)20分鐘以及在50℃洗滌該膜2次，且最后用0.2×SSC、0.1％的SDS于50℃洗滌該膜2次。通過將該膜對(duì)一個(gè)附有BAS-III FUJI成像底片(Fuji，Japan)的增感屏曝光達(dá)10小時(shí)，來產(chǎn)生放射自顯影圖；用一臺(tái)生物圖象分析儀(Bio-ImagingAnalyzer)(Kohshin Graphic Systems，F(xiàn)uji，Japan)將該放射自顯影圖定量。根據(jù)18SrRNA的相對(duì)水平來使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。
所表達(dá)酶的純化 在4℃下進(jìn)行所有的操作。用pH7的、具有25％硫酸銨飽和度的50mM Tris-HCl懸浮所表達(dá)的r-appA酶和r-appA2酶、以及在黑曲霉中表達(dá)的r-phyA肌醇六磷酸酶(由BASF友好地提供，Mt.Olive，NJ)。然后，以25,000g離心該懸浮液20分鐘。在12小時(shí)的攪動(dòng)期間，按照75％的硫酸銨飽和度，來調(diào)制所述上清液；并以25,000g離心該混合物20分鐘。然后，將沉淀懸浮到10ml pH7的25mM Tris-HCl中；并使該懸浮液對(duì)同一緩沖液透析過夜。將透析過的樣品加到一根用pH7的25mM Tris-HCl平衡的DEAE-瓊脂糖柱(Sigma)上。在用200ml同樣的緩沖液洗滌該柱后，用pH7的、溶于25mM Tris-HCl中的1M NaCl來洗脫結(jié)合的肌醇六磷酸酶。把顯示出最高肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性的三個(gè)級(jí)分匯集起來，并將其對(duì)pH7.5的25mM Tris-HCl透析過夜，以用于下面的研究。
電泳分析 用Lowry的方法(21)測定蛋白濃度。按照Laemmli所描述的方法(22)，進(jìn)行非變性凝膠電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(15％)。用考馬斯亮藍(lán)R-250將SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的蛋白染色。如先前所描述的(17)，檢測非變性凝膠帶中的酸性磷酸酶活性或肌醇六磷酸酶活性。電泳后，在0.2％α-19磷酸萘酯(naphtylphosphate)(或肌醇六磷酸鈉)、0.1％Fast Garnet GBC鹽、1mM CaCl2和pH7.0的0.5M Tris-HCl緩沖液中，把該凝膠在25℃保溫達(dá)20分鐘。
所述酶的去糖基化 按照制造商的說明書(New England Biolabs，Beverly，MA)，在7℃用0.3IU的內(nèi)切糖苷酶Hf(Endo Hf)進(jìn)行r-appA2的去糖基化達(dá)4小時(shí)。如上面描述的，用15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析去糖基化的蛋白。
酶的性質(zhì)及大豆餅粕中肌醇六磷酸酯之磷的水解 在33℃，用三種不同的緩沖液于不同的pH測定了肌醇六磷酸酶的活性。在各種酶的最適pH下測定其最適溫度。在37℃和各種酶的最適pH下，測定r-appA2和r-appA的Km值和Vmas值。將r-appA2的肌醇六磷酸酯之磷的水解與r-appA及r-phyA的肌醇六磷酸酯之磷的水解相比較。在所述酶各自最適的pH(對(duì)r-appA為2.5、對(duì)r-appA2為3.5和對(duì)r-phyA為5.5)下，在5ml緩沖液(10mM HCl或0.2M的檸檬酸鹽)中將不同量的純化的酶與1克大豆餅粕于37℃保溫2小時(shí)。如先前所描述的(25)，測定所釋放的無機(jī)磷。比較這三種酶的熱穩(wěn)定性。用pH5.5的0.2M檸檬酸鈉以1∶200稀釋所述酶中的每一種(2mg/ml)，且將其在25℃、37℃、55℃、65℃、80℃和100℃保溫20分鐘。把所述樣品放置在冰上達(dá)30分鐘，并在37℃測定剩余的肌醇六磷酸酶的活性。
所用的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) 將Mann-Withney U-檢驗(yàn)用于所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)(46)。實(shí)施例8細(xì)菌菌落的篩選和鑒定總共分離了93個(gè)菌落。超過70個(gè)的菌落具有低于500U/克蛋白的胞內(nèi)肌醇六磷酸酶活性；而6個(gè)菌落具有高于1,000U/克蛋白的活性。菌落88顯示了最高的肌醇六磷酸酶活性(2,927U/克蛋白)，且具有酸性磷酸酶活性(1,391U/克蛋白)。因此，挑選菌落88用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。用該菌落在Sweet E中產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性比在LB肉湯中產(chǎn)生的這兩種酶的活性相應(yīng)地大，且在無氧條件下產(chǎn)生的這兩種酶的活性比在有氧條件下產(chǎn)生的這兩種酶的活性相應(yīng)地大。隨后，將該菌落鑒定為一種革蘭氏陰性的大腸桿菌。尤其是，根據(jù)底物發(fā)酵分布型(profile)，進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)。實(shí)施例9豬大腸桿菌appA2基因的克隆和測序由菌落88的基因組DNA擴(kuò)增了一種1482bp(完整序列)的片段和一種1241bp(編碼區(qū))的片段(圖6)。除了大腸桿菌appA2基因和芽孢芽孢桿菌屬(Bacillus)肌醇六磷酸酶基因外，用BLAST程序在GenPro數(shù)據(jù)庫(版本61)、GeneBank或EMBL數(shù)據(jù)庫中沒發(fā)現(xiàn)顯著的序列同源性。所述的完整核苷酸序列與種名未定的芽孢桿菌DS 11的肌醇六磷酸酶基因(GeneBank的登記號(hào)為3150039)有著47％的同源性，且與大腸桿菌的appA有著95％的同源性。盡管有這樣高的核苷酸序列同源性，但在appA和appA2之間以及在其編碼的多肽之間，仍有著明顯差異。首先，在所推斷的肽序列中，七個(gè)氨基酸是不同的一個(gè)在信號(hào)肽中，即L4F；六個(gè)在編碼區(qū)中，即S102P、P195S、S197L、K202N、K298M和T299A。其次，位于該前導(dǎo)序列和編碼區(qū)之間的73bp的非翻譯區(qū)比appA的非翻譯區(qū)短6bp。然而，三個(gè)推定的N-糖基化位點(diǎn)仍定位于該編碼區(qū)的同樣的位置。將該DNA片段序列分析了5次，以證實(shí)這些差異。與phyA比較，appA2僅有19％的氨基酸序列同源性。已將該序列傳送到GeneBank數(shù)據(jù)庫，其登記號(hào)為250016。實(shí)施例10appA2在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)以不同的時(shí)間間隔分析了總共42個(gè)轉(zhuǎn)化子的肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性。在甲醇誘導(dǎo)三天后，13個(gè)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶活性為18-114U/毫升培養(yǎng)基；且產(chǎn)生7-42U/ml的酸性磷酸酶活性。同時(shí)，22個(gè)appA轉(zhuǎn)化子表達(dá)了25-130U/ml的肌醇六磷酸酶活性和59-85U/ml的酸性磷酸酶活性。將顯示出最高活性的appA2轉(zhuǎn)化子用于表達(dá)時(shí)程研究(圖7)及其它研究。該appA2 mRNA水平在4小時(shí)時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)(圖7和圖8)，且保持高水平到12小時(shí)為止，此后顯著下降。在對(duì)照細(xì)胞中沒有檢測到appA2 mRNA信號(hào)。在0至24小時(shí)之間，由所述轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的胞外肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性都明顯地增加。此后，所述酸性磷酸酶活性幾乎保持不變；而與較早階段時(shí)的肌醇六磷酸酶活性的增加相比，肌醇六磷酸酶活性隨著時(shí)間延長而增加得少得多。實(shí)施例11所純化酶的特性所純化的r-appA2酶、r-appA酶和r-phyA酶的肌醇六磷酸酶比活相應(yīng)各為28.9U/毫克蛋白、30.7U/毫克蛋白和19.8U/毫克蛋白。Km值和Vmax值(表1)表明，純化的r-appA2對(duì)肌醇六磷酸鈉顯示出的親合性高于對(duì)pNNP的親和性。當(dāng)將肌醇六磷酸鈉用作底物時(shí)，pH曲線在所述的三種酶之間有顯著性差異。表1在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的、純化的r-appA和r-appA2的動(dòng)力學(xué)參數(shù)r-appA r-appA2Km，mM肌醇六磷酸鈉 1.030.66p-NNP 2.261.43Vmax，μmol分鐘-1mg-1肌醇六磷酸鈉 89 117p-NNP 310 340對(duì)于r-appA2，最適pH在2.5和3.5之間；對(duì)于r-appA，最適pH為2.5；而對(duì)于r-phyA肌醇六磷酸酶，最適的pH為2.5和5.5(圖9)。然而，對(duì)于底物pNNP，兩種大腸桿菌酶顯示了同樣的最適pH(2.5)。另外，r-appA和r-appA2都有同樣的最適溫度(55℃)，該溫度比r-phyA的最適溫度微微地低些。這兩種酶也有非常類似的肌醇六磷酸酶的熱穩(wěn)定性；這種熱穩(wěn)定性在37℃至60℃之間則略高于r-phyA的肌醇六磷酸酶的熱穩(wěn)定性，而在65℃至100℃之間則低于r-phyA的肌醇六磷酸酶的熱穩(wěn)定性。在不同溫度處理后而保留的r-appA2的酸性磷酸酶活性在非變性凝膠中顯示為一條71kDa唯一條帶(
圖10)。在65℃或80℃時(shí)，則該活性大大地?fù)p失或完全喪失；但在100℃時(shí)，由于某種原因該活性得到部分恢復(fù)。當(dāng)把這三種純化的重組酶與大豆餅粕保溫時(shí)，r-appA2蛋白與所述的其它兩種酶相比，該r-appA2蛋白從肌醇六磷酸中釋放出明顯更多的磷(
圖11)。實(shí)施例12去糖基化對(duì)酶性質(zhì)的影響用β-巰基乙醇和Endo Hf處理所述的純化的三種酶后，使大于90％的這些酶對(duì)肌醇六磷酸鈉和pNNP的活性都喪失了。但是，單獨(dú)的Endo Hf對(duì)這些酶的催化活性沒有顯著影響。r-appA2的去糖基化產(chǎn)生一條具有46.3kDa的表觀Mr的單一帶；該單一帶不同于三條已分辨的、糖基化形式的帶，所述糖基化形式的三條帶具有50.5kDa、53kDa以及56kDa的表觀Mr。這表示出了r-appA2的糖基化范圍在8.3％至17.3％之間。
在上述的實(shí)施例中，從所述豬結(jié)腸內(nèi)含物中分離出一株產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的大腸桿菌菌株。運(yùn)用基于Dassa等描述的大腸桿菌pH2.5酸性磷酸酶基因(appA)(18)的引物，從該菌株的基因組DNA中擴(kuò)增了一種1487bp的DNA片段。這種被命名為appA2的片段編碼一種具有三個(gè)推定的N-糖基化位點(diǎn)的433個(gè)氨基酸的蛋白。這種推斷的肽既包含N-末端基序(RHGXRXP，位置38-44)(SEQ.ID No.7)，又包含C-末端基序(HD，位置325-326)；所述基序?yàn)榻M氨酸酸性磷酸酶的特征(8)。另外，有一個(gè)30個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列和一個(gè)73bp的非翻譯區(qū)。在可用的序列數(shù)據(jù)庫之中，只有大腸桿菌appA pH2.5酸性磷酸酶基因和種名未定的芽孢桿菌DS11肌醇六磷酸酶基因與appA2享有某些同源性(在核苷酸序列方面相應(yīng)地分別為95％和47％的同源性)。盡管appA和appA2之間有高度同源性，但在這兩種基因之間、以及在其各自的蛋白之間，仍有著明顯的差異。首先，在所述兩種推斷的多肽序列之間，有七個(gè)氨基酸不同一個(gè)在信號(hào)肽內(nèi)，且六個(gè)在編碼區(qū)中。其次，在該前導(dǎo)序列和編碼區(qū)之間的73bp的非翻譯區(qū)比appA的非翻譯區(qū)短6bp。通過5次重復(fù)的核苷酸序列分析，證實(shí)了所有的那些差異。
更為重要的是，當(dāng)將這兩種基因轉(zhuǎn)化到同一宿主巴斯德畢赤酵母中時(shí)，所表達(dá)的蛋白r-appA和r-appA2表現(xiàn)出不同的生化特性。雖然兩種蛋白對(duì)pNNP顯示出同樣的、pH為2.5的最適pH，但對(duì)于肌醇六磷酸鈉，r-appA2有寬廣的2.5-3.5的最適pH，而r-appA的最適pH在2.5。與r-appA相比，r-appA2對(duì)兩種底物都有較高的親合性，正如由較低的Km值和較高的Vmax值所表明的；而且在體外，該r-appA2從大豆餅粕里的肌醇六磷酸中釋放出更多的磷。因此，對(duì)于從肌醇六磷酸或磷酸中水解磷，r-appA2的催化功能似乎是比r-appA的催化功能更好的。顯而易見，所述多肽中的六個(gè)氨基酸的調(diào)換也許不僅僅是所述酶的多態(tài)性，而是造成所觀察到的動(dòng)力學(xué)差異的原因。因此，確定appA2是一種不同于appA的基因似乎是合情合理的；盡管需要更確定的結(jié)構(gòu)分析來闡明特定的氨基酸調(diào)換與這兩種酶的功能改變之間的關(guān)系。為了將來的結(jié)構(gòu)研究，有必要首先制備兩種酶的晶體(27)。
先前，已經(jīng)報(bào)道了幾種水解pNNP或肌醇六磷酸鈉的大腸桿菌酶(18、19、39-41)。Greiner等(39)描述了兩種大腸桿菌肌醇六磷酸酶(P1和P2)的特征。他們發(fā)現(xiàn)純化的大腸桿菌肌醇六磷酸酶P2在N-末端序列、化學(xué)性質(zhì)和動(dòng)力學(xué)方面與大腸桿菌pH2.5酸性磷酸酶享有著很大的一致性。因此，他們提出這兩種酶可能是同一種蛋白，且大腸桿菌pH2.5酸性磷酸酶更應(yīng)該被認(rèn)為是一種肌醇六磷酸酶。實(shí)際上，r-appA酸性磷酸酶和r-appA2兩者不僅都能水解純的化學(xué)形式的肌醇六磷酸或天然食物中的肌醇六磷酸，而且都對(duì)肌醇六磷酸鈉比對(duì)pNNP具有更高的親合性。因此，可將這兩種酶分類為肌醇六磷酸酶類。
和純化的肌醇六磷酸酶P2(39)相比，r-appA2具有同樣的最適溫度(55℃)和去糖基化后的相同分子量(46.3kDa)。根據(jù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和非變性凝膠電泳分析，該蛋白也是單體的。然而，r-appA2具有更酸的最適pH(pH2.5-3.5對(duì)P2的pH4.5)，且因?yàn)樵诋叧嘟湍笇僦械腘-糖基化而含有8％至14％的糖部分。用Endo Hf將r-appA2去糖基化，減小所述分子的大小，但對(duì)r-appA2的活性影響極微。比較起來，如果把該酶蛋白與β-巰基乙醇和Endo Hf一起保溫，則大大地降低r-appA2的肌醇六磷酸酶活性和酸性磷酸酶活性。這表明正如先前關(guān)于無花果曲霉(A.ficuum)的肌醇六磷酸酶而指出的(47)，二硫鍵是r-appA2的肌醇六磷酸酶活性所需的。
雖然在本文中已詳細(xì)地描繪和描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但對(duì)于有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，顯而易見的是可以在不離開本發(fā)明精神的情況下進(jìn)行各種各樣的修飾、添加、取代等等，因此認(rèn)為這些修飾、添加、取代等等在以下所附的權(quán)利要求書中限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
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序列表<110>Cornell Research Foundation，Inc.<120>具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶<130>19603/2793<140><141><150>60/127,032<151>1999-03-31<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>433<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220><221>未確定<222>(433)<223>該序列中位置433的Xaa是未知的<400>1Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr1 5 10 15Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser20 25 30Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr35 40 45Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val50 55 60Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu65 70 75 80Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys85 90 95Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp100 105 110Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro115 120 125Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp130 135 140Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala145 150 155 160Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp165 170 175Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu180 185 190Asn Phe Ser Gln Leu Asn Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu195 200 205Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala210 215 220Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr225 230 235 240Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp245 250 255Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His260 265 270Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser275 280 285Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His290 295 300Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu305 310 315 320Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu325 330 335Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly340 345 350Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
355 360 365Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp370 375 380Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr385 390 395 400Leu Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala405 410 415Gly Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu420 425 430Xaa<210>2<211>21<212>DNA<213>大腸桿菌<400>2ggaattccag agtgagccgg a 21<210>3<211>22<212>DNA<213>大腸桿菌<400>3ggggtacctt acaaactgca cg22<210>4<211>22<212>DNA<213>大腸桿菌<400>4taaggagcag aaacaatgtg gt22<210>5<211>21<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5ggaattccag agtgagccgg a 21<210>6<211>22<212>DNA<213>大腸桿菌<400>6ggggtacctt acaaactgca cg22<210>7<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述N-末端基序<400>7Arg His Gly Xaa Arg Xaa Pro1 5<210>8<211>30<212>PRT<213>大腸桿菌<400>8Met Trp Tyr Phe Leu Trp Phe Val Gly Ile Leu Leu Met Cys Ser Leu1 5 10 15Ser Thr Leu Val Leu Val Trp Leu Asp Pro Arg Leu Lys Ser20 25 30<210>9<211>1489<212>DNA<213>大腸桿菌<400>9taaggagcag aaacaatgtg gtatttcctt tggttcgtcg gcattttgtt gatgtgttcg 60ctctccaccc ttgtgttggt atggctggac ccgcgattga aaagttaacg aacgtaagcc 120tgatccggcg cattagcgtc gatcaggcaa taatatcgga tatcaaagcg gaaacatatc 180gatgaaagcg atcttaatcc catttttatc tcttttgatt ccgttaaccc cgcaatctgc 240attcgctcag agtgagccgg agctgaagct ggaaagtgtg gtgattgtca gccgtcatgg 300tgtgcgtgcc ccaaccaagg ccacgcaact gatgcaggat gtcaccccag acgcatggcc 360aacctggccg gtaaaactgg gttggctgac accacgcggt ggtgagctaa tcgcctatct 420cggacattac caacgccagc gtctggtggc cgacggattg ctggcgaaaa agggctgccc 480gcagcctggt caggtcgcga ttattgctga tgtcgacgag cgtacccgta aaacaggcga 540agccttcgcc gccgggctgg cacctgactg tgcaataacc gtacataccc aggcagatac 600gtccagtccc gatccgttat ttaatcctct aaaaactggc gtttgccaac tggataacgc 660gaacgtgact gacgcgatcc tcagcagggc aggagggtca attgctgact ttaccgggca 720tcggcaaacg gcgtttcgcg aactggaacg ggtgcttaat ttttcccaat taaacttgtg 780ccttaaccgt gagaaacagg acgaaagctg ttcattaacg caggcattac catcggaact 840caaggtgagc gccgacaatg tttcattaac cggtgcggta agcctcgcat caatgctgac 900ggaaatattt ctcctgcaac aagcacaggg aatgccggag ccggggtggg gaaggatcac 960tgattcacac cagtggaaca ccttgctaag tttgcataac gcgcaatttt atttactaca 1020acgcacgcca gaggttgccc gcagtcgcgc caccccgtta ttggatttga tcatggcagc 1080gttgacgccc catccaccgc aaaaacaggc gtatggtgtg acattaccca cttcagtgct 1140gtttattgcc ggacacgata ctaatctggc aaatctcggc ggcgcactgg agctcaactg 1200gacgcttcca ggtcagccgg ataacacgcc gccaggtggt gaactggtgt ttgaacgctg 1260gcgtcggcta agcgataaca gccagtggat tcaggtttcg ctggtcttcc agactttaca 1320gcagatgcgt gataaaacgc cgctatcatt aaatacgccg cccggagagg tgaaactgac 1380cctggcagga tgtgaagagc gaaatgcgca gggcatgtgt tcgttggccg gttttacgca 1440aatcgtgaat gaagcgcgca taccggcgtg cagtttgtaa tggtacccc 1489
權(quán)利要求
1.一種具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段，所述磷酸酶片段包括通過用一種蛋白酶處理磷酸酶而產(chǎn)生的一種具有增加的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段。
2.權(quán)利要求1的磷酸酶片段，其中所述磷酸酶為一種微生物磷酸酶。
3.權(quán)利要求2的磷酸酶片段，其中所述微生物磷酸酶為一種大腸桿菌磷酸酶。
4.權(quán)利要求2的磷酸酶片段，其中所述微生物磷酸酶為AppA。
5.權(quán)利要求2的磷酸酶片段，其中所述微生物磷酸酶為AppA2。
6.權(quán)利要求1的磷酸酶片段，其中所述蛋白酶為胃蛋白酶。
7.權(quán)利要求1的磷酸酶片段，其中在酵母中表達(dá)所述的磷酸酶。
8.權(quán)利要求7的磷酸酶片段，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。
9.權(quán)利要求7的磷酸酶片段，其中所述酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
10.權(quán)利要求1的磷酸酶片段，其中由一種重組基因編碼所述的片段；該重組基因包括一個(gè)啟動(dòng)子；一個(gè)編碼權(quán)利要求1的磷酸酶片段的編碼區(qū)；以及一個(gè)終止子。
11.一種改良的動(dòng)物飼料，所述動(dòng)物飼料包含權(quán)利要求1的磷酸酶。
12.一種編碼具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段的重組基因，該重組基因包括一個(gè)啟動(dòng)子；一個(gè)編碼權(quán)利要求1的磷酸酶片段的編碼區(qū)；以及一個(gè)終止子。
13.一種載體，所述載體攜帶權(quán)利要求12之基因。
14.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求13之載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為酵母。
16.權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母。
17.權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述酵母為釀酒酵母。
18.增加磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的一種方法，該方法包括用一種蛋白酶處理該磷酸酶。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述磷酸酶為一種微生物磷酸酶。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述微生物磷酸酶為一種大腸桿菌磷酸酶。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述微生物磷酸酶為AppA。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述微生物磷酸酶為AppA2。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述蛋白酶為胃蛋白酶。
24.權(quán)利要求18的方法，其中在酵母中表達(dá)所述的磷酸酶。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述酵母為釀酒酵母。
27.一種具有改良的肌醇六酶活性的磷酸酶，該磷酸酶包括具有SEQ.ID No.1中所示氨基酸序列的一種多肽。
28.權(quán)利要求27的磷酸酶，其中在酵母中表達(dá)所述的磷酸酶。
29.權(quán)利要求28的磷酸酶，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母。
30.權(quán)利要求28的磷酸酶，其中所述酵母為釀酒酵母。
31.權(quán)利要求27的磷酸酶，其中由一種重組基因編碼所述的磷酸酶；該重組基因包括一個(gè)啟動(dòng)子；一個(gè)編碼權(quán)利要求27的磷酸酶的編碼區(qū)；以及一個(gè)終止子。
32.一種改良的動(dòng)物飼料，所述動(dòng)物飼料包含權(quán)利要求27的磷酸酶。
33.一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求27的磷酸酶。
34.一種載體，所述載體攜帶權(quán)利要求33的核酸分子。
35.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求34之載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
36.權(quán)利要求35的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞為酵母。
37.權(quán)利要求36的宿主細(xì)胞，其中所述酵母為巴斯德畢赤酵母。
38.權(quán)利要求37的宿主細(xì)胞，其中所述酵母為釀酒酵母。
全文摘要
本發(fā)明提供具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶。本發(fā)明提供具有改良的肌醇六磷酸酶活性之磷酸酶的蛋白酶解片段。也提供一種編碼具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶片段的重組基因。本發(fā)明也包括一種通過用蛋白酶處理磷酸酶而增加該磷酸酶的肌醇六磷酸酶活性的方法。另外，本發(fā)明提供一種具有改良性質(zhì)的磷酸酶AppA2。
文檔編號(hào)A23K1/18GK1413253SQ00808141
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2000年3月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者X·雷 申請(qǐng)人:康乃爾研究基金會(huì)有限公司